• 재료 및 방법
• 기능유전체 연구를 위한 벼 돌연변이 집단 양성
• 결과 및 고찰
• 벼 삽입변이체 표현형 분석
• 벼 유색미 변이체 발현 유전자 분석
• 돌연변이 집단 데이터 베이스 구축
• 사사

벼는 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나이며, 특히 아시아권에서 소비가 가장 많이 되고 활용도가 높은 작물이다. 현재는 벼가 가지고 있는 여러 가지 영양성분 및 식미로 인하여 세계적으로 소비가 증가되는 추세에 있다. 또한 유전체의 크기가 작은 장점으로 인하여 단자엽식물 최초로 염기서열 분석이 완료된 이후로 모델식물로의 역할을 충실히 해내고 있다(Jun et al., 2002, Feng et al., 2002). 우수한 작물을 개발하기 위해 유용한 유전자의 확보 및 분석이 필수적이며, 이러한 유전체 연구를 위한 기초 자료로서 유전자 지도의 작성 및 이를 근거로 한 양적형질 분석이 실시되고 있는 실정이다.

금후 post-genome 시대의 연구방향은 유전자 기능분석 연구에 집중되고 있다. 특히 동·식물 게놈상의 전체 유전자들에 대한 염기서열 분석을 통하여 동정된 유전자의 기능을 분석 할 수 있는 여러 방법과 기술이 개발되고 있다. 이들 유전자 기능 분석 방법 중 삽입돌연변이 통한 knock-out 변이체 연구와 DNA chip을 이용한 유전자 발현 profile 분석연구는 생물학적 기능파악을 위하여 매우 공통적이며 가장 강력한 도구중의 하나로 선택되고 있다. 본 연구는 전이인자 Ac/Ds를 이용하여 세계적인 경쟁력을 갖춘 삽입변이 집단을 구축하고 Ds 삽입에 대한 분자학적 정보를 획득하여 database 화에 이용하는 것을 목적으로 하였다. 또한 농업적 유용유전자들의 생물학적 기능을 구명하고 생명공학적 방법을 통하여 새로운 작물 창출에 활용하고자 한다. 본 연구를 통하여 얻을 수 있는 자료와 정보는 벼의 유전자 기능분석을 보다 효율적으로 실시하고 유용 유전자를 선발하여 육종에 이용함과 아울러 또한 이들의 지적 소유권 획득에 기초자료로 이용될 수 있을 것이다. 

재료 및 방법

기능유전체 연구를 위한 벼 돌연변이 집단 양성

식물의 유전체가 밝혀진 이후로 유전자의 정보를 근거로 한 reverse genetics에 의한 유전자의 분석이 활기를 띠게 되었는데(Parinov and Sundaresan, 2000) 애기장대의 경우 데이터베이스에서 이러한 정보를 쉽게 활용할 수 있게 되었다(http://signal.salk.edu/Source/AtTOME_Data_Source.html). 벼의 경우는 조직배양과정에서 retrotransposon이 유전체상에서 다양하게 다른 염색체 또는 다른 부위로 전이됨으로 새로운 변이를 만들 수 있다는 점을 이용하여 TOS-17 유래의 대규모 돌연변이 집단이 육성되었고(Hirochika et al., 1996, Hirochika 1997), 아그로박테리움을 이용하여 형질전환체를 육성하는 기술을 활용하여 T-DNA tagging 집단을 육성하게 되었는데 동진벼를 기반으로 하여 100,000계통의 삽입변이집단을 육성하였으며(Jeon et al., 2000, Jeong et al., 2002), Nipponbare를 기반으로 30,000여 계통을 육성하여(Wu et al., 2003) 벼의 기능유전체 연구에 활용하고 있는 실정이다. 또한 옥수수의 transposon을 이용하여 삽입변이집단을 양성하였는데 하나는 Ac/Ds(Chin et al., 1999, Upadhyaya et al., 2002, Greco et al., 2003, Kolesnik et al., 2004)를 이용하였고 다른 하나는 En/Spm-dSpm을 이용하여 삽입변이 집단을 육성하였으며 이들은 벼 염색체의 유전자부위에 70%가 삽입되었음이 보고되었다(Greco et al., 2004, Kumar et al., 2005). Frameshift에 의한 Ac/Ds 시스템은 새로운 돌연변이 육종체계에서 아주 중요한 방법이며 이들은 하나의 single tagged 유전자로부터 2차전이에 의한 새로운 유전자좌를 만드는데 아주 유용하게 활용될 수 있다. 대량의 Ds-tagging 집단은 전이를 유발하고 전이인자가 선발됨으로서 작성 될 수 있으며 이러한 일련의 일들은 전이인자를 갖는 계통과 해리인자를 갖는 계통의 교배를 통한 방법과 이들 계통의 종자유래 캘러스를 이용하여 형질전환을 시키는 방법으로 작성된다(Kim et al., 2004).

Ds 전이집단 대량육성은 ‘04~‘07년 3개년 동안 국립식량과 학원 기능성작물부 벼 육종포장에서 이루어졌으며, 기타 재배법은 벼 표준재배법에 준하였다. Ds 전이율 향상을 위해 Ac+ / Ds+를 가지는 F₂ 개체의 종자로부터 캘러스를 유도하여 재분화개체를 양성한 후 채종하였다 (Kim et al., 2004; Upadhyaya et al., 2002, Park et al., 2007). 식물체 재분화는 2,4-D, sucrose 등이 첨가된 N6 배지에서 30일간 캘러스를 유도한 후 NAA, Kinetin, Sucrose 등이 첨가된 배지에서 식물체를 재분화하였으며 순화과정을 거쳐 온실과 포장에서 재배한 후 채종하였다. 간장, 수장, 출수기와 같은 주요 생육특성은 농사시험연구조사기준(농촌진흥청 2003)에 따라 각 계통당 5~20개체를 조사하여 그 평균치를 구하여 통계분석에 이용하고 모품종의 신뢰한계(a=0.05)를 벗어나는 것을 변이체로 구분하였으며, 엽색, 임성, 초형 등과 같은 형태적 특성은 육안으로 관찰하였다. 채종된 종자는 일련번호를 부여하여 영남농업연구소 유전자원저장고(4)에 금후 분석을 위하여 보관하고 있다.

간장, 수장, 출수기와 같은 주요 생육특성은 농사시험연구조사기준(농촌진흥청 2003)에 따라 각 계통당 5~20 개체를 조사하여 그 평균치를 구하여 통계분석에 이용하고 모품종의 신뢰한계(a = 0.05)를 벗어나는 것을 변이체로 구분하였으며, 엽색, 임성, 초형 등과 같은 형태적 특성은 육안으로 관찰하였다. 

Ds의 삽입위치에 대한 분석은 Ds 양쪽말단 염기서열을 표식으로 PCR법으로 클로닝하였다. Ds FST sequncing 결과는 GRAMENE (http://www.gramene.org/Multi/blastview), NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 등으로 상동성을 비교하였다. PCR 클로닝에 사용한 프라이머 염기서열은 Table 1과 같다. 

Table 1. Primer sequence used in cloning of Ds flanking sequence.

결과 및 고찰

벼 삽입변이체 표현형 분석

벼에서 삽입돌연변이체를 이용한 유전자 동정은 Tos17 유래 집단을 활용하여 처음으로 이루어졌는데, 전향유전학적인 방법을 통하여는 수발아 유전자(Agrawal et al., 2001) 그리고 후향유전학적인 방법을 통하여는 phytochrome A 유전자(Takano et al., 2001)를 동정하였다. T-DNA를 이용한 유전자의 기능분석으로는 전향유전학적인 방법을 통하여 엽록체 이상 변이와 관련이 있는 유전자(Jung et al., 2003)를, 후향유전학적인 방법으로 PCR을 기반으로 하여 MADS-box 유전자선별을 통한 유전자 기능분석(Lee et al., 2003)을 실시하였으며 또한 expression-based GT screen을 통한 방법으로 벼의 심백돌연변이관련 유전자의 기능을 분석하였다(Kang et al., 2005).

Ds 삽입변이 집단을 이용한 벼의 유전자 동정 및 기능분석은 벼의 이삭 및 화기구조에 결함이 있는 branched floretless 1(bfl1)를 삽입변이 집단에서 찾아 이들이 벼의 7번 염색체에 위치하며 이들이 이전에 보고된 frizzy panicle 유전자좌일 것이라는 것을 보고(Zhu et al., 2003)하였고 또 벼의 dwarf Ds 삽입변이체를 찾아 이들의 FST를 분석한 결과 4번 염색체에 위치한 GA 생합성 경로의 2차 단계에 있는 ent-kaurene synthase(KS) 유전자임을 확인하고 OsKS1은 발아와 뿌리 생장과는 관련이 없음을 보고하면서(Margis-Pinheiro et al., 2005) 시작되었다.

한국에서도 작물유전체사업을 통하여 115,000점의 Ds 삽입변이집단이 Ac/Ds gene trap system을 이용하여 육성되었으며, 30,000개의 Ds계통 중 1,424개의 돌연변이가 분류되어 분석되었다(Fig. 1, Table 2). FST 분석을 통하여 Ds의 삽입위치를 분석한 결과 전염색체에 걸쳐 Ds가 전이되었지만 3번 염색체에 Ds를 갖고 있는 starter line(Ds3, Ds43)으로 사용하였기에 주로 3번염색체로 전이되고 이웃한 1번과 4번 염색체에도 다른 염색체에 비해 많은 비율로 Ds가 전이되었음을 확인 하였다(Fig. 2, Table 3).

Fig. 1. Characteristics of different mutants from the population. (a) albino, (b) stripe, (c) spotted leaf, (d) chlorina, (e) lazy f: purple leaf, (g) purple leaf margin, (h) zebra, (i) yellow spl.

Table 2. Large-scale agricultural characterization of mutant pool.

Fig. 2. The number of Ds insertions on each of the 12 chromosomes from the 6,026 Ds elements.

Table 3. The rank of redundunt gene from FSTs.

T1 진전에 의한 대량 고정종자 생산 확보를 위해 Largescale screening 활용하고 발아 활력 유지를 위해 종자를 장기 보존항였다. 그 결과 Ds Knockout 육종소재의 안정적 재료 공급 체계 확립하였는데 종자 증식용 파종상의 규격화를 통한 대량 증식 방법 확립였고 증식계통의 목적에 맞는 재배 방법 채택을 통한 편의성을 증진하였다.

분자육종소재은행 구축을 위한 농과원의 최종 목표는 48,000계통으로 2010년 포장에서 15,000계통(Japonica Ds86,101 - Ds101,100)을 전개하여 T1 세대 종자를 계통당 6-8립을 파종하여 계통별 번호 표시하여 벼 표준 재배법으로 GMO 격리포장에서 1본씩 이앙하여 재배하였다. 변이체 선발은 각 생육시기별로 변이체의 특성을 검정하고 변이체를 선발하여 2 set로 나누어 식량원 및 유전자원센터에 중복보존 하였다. 그 결과 현 보존 자원에서 오래된 종자부터 2/3 종자 갱신하여 고정화를 하고 중복보존을 실시하였다. 이 재료들은 농과원 수행과제 및 국내 타 과제 수행 연구진에게 재료 제공하여 기능연구에 활용토록 하였다.

변이체의 선발은 각 생육 시기별 변이체 특성검정 및 선발하였으며 2008년도에는 변이율이 5.15%를 보였으나 2009년에는 4.34%로 낮았으며 평균 4.75%의 변이율을 나타냈다. 2010년 증식계통은 생육이 불량하여 표현형 조사는 불가하여 바로 이앙하여 증식하였다. 특히 spotted leaf(spl)의 형태를 나타내는 변이형이 우점하였다. 유묘기의 Ds 증식 집단에서의 표현형 변이는 주로 엽록소 이상을 보이는 변이체가 많이 관찰되었다.

생육초기에는 주로 엽록소 변이를 나타내는 계통들이 많았으며 잎에 녹색이 없는 백색체(albino)의 경우는 유묘기가 지나면서 고사하여 엽록체가 식물의 생장에 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. 

이앙후 본격적으로 생육이 시작되면서 생육상의 변화를 보이는 변이체들이 나타나기 시작하였으며 왜성변이체(dwf)도 잎의 길이나 폭에서 다양한 형태를 나타내며 초장이 커지지 않는 형태의 변이계통 들이 다수 나타났다(Fig. 1). 자색을 띠는 변이체도 다수 존재하는데 이들은 계통에 따라 잎의 끝, 기부, 엽이 등 여러 가지 기관에서 색깔의 변이를 보였다(Fig. 1). 잎에 반점이 생기면서 병징을 나타내는 듯한 변이체도 나타났는데 이들의 반점의 패턴은 계통에 따라 약 5-6가지 정도의 분포를 보였다(Fig. 1).

벼 유색미 변이체 발현 유전자 분석

최근에 웰빙식품으로 각광받고 있는 흑미의 항산화물질에 대한 유전자 기능을 규명하고자 전이인자인 Ac/Ds를 이용하여 삽입변이집단 115,000계통을 육성하고, 그중에서 유색미 특성을 나타낸 21계통을 1차 선발하였다. 선발계통 중에서 흑미의 안토시아닌 발현이 나타난 5계통(Ds52306, Ds90941, Ds92102, Ds92537, Ds92778)을 2차 선발하고, 선발된 5계통은 시기별로 대조 품종인 동진벼와 마이크로어레이 발현유전자 비교분석을 통하여 안토시아닌 생합성 유전자의 기능 및 대사경로를 분석하였다.

흑미 5계통중 삽입염기서열(FST) 분석결과 Ds52306, Ds92537은 염색체 7번과 9번의 위치에 전이인자가 삽입되었으나 3계통은 전이인자 삽입이 확인되지 않았다(Fig. 3). 동진벼와 선발된 흑미변이체 2계통의 135 K 벼 마이크로어레이 분석을 통하여 시기별로 발현 양상이 다른 2,451개의 유전자를 분석하였다. 유의한 2,451개의 발현 유전자 특성 분류를 위하여 COGs (Cluster of Orthologous Group)와 GO (Gene Ontology) 분석을 실시하고 672개의 안토시아닌 관련 1차 후보 유전자를 선발하였다. 선발된 672개의 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 전사인자를 초기하공간분포분석기법으로 분석하고 12개 그룹에서 82개의 안토시아닌 생합성 관련 2차 후보 유전자를 선발하였다. 선발된 82개의 안토시아닌 생합성 기작 후보 유전자 중 RiceDB 검색으로 기능을 모르는 12종의 Unknown 유전자를 최종 선발하였다(Table. 4).

Fig. 3. Selection of brown rice from mutant pool.

Table 4. COGs analysis of the gene with different expression level through microarray.

향후에 흑미 5계통중에서 선발된 7개의 Up-regulation 유전자와 2개의 Down-regulation 된 유전자를 이용하여 흑미 기능성 형질전환체를 육성하고 안토시아닌 생합성 기작에 연관된 새로운 유전자의 동정을 통한 항산화 기능성 벼 작물을 개발하는데 활용코자 한다.

기능유전체 분석용으로 육성된 돌연변이 집단들은 조직배양을 거치면서 벼 게놈 내에 존재하는 수많은 transposon이 임의로 다른 염색체에 전이되면서 원치 않는 변이를 재생산 하게 되는데 이러한 기대하지 않은 변이는 형태적인 표현형변이와의 연관 비율을 낮추어 유전자 기능연구에 장애가 되고 있다. 상대적으로 Ds 삽입변이집단은 전이인자의 원치 않는 돌연변이 비율이 낮아 유전분석 및 유전자의 복수 돌연변이의 활용이 가능하여 전향유전적인 방법을 활용하는 환경 및 병해에 대한 선별이 가능하고 모본의 표현형을 회복하는 방법을 통해 유전자-표현형간의 관계를 밝히는데 유용한 재료로 사용된다(Zhu et al., 2007).

돌연변이 집단 데이터 베이스 구축

Ds 삽입변이체의 FST정보를 이용하여 유전자를 분석하고 이들 유전자의 기능 확인을 쉽게하기 위하여 여러개의 데이터베이스가 존재한다. 이들 데이터베이스는 기본적으로 FST 정보를 제공하고 있으며 표현형 정보도 제공하여 향후 phenome연구의 기반을 제공하려 한다. 호주의 CSIRO에서 운영하는 Rice Functional Genomics Project(RFGP)에서는 tagged gene 정보를 제공하고 있으며(http://www.pi.csiro.au/fgrttpub), Eu의 EU-OSTID에서 운영하는 OryGenesDB는 Ds 삽입변이체 뿐만 아니라 TDNA의 FST 정보를 제공하고 있으며(http://orygenesdb.cirad,fr/), UC Davis의 Sudaresan 그룹도 웹페이지에 벼 및 애기장대의 기능유전체에 대하여 대략적인 소개 및 링크를 통하여 성과 및 정보를 공유하고 있다(http://www-plb.ucdavis.edu/Labs/sundar). 한국에서는 115,000개의 양성된 Ds 삽입변이체의 정보를 분석하여 이들의 특성을 제공하고 있는데(Fig. 4), 여기에는 분석된 FST정보, 표현형 정보, 서던분석 자료, GUS 정보 등이 포함된다(KRDD, http://www.niab.go.kr/RDS/).

Fig. 4. Public Database related to Ds insertional mutants.

사사

이 연구는 농촌진흥청 어젠다 2-7-11(과제번호:PJ006108) “벼 변이집단 및 생물정보를 이용한 유용농업형질 유전자 탐색” 과제의 지원에 의해 수행되었다.