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• 재료 및 방법
• 최적 pH 수준 구명
• 최적 탄소원 선발
• Sucrose 적정농도 선발
• 무기염류 최적농도 구명
• 식물생장조절물질 최적농도 규명
• 결과 및 고찰
• 형질전환 모상근 대량생산에 적정한 pH 선별
• 형질전환 모상근 대량생산에 적합한 탄소원 선별
• Sucrose 적정 농도 선별
• 무기염 최적농도와 단백질 농도 확인
• 옥신의 최적농도 확인
• 사 사

분자농업(molecular farming)은 biofarming, molecular pharming, phytomanufacturing 등의 용어로 사용되고 있다. 현재대학교, 벤처기업, 연구소등 120여개의 연구집단들이 분자농업에 대해 연구활동을 전개하고 있다(Basaran & Rodriguez- Cerezo, 2008). 이러한 연구집단의 대부분은 거의 절반은 북미에서 행해지고 1/3정도는 유럽에서 진행중에 있다. 또한 현재 시장에 진입한 식물 유래 의약품은 없으나 18개의 의약품이 임상실험을 진행 중에 있다. 주된 연구 주제는 크게 4가지로; 식물유래 항체생산, 식물유래 인축의 면역치료를 위한 백신생산, 기능성 단백질 생산, 산업용 효소 생산 등이 있다(Barta et al., 1986; Horn et al., 2004; Pujol et al., 2005; Webster et al., 2006). 이러한 식물시스템을 활용한 의료용 단백질들을 생산하는 기술이 미래형 기술로 연구되고 있는 중요한 점은, 인체에 감염할 수 있는 병원원에 대한 오염이 없으며, 프리온과 내독소 물질이 존재하지 않으며, 다른 발현 시스템에 비해서 별도의 시설투자비 또는 개발비가 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 그러나 식물을 활용한 의료용 단백질 생산에 있어 지적되고 있는 환경유해성과 식품 안전성문제, 대중적 이해도와 수용력의 장벽 문제 등은 해결되어야할 문제점으로 생각된다(Streatfield, 2005). 이러한 문제점의 부분적 극복의 결과로 현재 진단과 시약용으로의 제한된 시장에 12개의 관련 제품들이 시판 중에 있으며 앞으로 의약품 관련한 단백질 및 펩타이드가 임상 실험을 마치게 되면 보다 대중들에게 가까이 다가갈 것으로 생각된다.

인체 조직형 플라스미노겐 활성화인자[Human tissue-type plasminogen activator(t-PA)]는 혈전(thrombus)내에 존재하는 피브린 클랏(fibrin clot)을 제거하는 역할을 보조하는 효소로 urokinase나 streptokinase에 비해 출혈 등의 부작용이 적은 혈전용해제로 효과가 입증되었다(Collen et al., 1986). t-PA가 혈전 내에 존재하는 피브린 클랏을 직접 제거하는 플라스민을 활성화시킬 수 있는 것은 t-PA내에 존재하는 프로테아제 domain이 역할을 수행한다(Pennica et al., 1983; van Zonneveld et al., 1986). 이러한 t-PA를 뇌졸중, 심근경색과 폐색전증의 치료제로서 사용하기 위해 다량의 재조합 단백질이 필요하게 되었고, 다양한 발현시스템[Escherichia coli(Kim et al., 2005), mammalian CHO cells(Cartwright, 1992), yeast(Keivan, 2010), Leishmania tarentolae(Nazari and Davoudi 2011)]이 개발되었다. 또한 최근에 여러 식물을 이용하여 t-PA를 생산하기 위한 연구도 보고되었다(Hahn et al., 2009; Sim et al., 2009). 현재 국내에 수입되는 t-PA는 최근 10년간 1,679억 달러의 수입이 있었으며 2010년 한해만 16억 달러를 수입하였다. 이러한 고부가가치의 혈전용해제 단백질을 생산하기위해서 본 연구에서는 식물시스템을 활용하여 t-PA를 대량생산하고자 하였으며 개발된 참외 모상근의 대량생산 최적조건을 확립하고자 하였다.

본 연구 결과에서는 재조합 t-PA를 발현하는 참외 모상근의 대량생산을 위하여 배지, 탄소원, pH, 무기염류의 농도와 식물생장조절물질 농도에 따른 참외모상근의 성장 및 t-PA 발현양을 측정하여 최적의 조건을 증명하였다. 본 연구 결과를 통하여 혈전용해제를 생산하는 참외 모상근을 대량 증식할 수 있는 기술을 개발했으며 식물시스템을 이용해서도 의약품 제조 및 품질 관리 기준에 적합한 의약품을 생산할 수 있는 기술이 가능하다는 것을 제시하고 있다. 

재료 및 방법

최적 pH 수준 구명

형질전환에 의해 유도된 모상근 중 단백질 함량과 t-PA 발현이 가장 높은 t-PA-26 라인(Kim et al., 2012)을 가지고 모상근 대량생산에 적합한 pH 수준를 구명하기 위하여 pH 수준을 5.0, 5.8, 7.0, 8.0으로 구분하여 18L 생물반응기를 이용하여 각 처리별 MS배지 11 L를 조제하여 모상근 40 g를 접종하여 25˚C 약 광하에서 14일 배양 후 수량을 조사하였다. 수량조사는 각 처리별 생체중을 측정하였다. t-PA 함량은 Calbiochem사의 soluble t-PA ELISA kit를 이용하여 전체 수용성 단백질 mg당 t-PA함량을 분석하여 수량성 및 t-PA함량이 가장 높은 pH 를 선발하였다. 

최적 탄소원 선발

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 최적 탄소원 선발 (Takagi, et al., 2001)을 위하여 조직배양에서 탄소원으로 이용되는 sucrose, glucose, fructose를 대상으로 18 L 생물반응기를 이용하여 각 탄소원별 3%의 MS배지 11L를 조제하여 모상근 40 g를 접종하여 25˚C 약 광하에서 14일 배양 후 수량을 조사하였다. 수량조사는 각 처리별 생체중을 측정하였다. t-PA 함량은 Calbiochem사의 soluble t-PA ELISA kit를 이용하여 전체 수용성 단백질 당 t-PA함량을 분석하여 수량성 및 t-PA함량이 가장 높은 탄소원을 선발하였다.

Sucrose 적정농도 선발

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 최적 탄소원으로 선발된 sucrose 의 적정농도 구명을 위하여 MS배지에 sucrose 농도를 0%, 1%, 2%, 3%, 4%로 처리하고 18 L 생물반응기를 이용하여 각 처리별 배지 11 L를 조제하여 40 g를 접종하여 25˚C 약 광하에서 14일 배양 후 생체중을 조사하여 가장 수량이 가장 높은 농도를 선발하였다.

무기염류 최적농도 구명

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 적정 무기염류(KH₂PO₄, NH₄NO₃, KNO₃) 농도(Yun et al., 2001)는 MS배지의 농도를 기본으로 하여 각각의 농도를 KH₂PO₄(0-1.88mM), NH₄NO₃(0-30.92mM)와 KNO₃(0-28.18mM)로 처리하고 18L 생물반응기를 이용하여 각 처리별 MS배지 5 L를 조제하여 모상근 30 g를 접종하여 25˚C 약 광하에서 14일 배양 후 생체중 및 단백질 함량을 조사하여 적정 농도를 선발하였다.

식물생장조절물질 최적농도 규명

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 식물생장조절물질 NAA(1-Naphthaleneacetic acid) 및 IBA(Indole-3-butyric acid) 최적농도(Yoon et al., 2004)를 구명하기 위하여 각각의 농도를 0, 0.5, 1, 2, 3 mg/L로 처리하고 18 L 생물반응기를 이용하여 각 농도별 MS배지 11L를 조제하여 모상근 40 g를 접종하여 25˚C, 약 광하에서 14일 배양 후 수량을 조사하였다. 수량조사는 각 처리별 생체중을 측정하였다. t-PA 함량은 Calbiochem사의 soluble t-PA ELISA kit를 이용하여 전체 수용성 단백질 mg당 t-PA함량을 분석하여 수량성 및 t-PA함량이 가장 높은 농도를 선발하였다.

결과 및 고찰

형질전환 모상근 대량생산에 적정한 pH 선별

형질전환 모상근의 배지내 pH 변화에 따른 수량성을 알아보기 위해서 MS 배지를 기본 배지로 pH를 각각 5.0, 5.8, 7.0, 8.0로 조절하여 18 L 생물반응기에서 형질전환 모상근을 40 g 접종하고 14일간 배양한 후 수량성을 조사한 결과, pH수준에 따른 수량성은 pH 7.0이 618 g으로 통상적으로 사용되는 pH 5.8의 505 g보다 1.2배정도 높은 수량성을 보였다. 그러나 전체수용성 단백질내에 존재하는 t-PA함량은 564 ng/mg TSP(Total Soluble Protein)로 pH 8.0의 880 ng/mg TSP보다 낮은 발현양을 보였다(Table 1). 그러나 높은 t-PA 발현양을 보이는 pH 8.0로 조절된 배지는 쉽게 혼탁되었다. 이러한 연구결과는 모상근의 대량생산을 위해서 선발된 MS와 WPM 배지(Kim et al., 2012)의 최적 pH의 결정에 적용되었다. 따라서 적합한 pH는 7.0인 것으로 나타났다.

Table 1. Weight of transgenic hairy roots and t-PA yield under various pHs.

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 탄소원 선별

형질전환 모상근 배양에 탄소원으로 사용 가능한 세 가지의 당(sucrose, glucose, fructose)을 첨가한 배지에서 형질전환 모상근의 대량생산에 적합한 최적 탄소원 선발을 위해 각각 3%의 탄소원이 첨가된 MS배지 11L를 조제하여 모상근 40 g을 접종한 후 14일 배양하여 수량성과 t-PA 발현 함량을 조사하였다. 탄소원 별 수량성을 보면 sucrose가 669 g으로 수량이 가장 높은 반면 t-PA함량은 472 ng/mg TSP으로 가장 낮았다(Table 2). 그러나 fructose는 t-PA함량이 780ng/mg TSP으로 가장 높았으나 수량이 63 g으로 아주 적어 형질전환 모상근 대량생산 탄소원으로는 적합하지 않았다(Table 2). 또한 glucose도 t-PA함량이 sucrose보다 다소 높았으나 가격이 고가이므로 경제적으로 부적합하여 sucrose를 최적 탄소원으로 선발하여 적정농도 실험을 추진하였다.

Table 2. Effects of various carbon source on yield of transgenic hairy roota and t-PA levels.

Sucrose 적정 농도 선별

형질전환 모상근 대량생산에 적합한 최적 탄소원으로 선발된 sucrose 적정농도를 규명하기 위해서 sucrose 농도(0-4%)에 따라 모상근을 배양 후 수량성을 조사하였다. Sucrose 농도별 수량성을 보면 대조군(0%)에서는 거의 모상근이 자라지 않고 갈변하였으며 1%가 처리된 배지에서는 728g으로 가장 높은 수량성을 보였다(Fig. 1). 또한 2%와 3%로 처리된 배지에서는 각각 514 g과 610 g의 수량성을 보여 1%로 처리된 배지보다 각각 1.4배와 1.2배 정도 낮은 수량성을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 형질전환 모상근 대량생산을 위해서는 1% sucrose 농도가 최적임을 확인하였다.

Fig. 1. The selection of optimum sucrose concentration for the mass-production of transgenic hairy root using the bioreactor. Production of hairy roots in the bioreactor (18 L) after 14 days inoculated with 40 g of starter culture under various sucrose concentrations. Results are the average ±S.D. for at least three experiments.

무기염 최적농도와 단백질 농도 확인

무기염들의 농도가 형질전환 모상근의 수량성에 미치는 효과를 알아보기 위해서 세 가지 무기염(KH₂PO₄, NH₄NO₃, KNO₃)의 다른 농도를 함유하는 MS배지를 활용하여 수량성을 측정하였다. 또한 각 농도의 배지에서 성장한 모상근의 추출물의 총 단백질 함량을 측정하였다. 무기염 KH₂PO₄의 농도별 수량성을 보면 MS 배지와 같은 농도(0.94mM)에서 모상근 생산량이 303 g으로 가장 많았고, KH₂PO₄ 농도가 낮을수록 수량은 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2(a)). 무기염 KH₂PO₄가 없는 MS 배지에서는 형질전환 모상근의 성장이 13g으로 제일 낮게 나타났다. 또한 0.47 mM과 0.24 mM KH₂PO₄의 농도에서 각각 199 g과 143 g의 수량성을 보였으며, KH₂PO₄ 농도가 2배(1.88 mM)들어 있는 MS 배지에서는 285 g으로 MS 배지의 결과와 유사하였다(Fig. 2(a)). 또한 각각의 KH₂PO₄의 농도에 따라 모상근내에 존재하는 단백질 농도는 수량성의 결과와 유사하였다. 0.94 mM KH₂PO₄에서 4.29 mg/ml의 농도로 최고로 높았으며, 1.88 mM KH₂PO₄에서 2.65 mg/ml의 농도, 0.47 mM과 0.24 mM KH₂PO₄에서 3.38과 3.06 mg/ml의 농도를 나타내었다. KH₂PO₄를 함유하지 않는 MS 배지에서는 1.07 mg/ml로 가장 낮은 단백질 농도를 보였다. 무기염 NH₄NO₃의 농도별 수량성을 보면 3.87 mM에서 모상근 생산량이 345g으로 가장 많았고, NH₄NO₃ 농도가 높을수록 수량은 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2(b)).

Fig. 2. Effects of inorganic salt concentration on yield of transgenic hairy roots and total protein levels. Growth of hairy roots in the bioreactor (18 L) after 14 days inoculated with 40 g of starter culture under different (a) KH₂PO_4. (b) NH₄NO_3. (c) KNO_3.. Results are the average ±S.D. for at least three experiments. -□-, wet weight and -●-, amount of protein.

무기염 NH₄NO₃가 없는 MS 배지에서는 형질전환 모상근의 성장이 140 g으로 가장 낮게 나타났다. 또한 7.73mM, 15.46mM과 30.92mM NH₄NO₃의 농도에서 각각 319 g, 283 g과 255 g의 수량성을 보였다(Fig. 2(b)). 그러나 각각의 NH₄NO₃의 농도에 따라 모상근내에 존재하는 단백질 농도는 수량성의 결과와 일치하지 않았다. 30.92mM NH₄NO₃을 함유하는 MS배지에서 생산된 모상근으로부터 얻은 추출물에서 2.77 mg/ml으로 최고의 단백질 농도를 나타냈으며, NH₄NO₃의 3.87 mM, 7.73 mM, 15.46 mM과 30.92 mM 농도에서 2.10 mg/ml, 2.43 mg/ml과 2.48 mg/ml의 단백질 농도를 각각 나타내었다. NH₄NO₃를 함유하지 않는 MS 배지에서는 2.13 mg/ml로 수량성이 가장 높은 3.87 mM의 NH₄NO₃가 처리된 MS와 유사한 결과를 나타내었다.

무기염 KNO₃의 농도별 수량성을 보면 3.52 mM에서 모상근 생산량이 358 g으로 가장 많았고, KNO₃ 농도가 높을수록 수량은 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2(c)). 무기염 KNO₃가 없는 MS 배지에서는 형질전환 모상근의 성장이 240 g으로 제일 낮게 나타났다. 또한 7.05 mM, 14.09 mM과 28.18mM KNO₃의 농도에서 각각 321 g, 315 g과 310 g의 수량성을 보였다(Fig. 2(c)). 또한 각각의 KNO₃의 농도에 따라 모상근내에 존재하는 단백질 농도는 수량성의 결과와 유사하였다. 3.52 mM KNO₃을 함유하는 MS배지에서 생산된 모상근으로부터 얻은 추출물에서 2.58 mg/ml의 농도로 높았으며, 7.05 mM, 14.09 mM과 28.18 mM KNO₃의 농도에서 각각 2.26 mg/ml, 2.12 mg/ml, 2.21 mg/ml의 단백질 농도를 나타내었다. KNO₃를 함유하지 않는 MS 배지에서는 3.00 mg/ml로 수량성이 높은 3.52 mM의 KNO₃가 처리된 MS보다 높게 나타났다(Fig. 2(c)). 

옥신의 최적농도 확인

식물생장조절물질 NAA와 IBA가 형질전환 모상근의 성장에 미치는 효과를 알아보기 위해서 다양한 농도(0-3 mg/L)의 옥신이 들어 있는 MS 배지에서 수량성을 확인하였다. NAA(0-3 mg/L)를 처리한 결과는 무처리의 경우가 593 g으로 수량성이 가장 높았으며, 농도가 높아짐에 따라 수량성은 감소하였다. 0.5 mg/L의 경우 342 g, 1 mg/L 303 g, 2 mg/L 435 g, 3 mg/L 343 g으로 수량성이 무처리에 비해서 각각 1.7배, 2배, 1.4배, 1.7배 감소하였다(Table 3). 또한 옥신의 다른 한 종류인 IBA가 형질전환 모상근의 성장에 미치는 효과를 알아보기 위해서 다양한 농도(0-1mg/L)의 IBA가 들어 있는 MS 배지에서 수량성을 확인 하였다. 무처리의 경우가 402g으로 수량성이 가장 높았으며, 농도가 높아짐에 따라 수량성이 감소하는 경향을 보였다. 0.1 mg/L의 경우 348 g, 0.3 mg/L의 경우 384 g, 0.5mg/L의 경우 325 g, 1 mg/L의 경우 375 g으로 수량성이 무처리에 비해서 각각 1.2배, 1.1배, 1.2배, 1.1배 감소하였다. 또한 t-PA 발현 함량도 IBA의 농도가 높아짐에 따라 감소하는 경향을 보였다. 무처리시에 448 ng/mg TSP으로 가장 높았으며, 0.1mg/L의 경우 432 ng/mg TSP, 0.3mg/L 372 ng/mg TSP, 0.5mg/L 284 ng/mg TSP, 1mg/L 404 ng/mg TSP으로 수량성이 무처리에 비해서 각각 1.0배, 1.2배, 1.6배, 1.1배 감소하였다(Table 4). 이상의 식물호르몬 처리 결과로부터 형질전환 모상근 배양에는 식물성장조절제 NAA와 IBA의 처리가 필요 없을 것으로 판단되었다.

Table 3. Weight of transgenic hairy roots under different concentrations of NAA.

Table 4. Weight of transgenic hairy roots and t-PA levels under different IBA concentrations.

사 사

본 논문은 농촌진흥청 국립농업과학원 연구사업(과제번호: PJ006652)과 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(과제번호: PJ008086)의 지원에 의해 이루어진 것임. 또한 본 논문은 국립농업과학원의 2012 박사후 연구원 프로그램(헤마바티)에 의해서 지원되었습니다.