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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.24 No.3 pp.369-379
DOI :

자포니카 벼의 종자 저장단백질 유전자 구조 및 발현분석 연구 현황

윤웅한, 이정화, 이강섭, 김영미, 한장호, 지현소, 윤성원, 이종렬, 김태호
농촌진흥청 국립농업과학원

Current Status of Structural and Expression Analysis of Seed Storage Protein Genes in Japonica Rice

Ung-Han Yoon, Jeonghwa Lee, Gang-Seob Lee, Young-Mi Kim, Jang-Ho Hahn, Hyeon-So Ji, Sung-Won Yoon, Jong-Yeol Lee,Tae-Ho Kim
National Academy of Agricultural Science, RDA
Received Jun. 5, 2012 / Revised Jul. 23, 2012 / Accepted Sep. 7, 2012

Abstract

Based on the outcome of the rice genome sequencing, a lot of researches for identificationof genes underlying useful traits and their utilization are being carried out recently. Especially, rice seedstorage proteins are used as a main nutrition source for human while they are used as the nitrogensource for plant growth during seed germination. Rice seed storage proteins are divided by solubility insolvent into weak acid and alkali soluble glutelin, alcohol soluble prolamin, and salt soluble globulin. Therice genome contains 11 glutelin genes and 33 prolamin genes. In the case of prolamin genes, 15 genes arelocated in 15 Mb region on the chromosome 5. Clustering of seed storage protein genes on the same chromosomalregion indicates that they are evolved from the same chromosome or they share similar geneexpression regulatory region. Only single globulin gene existed on the chromosome 5. As a result of tissue-specific expression pattern analysis of seed storage protein genes using microarray, glutelin and mostof prolamin genes were expressed only in seed endosperm, while a few prolamin and the globulin genesare expressed in seed endosperm and germinating seed. As a result of isolating promoter regions of theseed storage protein genes and analyzing their expression pattern in seed, glutelin type C1 promotershowed expression in whole seed, and glutelin type B5 and α-globulin promoter showed strong expression.This paper reviewed on the structure and expression profile of rice seed storage protein genes, andwill provide information on the recent research status to the researchers who are studying on theimprovement of seed traits and production of substances.

24(3)-17.pdf1.96MB

화본과 작물인 벼는 세계인의 주요 식량자원으로 중요시되며 게놈 크기가 작고 농업형질유전자 분석 등의 유전학적 연구가 많이 이루어져 있어 작물유전체 연구재료로서 매우 중요시 되고 있다. 특히 화본과 작물은 인류의 식량원으로 중요시되며 최근 급격히 증가된 화본과 작물의 유전체 분석 결과를 바탕으로 종자형질에 관한 비교유전체 연구와 유전체진화에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다(Paterson et al., 2008). 벼, 밀, 옥수수 등 화본과 식물 종자의 주요 성분인 전분, 단백질, 지질 등은 종자 발달기의 배유에 저장되어 종자가 발아할 때에 식물생장을 위한 질소원으로 사용되어지며 또한 인류의 주요 영양원으로 사용되어 진다. 종자 저장단백질은 작물의 종류에 따라 함량이 다른데 콩과류의 종자 내 저장단백질 함량은 약 40%이며 화본과 작물 종자의 저장단백질 함량은 10~12%를 나타낸다(Shewry & Halford, 2002). 벼의 경우 종자 내 저장단백질 함량은 재배종 및 기후변화에 따라 다르지만 6~8%를 나타낸다(Matsuo et al,. 1995; Duan & Sun, 2005). 벼의 종자 저장단백질에 관한 연구는 향후 영양학적, 식미, 가공적성의 개선 등의 연구에 이용될 수 있다. 최근 일본 농업생물자 원연구소의 Takaiwa 박사 그룹에서는 당뇨병과 신장병 환자를 위하여 소화성의 glutelin 함량을 줄이고 난소화성의 prolamin 함량을 높인 벼를 개발하였다. 또한 벼의 단백질 함량은 낮춘 주조용 벼 개발과 식미를 증대시키기 위하여 저단백질 벼의 개발 등 기능성 벼 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 따라서 종자의 영양성 향상 및 고품질 벼 육성을 위한 실용화 연구를 위하여서는 품종, 재배조건 등에 따라 달리 나타나는 종자 저장단백질의 특성 및 유전자 발현분석 등의 연구가 필요하다.

벼 종자 저장단백질은 용매의 차이에 따른 용해도에 따라 약산성, 알카리 용해성의 glutelin과 염 용해성의 globulin 그리고 알코올 용해성의 prolamin으로 나눈다(Yamagata & Tanaka, 1986). 벼의 종자 저장단백질에 있어서 glutelin이 주요 저장단백질로 전체 양의 60-80%를 차지하며 20-40%는 prolamin과 globulin으로 구성되어 있다. 종자 배유에서 만들어진 glutelin과 prolamin은 단백질과립 중에 저장되는데 prolamin은 소포체유래 단백질과립-1에 glutelin과 globulin은 액포형 단백질과립-2에 각각 저장 된다(Tanaka et al., 1980).

식물 종자 저장단백질에 대한 연구는 1932년 콩과 작물의 종자에서 prolamin이 분리된 이후 이들 단백질분석에 관한 많은 연구들이 이루어졌다(Hassan & Basha, 1932). 벼 종자 저장단백질에 대한 연구에 있어서는 prolamin 유전자의 구조해석(Kim & Okita, 1988; Yamagata et al., 1992; Mitsukawaet al., 1999) 및 glutelin 유전자의 구조해석(Takaiwa et al.,1986; Okita et al., 1989; Takaiwa et al., 1996; Katsube-Tanaka et al., 2004)이 이루어 졌으며 벼 종자발현유전자 분석 및 유전체 해석을 통하여 prolamin과 glutelin 유전자는 각각 특정 염색체에서 다중 유전자군을 형성하고 있음을 알 수 있었다(Yoon et al., 2011, Yoon et al., 2012). 벼의 종자 저장단백질 합성은 prolamin의 경우 종자등숙 초기부터 합성되며 적은 수의 유전자는 발아종자에서도 발현을 나타내고 있었다. 이와 반면 glutelin은 종자등숙 중기부터 합성이 대량으로 이루어지며 미숙종자 및 완숙종자에서만 발현을 나타내었다 (Wakasa et al., 2009; Yoon et al., 2011). 이들 종자 특이적인 발현 양상을 이용하여 종자발현을 위한 벡터작성용 프로모터 개발 및 종자 저장단백질 발현조절 기작 연구에 이용하고 있다(Wu et al., 1998; Qu & Takaiwa, 2004; Qu et al., 2008; Liu et al., 2010). 최근 벼 종자 발달 시기에 발현하는 단백질을 분석한 결과 종자에서 4,172개의 단백질이 분석되었으며 종자발달 특이적인 484개의 단백질을 분리하였다(Lee & Koh, 2011).

본 리뷰는 현재까지 연구되어진 벼 종자 저장단백질의 구조 및 발현 특성분석 결과를 종합화하기 위하여 작성하였다. 이러한 종자 저장단백질 유전자의 발현 특성분석 결과들은 식물 전반의 종자 저장단백질 유전자 구조 및 기능을 연구하는 연구자들에게 보다 유익한 정보를 제공할 수 있을 것이며, 종자형질개선 등의 실용화 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대되어 진다. 특히 지구온난화에 따른 고온 등숙기의 벼 품질에 영향을 미치는 저장단백질의 생합성, 저장기구를 분자수준에서 이해하는데 많은 기여를 할 것으로 생각된다.

벼 유전체분석 연구 현황

벼 염색체염기서열완전해독연구를 위하여 일본, 미국을 주축으로 10개국이 참여한 International Rice Genome Sequencing
Project(IRGSP)가 1999년부터 시작되어 2004년 말 벼염색체염기서열완전해독 초안을 발표하였다. 2011년 10월에는 미국 미시간 대학의 Rice Genome Annotation Project(RGAP)팀과 일본 농업생물자원연구소의 Rice Annotation Project(RAP) 팀이 공동으로 그간 분석되어진 벼 염색체염기서열정보에 최근 활발히 연구가 이루어지고 있는 벼 재염기서열분석 정보를 첨가하여 벼 염색체염기서열정보 분석을 행하였다. 그 결과 373Mb의 벼 염색체 정보를 재분석하였으며 웹을 통하여 분석 결과를 공개하고 있다(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/, http://rice.plantbiology.msu.edu/). 벼의 유전자수를 분석한 결과 염색체상에는 38,917개의 유전자가 mapping되었으며 48,934개의 유전자 모델을 제시하였다 (Table 1). 최근 이들 염색체 염기서열해독 정보를 이용한 유용 형질 유전자 비교분석 및 분자마커 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Xu et al., 2011).

Table 1. Current status of rice psedomolecule, loci and gene models in release 7.

벼의 유전자 기능해석 및 비교유전체 연구를 위하여 완전장 발현유전자 분리와 유전자 발현영역 정보 분석 연구가 필요하
다. 현재까지 다양한 벼 품종에서 대량발현유전자 염기서열분석 및 완전장 유전자분리 연구가 수행되고 있다. 일본 농업생물자원연구소에서는 japonica 품종인 Nipponbare 벼 품종을 이용하여 대량발현유전자 염기서열분석 및 완전장 cDNA 분리에 관한 연구를 수행하여 3만2천개의 완전장 cDNA를 분리하였으며 KOME DB(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)를 통하여 발현유전자 정보를 공개하고 있다(Satoh et al., 2007). 아울러 중국에서는 indica 품종인 Guangluai 4와 Minghui 63을 이용하여 20,000여개의 완전장 cDNA를 분리하여 RICD DB(http://www.ncgr.ac/ricd)를 통해 정보를 공개하고 있다(Luetal.,2008). 국내의 경우 국립농업과학원에서 벼 종자 발달 단계 발현유전자 73,000개의 분석 및 벼 종자 발현유전자 데이터베이스(DB)를 구축하여 관련연구자들에게 정보를 제공하고 있다(Yoon et al., 2009). 2012년 4월까지 NCBI dbEST에 등록된 벼 발현유전자수는 1,252,989개이며 unigene으로는 44,005개의 유전자를 포함하고 있다. 이러한 벼 발현유전자 정보와 유전자들을 이용하여 농업형질 유전자의 대량기능분석 및 실용화 연구에 활용하고 있다(Nakamura et al., 2007; Jiang et al., 2012).

벼의 농업형질 유전자기능분석을 통한 실용화를 위하여 유전체 정보를 활용하는 것이 매우 중요하다. 벼 유전자의 대량 기능분석을 위하여 국립농업과학원에서는 115,000 계통의 Ds 삽입변이체 정보를 공개하고 있으며 일본 이화학연구소에서는 벼 유전자들을 애기장대에 형질전환하여 과발현체를 작성하고 표현형분석 등의 정보를 이용하여 RiceFOX DB(http://amber.gsc.riken.jp/ricefox/)를 작성하고 이들 정보를 공개하고 있다(Ichikawa et al., 2006). 식물의 전사체 발현분석 연구를 위하여서는 벼 44K 마이크로어레이를 이용한 RiceXPro DB(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)와 벼 마이크로어레이 DB(http://www.ricearray.org/index.shtml)를 통하여 발현분석 정보를 공개하고 있다(Jiang et al., 2012; Sato et al., 2011). 벼 유전체종합정보를 제공하는 DB로는 미국의 Salk 연구소의 RiceGene Expression DB(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)와 일본 농업생물자원연구소의 TOGO 브라우저(http://agri_trait.dna.affrc.go.jp/)가 있으며 이들 DB를 통하여 벼 유전체 정보 및 유전자 발현 정보를 공개하고 있다(Nagamura et al., 2011). 이러한 벼 유전체 종합 DB는 벼와 벼과 이외의 식물의 유전학 및 생리학 연구를 위한 연구자들에게 유용한 정보를 제공함으로써 유전자 기능분석 연구 활성화가 촉진될 것으로 전망된다.

종자 저장단백질관련 유전자 구조 및 발현특성분석 연구 현황

Glutelin 유전자의 구조 및 발현특성 분석

벼 종자 저장단백질은 종자발달시기에 합성되어 단백질 과립에 저장되는데 prolamin은 소포체에서 유래된 단백질과립-1에 저장되며 glutelin과 globulin은 액포형 단백질과립-2에 저장 된다(Tanaka et al., 1980). Glutelin은 단백질과립 소포체와는 다른 막계인 활면소포체 상에서 글루텔린 전전구체(preproglutelin)로 번역된 후, 활면소포체 내강으로 진입 할 때에 시그널펩티드가 제거되고 글루텔린전구체(proglutelin)가 된다. 이후 활면소포체로 부터 수송소포가 생겨 골지체로 글루텔린 전구체를 수송하고 다시 골지체 유래의 수송소포에 의해 단백질저장액포로 운반된다. 글루텔린 전구체는 단백질 저장액포 내부에서 효소에 의해 산성과 염기성 서브유닛으로 절단되어 각 서브유닛끼리 결합하여 고분자화 되어 단백질과립-II를 형성한다(Kim et al., 2011).

벼 염색체완전해독연구와 벼 종자 저장단백질 유전자 기능 분석 연구 등을 통하여 벼 glutelin 유전자의 구조 및 기능분석 연구가 많이 이루어졌다. Yoon et al.(2011)은 일품벼 33,201개의 종자발현유전자분석을 통하여 11개의 일품벼 종자발현 glutelin 완전장유전자들의 염기서열을 결정하고 GenBank에 등록 하였다(Table 2). 또한 일품벼 glutelin 유전자들의 게놈 구조분석을 위하여 미국 미시간대학교 벼 게놈 명명프로젝트 데이터베이스(RGAP DB, http:/rice.plantbiology.msu.edu/)의 Rice Pseudomolecule ver. 6.1과 FGENSH 프로그램을 이용하여 glutelin 유전자의 exon과 intron의 구조를 분석하였다. 그 결과 벼의 glutelin 유전자들은 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성되어 있었으며 intron 염기서열의 길이는 100 bp 내외의 비교적 짧은 염기서열로 구성되어 있었다. 이와 같은 glutelin 유전자의 구조적인 특징은 이들 유전자들이 벼 염색체내에서 진화적으로 복제되어 존재함을 의미한다.

Table 2. The list of glutelin genes in immature seeds. The Rice Annotation Project DB and Rice Pseudomolecule ver. 6.1 of Rice Genome Annotation ProjectDB are used in order to determine the location of rice glutelin genes on chromosomes (Yoon et al., 2011).

Rice Pseudomolecule ver. 6.1의 염기서열 정보를 이용하여 벼 glutelin 유전자들의 염색체 내에서의 위치를 결정한 결과 1번, 2번, 3번, 10번 염색체에 위치하고 있었다. 특히 5개의 glutelin 유전자들이 벼 2번 염색체 8.4Mb 부위에 위치하고 있었다(Table 2). 그리고 glu04-type B1(LOC_Os02g0249800, LOC_Os02g0249900) 유전자는 2번 염색체 8.46Mb 위치에서2개의 유전자가 4.5 kb 떨어진 위치에 역방향의 동일한 염기서열을 가진 복제된 형태로 위치하고 있었다. 이와 같은 결과는 prolamin 유전자들과 같이 glutelin 유전자들의 경우에도 진화학적으로 동일 염색체에서 유래를 하였거나 유전자발현의 효율성을 높이기 위한 유전자 조절 영역을 같이 공유하고 있음을 시사한다. 한편 종자 배유에서만 발현하는 종자 저장단백질의 경우 cis-element를 가지는데 AACA 모티프(AACAAACTCTATC), prolamin box (P box: AAAG), GCAA 모티프(GCAAAA-/ATGA) 그리고 GCN4(TGA(G/C)TCA 모티프를 가진다. Glutelin 유전자의 ATG 시작 코돈에서 5' 위쪽으로 200 bp 위치에 RISBZ1(Dof)과 RPBF(bZIP)와 결합하여 발현을 조절하는 GCN4-like 모티프를 가지는 것으로 알려져 있다(Kawakatsu et al., 2008).

벼 종자 발현유전자 정보분석 결과를 바탕으로 11개 glutelin 유전자들의 발현특성을 분석하였다(Table 2). 벼 미숙종자 33,201개 EST 중에서 9,376개의 glutelin 유전자 EST가 발현하여 약 28%의 발현양을 나타내었으며 발아종자에서는 발현이 없었다. Glutelin 유전자는 종자발달과정 중 미숙종자 시기에 발현하여 종자 배유에서만 단백질합성이 왕성하게 이루어지고 있음을 시사한다.

NCBI의 BLASTX 프로그램을 이용하여 종자발현유전자 중에서 가장 많은 발현을 나타내는 glutelin type B1(Os02g0249800)유전자의 상동성 분석을 행한 결과 Avena sativa의 12Sglobulins과는 63%의 상동성을 Actinidia Chinensis의 11Sglobulin과는 44%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 벼 glutelin 유전자와 globulin 유전자는 진화상의 밀접한 연관이 있음을 나타내고 있다. Yoon et al.(2011)은 glutelin 유전자들의 아미노산서열을 이용한 계통발생학적 분석을 통하여 Glu-typeA, Glu-typeB, Glu-typeC의 3개 그룹으로 나누었으며 Kawakatsu et al.(2008)은 Glu-typeA, Glu-typeB, Glu-typeC, Glu-typeD의 4개 그룹으로 나누었다.

종자의 단백질 함량은 미질과 영양분의 측면에서 매우 중요시 되며 종자 glutelin 유전자들의 구조 및 발현특성 분석 결과를 바탕으로 과발현체와 RNAi 기법을 이용한 종자 중의 단백질 함량을 조절하는 연구가 최근 많이 이루어지고 있다(Kimet al., 2011). 벼 glutelin 단백질은 종자 저장단백질의 60-80%를 차지하며 인류의 단백질 공급원으로 매우 중요한 역할을 한다. 그러나 벼 종자에는 lysine과 같은 아미노산 성분이 다른 곡류에 비해 상대적으로 낮은 함유량을 나타낸다. Lysine은 필수아미노산으로 인체에서는 합성이 이루어지지 않으며 효소와 호르몬의 필수성분으로 생장에 관여하는 것으로 알려져 있다. 식물에는 매우 낮은 양이 존재하여 쌀을 주식으로하는 아시아인에게 lysine 결핍이 되기 쉽다. 벼 미숙종자발현 11개 glutelin 유전자의 아미노산서열을 이용하여 각 단백질의 아미노산 함량을 검토한 결과 glutelin type A는 2.73-3.43%범위의 lysine 함량을 나타내었으며 glutelin type B는 3.17-4.51% 범위의 lysine 함량을 나타내었다(Yoon et al., 2011). 이와 같은 결과는 벼 종자 저장단백질 아미노산성분 중 lysine 함량을 증대시키기 위해서는 lysine 함량이 4.51%로 상대적으로 높은 glutelin type B7(Os02g0242600) 유전자를 이용한 과발현체를 만들면 벼 종자에서의 lysine 함량 증대가 가능할 것으로 생각된다.

최근 식물 기능유전체연구를 기반으로 식물의 조직특이 프로모터 분리 이용 등의 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 glutelin 유전자들의 프로모터는 식물 종자에 형질전환 하고자하는 목적의 유전자운반체 작성용 프로모터로 일반적으로 많이 사용되고 있다. Qu et al.(2008)은 벼 genomic DNA에서 PCR방법으로 6개의 glutelin 유전자 프로모터를 분리한 후 β-glucuronidase 발현분석으로 종자에서의 발현양상을 분석한 결과 glutelin type C1(Os02g0453600) 유전자의 프로모터가 종자에서 전체적으로 발현하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 그리고 glutelin type B5(Os02g0268100) 유전자의 프로모터가 종자에서 가장 많이 발현함을 알 수 있었다(Qu & Takaiwa,2004).

Fig 1. Histochemical analysis of GUS expression in maturing seed of transgenic rice directed by various rice glutelin gene promoters. GUS protein was detected by incubating hand-cut longitudinal sections of transgenic seeds in X-Gluc solution. al, aleurone; em, embryo; en, endosperm; sa, subaleurone (Qu et al., 2008).

최근에는 glutelin 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 bZIP, Dof, B3 등 전사조절인자 유전자의 기능분석 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이와 같이 벼 종자에서 가장 많이 함유된 glutelin 저장 단백질 합성 유전자 발현분석 연구는 종자형질 개선을 위한 중요한 정보를 제공한다.

Prolamin 유전자의 구조 및 발현특성 분석

벼의 저장단백질인 glutelin은 사람 위에서 소화되는 단백질이나 prolamin은 소화되기 어려운 난소화성 단백질이다(Tanakaet al., 1975). Prolamin 단백질의 합성 기구는 조면소포체 유래의 단백질과립 소포체에서 prolamin 전구체로써 번역되어단백질과립 소포체에 진입할 때 시그널펩티드가 제거되고 성숙된 prolamin이 되어 단백질과립을 형성한다(Takahashi etal., 2005).

벼 prolamin은 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동(SDSPAGE)에 의해 10, 13, 16kDa의 3개 group으로 나누어지며 13kDa prolamin이 주를 이룬다(Ogawa et al., 1987; Sha etal., 1996). 특히 단백질과립-1의 주요 구성단백질인 13kDaprolamin 유전자들의 염기서열구조는 높은 상동성을 가지고 있으며 단백질 성분 중에 cysteine 잔기는 prolamin polypeptide의 분자 간 결합에 관여한다. 또한 다른 곡물의 prolamin과 마찬가지로 벼의 prolamin은 많은 양의 glutamine과 적은 양의 lysine 과 histidine을 가진다 (Masumura et al., 1990). 따라서 벼 prolamin은 cysteine 함량에 따라 cysteine-rich 10kDa(CysR10), 13kDa(CysR13), 16kDa(CysR16)과 cysteinepoor 13kDa(CysP13)으로 나눈다(Nagamine et al., 2011). 벼에서는 Cys-R prolamin이 대부분을 차지하며 소포체내공에서 S-S 결합을 형성하며 응집하여 구상의 PB-1을 형성한다(Tanaka et al., 1980). 벼 prolamin 유전자의 coding region과 3’ noncoding region이 prolamin mRNA가 단백질과립 소포체에 존재하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Hamada et al., 2003).

Yoon et al.(2012)은 종자 저장단백질인 prolamin 발현 유전자의 구조분석을 위하여 일품벼 미숙종자 33,201개 EST와 발아종자 18,182개의 EST 분석을 통하여 51,383개의 EST를 얻었다. 이들 EST들의 염기서열에 대하여 NCBI의 BLASTN, BLASTX 프로그램(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 상동성 검사를 수행하였으며, 상동성 검사 결과 얻어진 유전자 정보를 바탕으로 각각의 prolamin 유전자들의 발현수를 분석하여 prolamin 유전자 21개를 분리하였다(Table 3). 그 외의 prolamin 유전자들의 발현을 분석하기 위하여 일본생물자원연구소의 KOME 데이터베이스(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)에서 prolamin 완전장유전자 검색을 통하여 일품벼에 포함되지 않은 4개의 prolamin 유전자를 분리 하였다(AK242177, AK242216, AK242595, AK242799). 또한 미국 미시간대학교 벼 게놈 명명프로젝트 데이터베이스(Rice Genome Annotation Project DB, http:/rice.plantbiology.msu.edu/)의 Rice Pseudomolecule ver. 6.1에서 prolamin 유전자 검색을 통하여 얻어진 5개 prolamin유전자 등 벼에서는 30개의 prolamin유전자를 분리하였다(Table 3). 이들 발현유전자 중에서 3개의 prolamin 유전자(GU120318, GQ848050, EF122445)는 염색체 상에서 중복으로 존재하여 전체적으로 벼 염색체 상에서 33개의 prolamin 유전자를 확인하였다. 이들 prolamin 유전자 중에서 28개의 유전자들은 미숙종자와 발아종자에서 발현을 나타내었으며 5개는 genome 상에는 존재하나 발현하는 유전자는 아직 보고되어지지 않았다. 벼 prolamin 유전자들은 intron이 없이 1개의 exon으로 구성되어 있었으며 53 아미노산에서 156 아미노산으로 구성되어 있었다. 이와 같은 구조는 종자 저장단백질인 α-globulin(Os05g41970)이 186개의 아미노산을 코딩하며 1개의 exon으로 구성된 것과 일치하는 경향을 나타내고 있다.

Table 3. Rice cv. Illpumbyeo prolamin genes (Yoon et al., 2012).

Prolamin 유전자의 벼 염색체 내 위치 결정을 위하여 Rice Pseudomolecule ver. 6.1의 게놈 염기서열정보를 이용하여 각각의 prolamin 유전자들의 염색체 위치를결정하였다. 그 결과 벼 prolamin 유전자들은 3번, 5번, 6번, 7번, 11번, 12번 염색체에 mapping 되었으며 특히 5번 염색체 15Mb 위치에14개의 prolamin 유전자가 위치하고 있었다(Table 3). 이들 중 prolamin 05(Os05g26359, Os05g26368)와 prolamin 06(Os05g26377, Os05g26386)의 경우 각각 2.2 kb와 2.1 kb 거리에 동일 염기서열로 유전자 복제가 있었다. 특히 prolamin 06과 99%의 상동성을 나타내는 prolamin 04(Os05g26350), prolamin 05(Os05g26359, Os05g26368), prolamin 07(Os05g26400) 유전자 등 6개의 유전자가 13 kb안에 위치하여 높은밀도의 유전자 복제를 나타내고 있었다. 또한 7번 염색체 6.6Mb 위치에 4개의 prolamin 유전자가 위치하고 있었다. 이와 같은 결과는 glutelin 유전자의 경우와 같이 prolamin 유전자도 진화학적으로 동일 염색체에서 유래를 하였거나 유전자 발현을 위한 조절 영역을 같이 공유하는 식물 종자 단백질 유전자의 특징으로 생각된다.

화본과 작물의 prolamin 유전자들의 구조분석 및 진화에 관한 많은 연구들이 이루어지고 있다(Shewry et al., 1990). Xuet al.(2009)은 옥수수의 주요 저장단백질인 prolamin 유전자와 벼, 수수 prolamin 유전자의 구조분석을 통하여 진화과정을 분석한 결과 α-globulin에서 고분자-prolamin으로 진화된 것으로 판단하였다. 또한 벼 prolamin 유전자들의 프로모터를 분석한 결과 5' non-coding 부위에 TGCAAA 배열과 GCN 모티프(ATGACTCAT)를 공통적으로 가지고 있었다.

벼 종자 저장단백질의 아미노산 함량은 종자의 영양성분으로 매우 중요한 역할을 하며 종자 저장단백질의 분자결합에 관여하는 것으로 알려져 있다(Tanaka et al., 1980). 33개의 벼 prolamin 유전자의 아미노산 조성분석을 행한 결과 cysteine이 2% 이상을 나타내는 prolamin이 14개였으며 cystein이 낮은 prolamin 이 18개 cysteine이 없는 prolamin이 1개(Os05g26720) 였다(Yoon et al., 2012). Cysteine이 높은 prolamin의 경우 methionine도 높은 경향을 나타내었으며 이들 cysteine rich 단백질은 단백질과립-1 구성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ogawa et al., 1987).

벼 prolamin 유전자의 발현 특성을 분석한 결과 미숙종자 및 발아종자의 EST에서 발현을 나타내며 전체 종자 내 발현양의 1.5%를 차지하였다. 또한 prolamin 유전자의 경우 미숙종자시기에 가장 많은 발현을 나타내었으며 종자발아 시기에도 발현을 나타내었다.

Yoon et al.(2012)은 벼 prolamin 유전자들의 조직 발현특성을 분석하기 위하여 Nimblegen rice 135K 마이크로어레이를 이용하여 조직부위별 발현을 검정하였다. 앞서 분석한 벼 33개 prolamin 유전자 중 Nimblegen rice 135K 마이크로어레이  중에는 13개의 prolamin 유전자가 array되어 있었다. 이들 prolamin 유전자 모두 출수 후 5일째부터 발현이 증가되었으며 출수 후 30일째 발현양이 최대가 되었다(Fig. 2). 이들 유전자 중 12개의 prolamin 유전자는 4°C 저장 종자와 종자 발아시기에도 발현이 지속적으로 이루어졌다. 그러나 prolamin 유전자 Os03g55740은 종자성숙기에만 발현을 나타내고 종자 발아시기에는 발현이 현저히 저하되었으며 Os07g11910은 출수 후 30일째 가장 많은 발현을 나타내었으며 발아종자에서는 비교적 낮은 발현을 나타내었다. Prolamin 유전자 13개 모두잎, 줄기, 뿌리, 캘러스에서는 발현이 없었다.

Fig. 2. Hierarchical clustering of tissue-specific expressed genes using rice 135K microarrays. Twelve spots were significantly up-regulated or down-regulated at least 2-fold during rice organ development. Microarray analyses used IPBT2_2 as a reference. IPBT2_2 indicates rice seeds at booting stage. IPHD2 represents rice seeds at heading stage. Days after pollination at IPHD2 are indicated by numerals followed by days (D). IPS4, IPW24, IPG24, IPG48, and IPG72 represent seeds at germinating stages. IPLf, IPRt, IPCa, and IPSm rndicate leaf, root, callus, and stem, respectively (Yoon et al.,2012).

Globulin 유전자의 구조 및 발현특성 분석

벼 globulin 단백질은 염용해성으로 전체 종자 배유 단백질의 2~8%를 차지하고 있으며 2D 전기영동 상에서는 26 kDa의 분자량을 나타낸다. 정제된 globulin 단백질을 이용한 투과광 스펙트럼분석 결과 49%의 α-helix 구조로 구성되어 있었다(Pan & Reeck, 1988). 벼 α-globulin은 소포체에서 합성되어 골지체를 경유하여 단백질과립-II로 수송되어 집적되며 α-globulin의 집적부위는 glutelin과 달리 단백질과립-II의 주변부에 존재 한다(Krishnan et al., 1992).

종자 저장단백질인 glutelin, prolamin, globulin은 작물의 종류에 따라 주성분 단백질의 분포가 다른데 벼의 경우 glutelin이 옥수수, 보리의 경우 prolamin이 귀리의 경우 globulin 함량이 높았다(Bewley and Black, 1985). Globulin 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과 glutamine, glutamate, arginine등의 아미노산이 많이 함유되어 있었다(Shorrosh et al., 1992). Globulin 단백질 등 많은 종류의 종자 저장단백질은 보존된 cysteine 잔기의 서열에 의해 3가지 영역을 가지며 LxxC(A 도메인), CCxQL(B 도메인), PxxC(C 도메인)의 영역간에는 이황화결합을 형성한다. 이들 영역들은 폴리펩티드쇄를 적절히 접는 역할을 하여 저장단백질이 세포내에 위치하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Kawagoe et al.,2005).

벼 종자 cDNA 유전자은행에서 분리된 α-globulin 유전자의 구조를 분석한 결과 186개 아미노산으로 구성된 21kDa의 단백질을 코드하고 있었다. 최근 벼 염색체 완전해독연구결과를 바탕으로 RAP DB에서 globulin 유전자(LOC_Os05g0499100)의 염색체내에서의 위치를 결정한 결과 5번 염색체에 위치하고 있었으며 단일 유전자로 존재하고 있었다. 다른 작물의 저장단백질 유전자와의 상동성 분석을 행한 결과 옥수수(Zeamays)의 globulin과는 54%, 보리(Hordeum chilense)의 Dhordein과는 45%, 밀(Triticum aestivum)의 고분자 glutenin과는 48%의 상동성을 나타내었다. 종자 저장단백질 아미노산 서열을 이용한 연관분석 결과 벼 globulin은 고분자-prolamin의 원종으로 생각되어지며 trypsin inhibitor와 α-amylase와 연관되어 있음을 알 수 있었다. Gu et al.(2010)은 밀과 벼를 포함하는 8종의 종자 저장단백질 유전자의 염색체구조를 분석한 결과 globulin 유전자는 고분자-glutenin 유전자, serine/ threonine protein kinase 유전자, peroxidase 유전자와 밀접히 연관되어 위치하고 있음을 보고하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Comparison of the orthologous Glu-1 region in maize, rice, Brachypodium, barley, and wheat diploid, tetraploid, and hexaploid Agenomes. Boxes indicate gene-coding regions (Gu et al., 2010).

Globulin 게놈 유전자의 구조를 분석한 결과 prolamin 유전자와 같이 intron 없이 1개의 exon으로 구성되어 있으며 유전자의 5' non-coding 부위에 TGAAA의 prolamin box와 A+T rich 배열을 가지고 있었다. 이러한 종자 저장단백질 유전자의 5' non-coding 부위 염기서열과 motif 구조의 특징이 종자 배유 특이적인 발현조절에 관여하는 것으로 보고하고 있다. 특히 종자 저장단백질의 5' non-coding 부위의 배열이 유전자발현을 증가 시키는 것으로 알려져 있으며 벼 α-globulin 유전자의 5' non-coding 부위 18nt의 TTGTCTGATTGATCATCA 배열을 GUS 유전자와 프로모터 부위에 삽입한 경우 GUS 발현이 6배 증가 되었다(Liu et al., 2010). 벼 종자 EST 발현유전자 분석을 통하여 α-globulin 유전자의 발현을 분석한 결과 미숙종자와 발아종자에서 동시에 발현을 나타내었다. 벼 마이크로어레이를 이용하여 조직내 발현양상을 분석한 결과 종자에서만 발현을 나타내었으며 출수 후 5일부터 발현이 증가하여 30일경 가장 많은 발현을 나타내었으며 발아종자에서도 발현을 나타내었다. 이와 같은 결과는 globulin 유전자가 late embryo abundant protein 역할을 하는 것으로 생각되어 진다.

이와 같이 벼 종자배유에 발현하는 glutelin, prolamin, globulin 유전자의 구조 및 발현 특성을 분석한 결과 globulin 유전자에서 prolamin 유전자로 진화가 시작되었으며 각 단백질은 세포내 효율적인 수송 및 축적을 위한 기구가 존재하였다. 또한 glutelin 유전자의 경우 종자 조직 특이적인 발현을 나타내며 종자발현을 위한 프로모터로서 사용되고 있다. 이러한 저장단백질 유전자의 발현특성을 이해함으로써 종자형질 개선 및 물질 생산 등의 실용화 연구에 기여할 수 있을 것이다.

적 요

본 리뷰의 목적은 벼 종자 저장단백질 구조분석 및 발현특성분석 결과 종합화를 통하여 종자형질 개선 등의 실용화연구를 위한 기반구축을 모색하는데 있다.

최근 벼 염색체염기서열완전해독 연구 결과를 이용한 유용형질 유전자 분리 및 실용화 연구가 많이 진행되고 있다. 특히 벼 종자 저장단백질은 인류에게는 주요 영양원으로 사용되어지며 종자 발아시에는 식물체 성장을 위한 질소원으로 사용되어진다. 벼 종자 저장단백질의 분류는 용매에서의 용해도에 따라 약산성 및 알카리 용해성의 glutelin, 알코올 용해성의 prolamin, 염 용해성의 globulin으로 나눈다. 벼 염색체 상에는 11개의 glutelin 유전자와 33개의 prolamin 유전자가 존재하며 prolamin 유전자의 경우 5번 염색체 15 Mb 부위에 15개의 유전자가 위치하였다. 이와 같이 종자저장단백질 유전자들이 동일 염색체 부위에 위치하고 있는 것은 진화학적으로 동일 염색체에서 유래하였거나 유사한 유전자발현 조절영역을 가지고 있음을 의미한다. Globulin 유전자는 5번 염색체에 단일 유전자로 존재하였다.

마이크로어레이를 이용한 종자저장 단백질 관련 유전자의 조직 특이 발현 양상을 분석한 결과 glutelin과 대다수의 prolamin 합성 유전자는 종자배유에서만 발현을 하였으며 소수의 prolamin과 globulin 합성 유전자는 종자배유와 발아종자에서도 발현을 나타내었다. 종자 저장단백질의 프로모터부위를 분리한 후 종자에서의 발현 양상을 분석한 결과 glutelin type C1 프로모터가 종자의 전체 부위에서 발현을 나타내었으며 glutelin type B5와 α-globulin 프로모터가 많은 양의 발현을 나타내었다. 본 리뷰를 통하여 벼 종자 저장단백질의 구조 및 발현특성 연구 진행사항을 살펴보았다. 이러한 연구 동향분석은 종자형질 개선 및 물질생산 등의 실용화 연구를 수행하는 연구자들에게 최근의 연구 현황을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

사 사

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ0068172012, PJ0066802012, PJ0082152012) 및 2012년도 농촌진흥청 국립농업과학원 박사후연수과정지원사업의 지원에 의해 이루어진 것임.

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