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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.24 No.4 pp.477-484
DOI :

비타민A 강화 벼 분자생물학적 분석 및 물벼룩 급이 효과

오성덕, 이기종, 박수윤, 손수인, 류태훈, 김재광, 김진서*, 안홍일, 하선화, 박종석, 안병옥, 조현석, 서상재
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부,
*경북대학교 농업생명과학대학 응용생명과학부
물벼룩 급성 독성 평가를 위한 비타민A 강화벼의 분자생물학적 특성을 분석한 결과, Southern blot에서 베타-카로틴 생합성을 위한 Psy와 CrtI 유전자들이 one-copy로 도입됨을 확인하였으며, 선발마커인 Bar 유전자의 단백질 검출 immunostrip 분석에서도 비타민A 강화벼에서만 검출되었다. 비타민A 강화벼의 목적하는 최종 산물인 베타-카로틴 함량도 낙동벼에 비해 8.9배 증가됨을 확인하였다. 비타민A 강화벼와 낙동벼의 농업환경 생물지표종인 물벼룩(Daphniamagna)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과, 비타민A 강화벼의 48시간-EC50은 3,311.40 mg/L(95% 신뢰한계 : 2,901.39 ~ 3,779.23 mg/L), 무영향농도(NOEC)는 1,800 mg/L였고, 낙동벼는 48시간-EC50은 3,655.23 mg/L(95% 신뢰한계 : 3,156.71 ~ 4,232.86 mg/L), 무영향농도는 1,800 mg/L였다. 따라서 Psy와 CrtI 유전자가 형질전환된 비타민A 강화벼 및 낙동벼가 환경 지표생물종인 물벼룩에 미치는 영향 평가 결과 상대적 동등성을 보였으며, 이는 Psy와 CrtI 유전자의 단백질 노출이 물벼룩에 부정적인 영향을 미치지 않은 것으로 판단된다.

Molecular Biological Analysis of Carotenoid-Biofortified Rice and Its Effect on Daphnia magna Feeding

Sang Jae Suh, Sung-Dug Oh, Kijong Lee, Soo-Yun Park, Soo-In Sohn, Tae-Hun Ryu, Jae-Kwang Kim, Jinseo Kim*, Hong-Il Ahn, Sun-Hwa Ha, Jong-Sug Park, Byung-Ohg Ahn, Hyun Suk Cho
National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration
*Division of Plant Biosciences, School of Plant Biosciences, Kyungpook National University
Received Sep. 17, 2012 / Revised Nov. 19, 2012 / Accepted Dec. 7, 2012

Abstract

A carotenoid-biofortified (PAC) rice was generated by inserting phytoene synthase (Psy)and carotene desaturase (CrtI) genes isolated from Capsicum annuum cv. Nockwang and Pantoea anana-tisinto the genome of a conventional variety of rice (Nakdongbyeo). For biosafety assessment, we evalu-ated the effects on survival of Daphnia magna which is a commonly used as a model organism inecotoxicological studies. D. magna fed on PAC rice and non-GM rice (Nakdong) grown in the same envi-ronment (100% ground rice suspension). The PAC rice was confirmed to have the insertion of T-DNAand protein expression by the Southern blot and HPLC analysis. Feeding study showed similar cumula-tive immobility and abnormal response of Daphnia magna between PAC rice and non-GM counterparts.48hr-EC50 values of PAC rice and non-GM rice showed 3,311 mg/L (95% confidence limits: 2,901.39 -3,779.23 mg/L) and 3,655 mg/L (95% confidence limits: 3,156.71 - 4,232.86 mg/L) respectively, but therewere not statistically significant.

 제초제 저항성 콩을 상업적으로 재배하기 시작한 1996년 이후 세계 인구 증가에 따른 식량 부족, 온난화에 의한 지구환경의 변화에 따른 농경지 및 생산성 감소 등의 문제점을 극복하는 수단으로 전 세계적으로 생명공학(Genetically Modified, GM)작물의 이용과 재배면적은 해마다 증가하고 있다. 농업생명공학 응용을 위한 국제서비스(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA) 보고에 의하면 2011년에는 29개국의 1억 6천만 헥타르에서 유전자변형 콩, 옥수수, 면화 및 유채 등의 생명공학작물들이 재배되었다(James, 2011).

 세계인구의 절반이 주식으로 소비하는 쌀은 탄수화물과 단백질, 지질 등 많은 에너지원과 미네랄을 함유하고 있고 영양분이 풍부한 낟알 곡식이며 세계적으로 널리 분포하고 있다. 일반적으로 도정 과정을 거친 백미의 경우 철분, 아연, 비타민E와 비타민A 등의 필수 미량 영양 성분들의 결핍이 문제시되고 있다(Juliano & Bechtel, 1985). 이러한 벼의 부족한 미량 영양 성분들의 문제를 개선하기 위한 방법으로 생명공학기술이 활용되고 있다. 쌀의 비타민A 결핍을 극복하기 위한 해결책으로 비타민A의 전구체인 베타-카로틴(β-carotene)을 생성하는 생명공학 벼인 황금쌀(Golden Rice)이 개발되었고, 중국에서 임상실험 등을 통해 실용화 단계에 있다(Guangwen  et al., 2012). 황금쌀은  Japonica 쌀 품종에 수선화(Narcissus pseudo-narcissus)  유래의 phytoene synthase (Psy)  유전자와  세균 Erwinia uredovora  유래의 carotene desaturase (CrtI)  유전자를 도입함으로써 최초로 프로비타민 A가 강화된 생명공학 벼를 개발되었으며(Ye  et al., 2000), 이어서  Indica 쌀 품종에도 적용되었다(Hoa  et al., 2003; Datta  et al., 2003). 국내에서는 농진청에서 카로티노이드(carotenoid) 대사관련 다중유전자들인  고추  녹광(Capsicum annuum cv. Nockwang)  유래  파이토엔  합성  효소(phytoene synthase,  PSY)와  박테리아(Erwinia uredovora,  20D3) 유래 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase, CrtI) 유전자들의 동시발현기술에 의해 벼의 배유부위에 발현시킨, 베타-카로틴 생합성 벼(비타민A 강화벼)를 개발하였다(Ha  et al., 2010).

 GM작물의 실용화 단계인 일반 농경지의 재배 및 경작을 위해서는 경작지 및 주변 환경에 미치는 영향에 대한 평가, 즉 도입 유전자들에 의한 표적 및 비표적 생물체에 대한 영향, 잡초화 가능성, 유전자 이동성에 따른 생태계 교란 등 환경위해성에 대한 안전성이 확보되어야 한다(Sohn  et al., 2010; de Vries & Wackernagel, 2004). 현재 국내에서도 2011년까지 20작물 150종의 다양한 GM작물들이 개발되고 있으며, 실용화를 위한 환경 및 식품 안전성 평가가 진행 중이나, 국내 개발된 GM작물들이 국내 환경에 미칠 수 있는 요인들에 대한 적합한 환경 위해성 평가 체계가 필요한 실정이다. 따라서 환경위해성 평가요소 중 경작지와 농경지 주변 환경의 다양한 비표적 생물체에 대한 위해성 평가에 대한 검정이 필요하다(Oh  et al., 2011a; Sohn  et al., 2010).

 GM작물에 형질전환된 유전자의 발현 단백질들은 숙주내에서 유기화합물 상태로 존재하며, 이들 발현물질들 상호간의 작용에 대한 예측을 위해서는 환경 생물지표종의 신진대사, 번식의 감소, 생체 기능의 상실이나 치사 등에 미치는 영향을 분석함으로써 유해성을 검사하는 환경 생물지표종 독성시험(생물검정)이  적합한  방법으로  제시되고  있다(Kim  et al., 2010a). 벼는 수생조건에서 생육하므로 밭작물(옥수수, 콩, 면화 등)의 농업환경 생물지표종 독성시험 시 일반적인 평가 대상인 나비목, 노린재목, 딱정벌레목 중의 대표 곤충 외에 수서생물종이 추가되어야 한다. 최근 독성평가용 환경 지표생물종에 미치는 영향을 분석하기 위하여 해충저항성 Bt벼가 무척추동물(물벼룩:  Daphnia magna)과  어류(미꾸리:  Misgurnus anguillicaudatus, 잉어:  Cyprinus carpio)에 미치는 영향이 분석되었으며,  벼의  해충으로  벼물바구미(Lissorhoptrus oryzo-philus)의 살충제 감수성 영향을 확인하여, 해충과 익충을 포함하는 다양한 서식지의 환경 지표생물종들에 미치는 직 · 간접적인 영향에 대한 분석의 필요성이 제기된 바 있다(Kim et al., 2010a; Oh  et al., 2011a; Oh  et al., 2011b, Oh  et al., 2012).

 GM작물의 환경 생물 독성시험에는 물벼룩을 선호하는데, 물벼룩은  일반적으로  환경오염  물질에  대한  감수성이  높고 Daphnia속  중에서  크기가  커  다루기가  편리할  뿐  아니라(5 mm 이상) 급성만성 시험과 관련한 방대한 독성 data-base가 구축되어 있어 환경 생물지표종으로 활용된다. 또한 물벼룩은 최근까지 다양한 화학물질 및 배출수에 대한 환경영향 평가의 지표종으로 전 세계적으로 이용되고 있으며(Kramer  et al., 2004; USEPA 1986), 국내에서도 환경생물 독성 시험기준과 방법(농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 의해 환경생태독성시험 생물로써 많은 기초시험 자료가 축적되어 있어 환경 독성조사법으로 유망한 생물 검정종으로 이용되고 있다.

 따라서 본 시험에서는 국내 개발된 비타민A 강화벼가 물벼룩에 미치는 급성독성 여부를 분석하기 위하여 비타민A 강화벼에 도입된  Psy와  CrtI 유전자의 안정성과 최종 산물인 카로티노이드 발현량을 확인한 후, 모본으로 사용된 낙동벼와 함께 환경위해성 평가 항목 중 농업환경 생물지표종인 물벼룩에 미치는 영향을 조사함으로써 환경 안전성 자료 생산용 급성독성 평가를 수행하였다.

재료 및 방법

물벼룩 급성독성 평가를 위한 비타민A 강화벼와 낙동벼의 시료 제조

 비타민A 강화벼와 비형질전환 모품종인 낙동벼를 GMO 격리 포장(경북 군위군 효령면 소재, RDA-가A-2011-005)에서 재배하였으며 잎과 줄기부위를 수확하여(출수기) 동결건조한 후(일신랩 FD8518, 한국) 분쇄기를 이용하여(한일전기, HMF-3100S, 한국) 분쇄하였다. 분말화된 시료는 600 µm의 표준망체(청계산업, 서울, 한국)에 통과한 시료를 분석에 이용하였다. 시험물질은 부형제인 수질오염공정시험기준(ES 04751.1)의 물벼룩을 이용한 급성독성시험법(2010)에 따라 조제된 배양액을 이용하여 현탁시켜 조제하였다.

비타민A 강화벼의 분자생물학적 분석

1. Southern blot 분석

 비타민A 강화벼와 낙동벼 식물체 시료를 각 1g씩을 취하고, 막자사발에서 액체질소와 함께 분말화한 후 DNeasy Plant kit (Qiagen, CA, USA)을 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc, Wilmington, USA)를  이용하여 260/280 nm값이 1.8 ~ 2.0 사이인 추출액을 실험에 이용하였다. 비타민A 강화벼의 도입유전자 특성 확인을 위해서 Southern blot을 수행하였으며, 추출한 genomic DNA 5 µg를 제한효소  XhoI으로 처리하여  절단하고 1% 한천 겔 상에서 전기영동한 다음 denaturation하였다. 이 후 nylon membrane (Hybond-N+, Amersham, Uppsala, Sweden)에 겔의 DNA를 전이시키고, membrane의 DNA 단편들을 UV-crosslink (1200 × µJ/cm2)로 고정한 후 hybridization buffer (0.5 M Na2PO4 pH 7.2, 1% BSA, 7% SDS, 1 mM EDTA, 10 mg/mL salmon sperm testicle DNA)로 1시간 동안 pre-hybridization하였다. Hybri-dization은 Random primer DNA labeling kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를  이용하였고, radioactive probe인  α-3232P로 labeling하여, 65℃에서 16 ~ 18시간 동안 hybridization하였다. Probe는 specific primer를  이용하여  Psy와  CrtI  유전자를 PCR로 증폭한 후 elution하여 사용하였다. Hybridization이 끝난 membrane은 washing solution (1st solution, 2X SSC, 0.1% SDS; 2nd solution, 1X SSC, 0.1% SDS; 3rd solution, 0.2X SSC, 0.1% SDS)으로  세척한  후 Bio-imaging analyzer(BAS-2000; Fuji Photo film, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

2. Immunostrip 검정

 Bar 유전자의 발현 확인을 위하여 Immunostrip 검정(lateral strip test)을 실시하였다. 시료를 추출액과 함께 마쇄하여 단백질을  추출한  후,  bar  유전자의  발현을 Trait LL Test Strip(Strategic Diagnostics Inc, Newark, DE)을 이용하여 Immunos-trip 검정을 수행하였다(Oh  et al., 2011a).

3. 카로티노이드 함량 분석

 Psy와  CrtI 유전자의 발현을 통한 최종 산물인 종자 내의 카로티노이드 함량을 확인을 위하여 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 실시하여 분석하였다. 카로티노이드의 추출과 측정은 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 Kim 등의 분석법과 동일하게 수행했다(Kim  et al., 2010b). 비타민A 강화벼와 낙동벼의 현미 시료 0.3 g에 0.1% ascorbic acid을 함유한 에탄올 (w/v), 3 ml를 넣고, 85℃ 항온수조에 5분간 처리하여 카로티노이드를 추출하였다. 여기에 80% potassium hydroxide, 120 ml를 넣고, 85℃ 항온수조에 10분간 처리하여 비누화한 후, 즉시 실온으로 냉각하였다. 냉각 후, 탈이온수 1.5 ml와 내부 표준물질로 25 µg/ml 농도의  β-Apo-8'- carotenal 50 µl와 hexane 1.5 ml를 넣고 섞어준 후, 원심분리(1200 g, 5분)하여 카로티노이드를 추출하였다. Hexane을 이용한 카로티노이드 추출은 2번 수행하였다.  추출액은  질소가스를  이용하여  건조시킨  후, dichloromethane/metanol (50 : 50, v/v)에 다시 녹여 HPLC로 분석하였다. 카로티노이드는 photodiode array 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC (Massy, France)를 사용하여 450 nm 검출파장에서  측정하였다.  컬럼은 C30  YMC column (250 × 4.6 mm, 3 µm; Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하였고, 용매 A는 10 mM ammonium acetate를 함유한 92% methanol, 용매 B는 methyl  tert-butyl ether를 사용하였다. 용매구배는 A : 83%, B : 17%로  시작하여, 23분에 A:70%, B : 30%, 29분에 A : 59%, B : 41%, 35분에 A : 30%, B: 70%, 40분에 A : 30%, B : 70%, 44분에 A : 83%, B : 17%, 55분에 A : 83%, B : 17%로  하여  분석하였다.  용매  유속은 1ml/min로, 컬럼 온도는 40℃로 고정하였다. Lutein,  α-carotene, β-carotene, zeaxanthin (CaroteNature; Lupsingen, Switzerland)의 표준용액을 이용하여 얻은 검량선으로부터 카로티노이드를 정량하였고,  내부  표준물질로는  β-Apo-8'-carotenal (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO)을 사용하였다.

급성독성 평가를 위한 물벼룩 배양 조건

 물벼룩(Daphnia magna)은  수온 20±2℃, 500 ~ 1000 Lux 광조건 16시간, 암조건 8시간의 환경조건으로 사육하였으며, 먹이는  오전에 1회  Chlorella vulgaris  (ATCC, Manassas, USA)를  공급하였다.  사육에는  수질오염공정시험기준(ES 04751.1)의 물벼룩을 이용한 급성독성시험법(2010)에 따라 조제된  배양액를  사용하였으며, pH는 7.6~8.0,  경도는 160~180 mg CaCO3/L, 알카리도는 110~120 mg CaCO3/L, 용존산소는 3.0 mg/L 이상 유지되도록 하여 사용하기 전 24시간 정도  폭기시켜  사용하였다.  수질의  경도는  한국산업규격 KSI3206의 Inductively coupled plasma emission spectroscopy에 의해, 알칼리도는 Standard method(21th edition, APHA, AWWA, WEF, USA)의 염산적정법에 의해 측정하였으며, 검사결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.

물벼룩 급성독성 시험의 비타민A 강화벼와 낙동벼 처리조건

 비타민A 강화벼와 낙동벼의 시료를 유효농도 설정 예비시험결과, 48시간 EC50값이 1000.00 ~ 10,497.60 mg/L 범위 내에 있을 것으로 추정되어 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L의 농도에서 시험을 수행하였다. 비타민A 강화벼와 비형질전환 모품종인 낙동벼의 잎과 줄기부위를 수확하여(출수기) 동결건조한 후(일신랩 FD8518, 한국) 분쇄기를 이용하여(한일전기, HMF-3100S, 한국) 분쇄하고, 분말화된 시료는 600 µm의 표준망체(청계산업, 서울, 한국)에 통과한 시료를 분석에  이용하였다.  시험용액은  조제된  시험물질을 0.100, 0.180, 0.324, 0.583, 1.050  및 2.000 g씩  정확히  칭량하여 100 mL의  배양액에  반복구당  각각  처리하여  시험용액(Test solution)으로 사용하였으며, 대조구로 시험용수인 배양액을 음성대조구로 설정하였다. 시험에는 생후 24시간이내의 비슷한 크기의 어린 물벼룩을 사용하였으며, 시험 개체수는 농도당 각 10마리씩, 3반복으로 처리하였다. 시험용액은 200 mL 용량의 곤충사육용기 (Insect Breeding Dish, 100 × 40 mm)에 100 mL를 처리하였으며, 노출환경은 사육조건과 동일한 수온 20±2℃을 유지하였다.

물벼룩 급성독성 분석을 위한 조사항목

 물벼룩에 대한 급성독성여부를 규명하기 위하여 각 처리구에 대하여 24시간 경과 후 일반중독증상, 특이증상 및 유영저해개체수 등을 분석하였다. 유영저해의 판정을 위해 시험용기를 조용히 움직이고 15초 후에 촉각 및 후복부 등은 움직이나 유영하지 못하는 것을 유영저해 물벼룩으로 간주하였다. 시험기간 중 시료 처리직후와 종료 시의 각 처리구에 대하여 pH 및 DO(Dissolved Oxygen)를 조사하였으며, 수온은 24시간 간격으로  매일  조사하였다. pH와  수온은 Thermo사의 Orion 420A+ pH meter를  사용하였고, DO는 Mettler Toledo의 SG98-ELK DO meter를 사용하여 측정하였다. EC50산출 및 무영향농도(NOEC, No Observed Effect Concentration)는 시험물질 처리 후 48시간의 유효성분에 대한 반수영향농도(EC50) 및 95% 신뢰한계를 probit 분석법에 의해 산출하였다. 무영향 농도는 중독증상이 없고 유영저해가 발생하지 않는 최고 시험 농도로 표시하였다.

결과 및 고찰

물벼룩 급성독성 평가용 비타민A 강화벼의 분자생물학적 특성

 카로티노이드(carotenoid) 대사관련 유전자인 고추(Capsicum annuum  cv. Nockwang)에서  분리된 phytoene synthase(Psy)와 세균  Pantoea ananatis에서 분리된 carotene desaturase(CrtI) 유전자를 동시발현기술을 이용하여 낙동벼에 도입하여 개발된(Ha  et al., 2010), 비타민A 강화벼는 형질전환체 종자의 배유부위에서 베타-카로틴의 함량이 모품종인 낙동벼에 비해 약 9배 증가됨을 확인하였다(Ha  et al., 2010). 종자의 배유부위에서 베타-카로틴이 증가된 비타민A 강화벼 이벤트(event PAC 4-2-1-1-12-1-1, T7세대)와 비형질전환 낙동벼를 비표적 생물체에 대한 독성평가를 실시하였다.

  분석에 사용된 시료에서  Psy와  CrtI 유전자들의 삽입을 확인하기 위하여 Southern blot 분석을 실시한 결과, 비타민A 강화벼(PAC 4-2-1-1-12-1-1)에서는 12 kb의 단일 밴드만 검출되었고, 비형질전환체인 낙동벼에서는 밴드가 검출되지 않았다. 이는  Psy와 CrtI 유전자가 본 실험에 사용된 비타민A 강화벼에 one-copy로 도입되었고, 도입 유전자가 T7세대까지 안정적으로 발현됨을 확인하였다(Fig. 1). Probe로 이용한  Psy와 CrtI DNA 유전자는 pGEM T-easy vector로 클로닝한 후, 염기서열을 분석한 결과 운반체 제작에 사용된  Psy와  CrtI 유전자의 상동성이 각각 100% 동일함을 확인하였다(data 생략).

Fig. 1. Southern blot analysis of carotenoid-biofortified rice(PAC) rice. Genomic DNA was digested with Xho I for one-cut site followed by hybridization to Psy (A) and CrtI (B). M:2.5kb DNA ladder, P: positive control, N: non-GM rice(Nakdong), PAC: carotenoid-biofortified rice PAC 4-2-1-1-12-1-1 lines.

 비타민A 강화벼에서  Bar 유전자 단백질(PAT)의 발현을 검정하기 위하여 항체를 이용한 lateral flow strip test (LFST)분석을 실시하였다. GMO격리포장에서 재배한 비타민A 강화벼와 낙동벼에 대하여, PAT 단백질 확인용 항체가 표지되어 있는 immunostrip을 이용하여 단백질 발현을 분석한 결과, 비타민A 강화벼에서만 특이적으로 단백질이 발현되었으며, 대조구인 낙동벼에서는 단백질이 발현되지 않았다(Fig. 2). 또한 비타민A 강화벼에서의  Psy와  CrtI의 단백질 발현 산물인 카로티노이드를 HPLC법을 이용하여 포장내의 수확한 종자에서 분석한  결과,  비타민A  강화벼에서 lutein은 0.72 ± 0.06 µg/g, zeaxanthin은 0.30 ± 0.01 µg/g,  α-carotene은 0.37 ± 0.05 µg/g, β-carotene은 1.43 ± 0.16 µg/g로  모품종인  낙동벼에  비해 zeaxanthin과  α-carotene이  검출되었으며, lutein과  β-carotene은 각각 3.1배와 8.9배 함량이 증가됨을 확인하였다(Table 1). 이는 2009년 GMO 격리포장(군위)에서 재배한 비타민A 강화벼의 T6세대(event PAC 4-2-1-1-12-1)인 종자에서 카로티노이드  검출량(lutein 0.51 ± 0.18 µg/g, zeaxanthin 0.23 ± 0.03 µg/g, α-carotene 0.42 ± 0.11 µg/g,  β-carotene 1.65 ± 0.64 µg/g)과 유사하여, 세대별로 안정적으로 도입 유전자의 단백질이 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(data 생략).

Fig. 2. Confirmation of genes expression for carotenoid-bio-fortified(PAC) rice by using immunostrip. Immunostrip tests for the PAT detection, N: non-GM rice; Nakdong, PAC: carotenoid-biofortified rice PAC 4-2-1-1-12-1-1 lines.

Table 1. Seed carotenoid content and composition of carotenoid-biofortified(PAC) and Nakdong rices.

물벼룩 급성독성 시험용수의 수질변화

 본 시험에 사용된 물벼룩(Daphnia magna)은 환경생물 독성시험 기준과 방법(농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 명시된 환경생태독성 시험생물이며, 국내외적으로 비교할 수 있는 충분한 기초시험 자료가 축적되어 있어 선택하였다. 시험용수의 시험기간 중 수질검사는 시험물질 처리 직전과 시험 종료시 수온, pH를 조사하였다. 시험기간 중 시험용수의 수온은 낙동벼 처리구에서는 평균 20.5 ± 0.3℃(19.8 ~ 20.9℃)이었고, 비타민A 강화벼(carotenoid-biofortified rice, PAC)처리구에서는 평균 20.2 ± 0.2℃(19.6 ~ 20.7℃)로 측정되었다(Table 2).

Table 2. Changes of water temperature. (Unit : ℃)

 pH는 0시간(시험용수에 시료 현탁시) 처리조건에서 낙동벼 처리구는 평균 7.15(6.74 ~ 7.75), 비타민A 강화벼 처리구는 평균 7.05(6.65 ~ 7.52)로 측정되었다. 시험 48시간에서는 낙동벼는 평균 6.93(6.12 ~ 7.55), 비타민A 강화벼는 평균 6.67(6.12 ~ 7.52)로 측정되었다. 반면에 음성대조구(0 mg/L)의 0시간 처리에서는 평균 7.86와 48시간 7.89로 측정되었다. 이는 유기물 시료인 낙동벼와 비타민A 강화벼의 처리시에 생물체인 물벼룩의 호흡 등 생리 작용과 유기물 분해 작용에 의해 두 시료와 음성대조구간의 pH의  차이에  영향을  주었을  것으로  사료된다(Table 3).

Table 3. Changes of pH.

 예비시험의 측정결과를 바탕으로 물벼룩 환경생태 독성시험분석을 위하여 시험용수의 DO는 포화용준산소량의 60% 이하로 내려가는 것을 방지하기 위하여 24시간 간격으로 30분간 산소를 공급하였다. 시험기간 중 처리농도별 비타민A 강화벼와 낙동벼 간의 DO는 유의적인 차이가 없었다.

비타민A 강화벼와 낙동벼의 처리농도에 따른 물벼룩의 유영저해 변화

 비타민A 강화벼와 낙동벼의 물벼룩(Daphnia magna) 급성독성시험을 48시간 동안 지수식으로 실시하여, 농도당 노출 물벼룩 10마리에 대한 생사수를 관찰, 조사하였으며 총 3반복 실시하였다. 물벼룩은 유기 및 무기 독성물질에 민감하게 반응하므로, 독성 측정을 위해서는 일반적으로 24시간 및 48시간 후의 유영저해 측정이 이용된다(Kim  et al., 2010a).

  낙동벼 처리구에서 1,000 ~ 20,000 mg/L의 시험농도에서 물벼룩 급성독성시험을 실시한 결과 물질 처리 후, 24시간과 48시간 경과시 1,000, 1,800 mg/L 처리구에서는 유영저해개체가 없었으나, 3,240, 5,830  및 10,500 mg/L  처리구에서 24시간 경과시 각각의 농도에서 16.7, 33.3, 73.3%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 각각의 농도에서 56.7, 80.0, 96.7%의 유영저해 개체가 관찰되었다. 20,000 mg/L 처리구에서는 24시간과 48시간 모두 100.0% 유영저해 개체로 관찰되었다(Table 4). 비타민A 강화벼 처리구에서 1,000 ~20,000 mg/L의 시험농도에서 물벼룩 급성독성시험을 실시한 결과 물질 처리 후, 24시간과 48시간 경과시 1,000, 1,800 mg/L 처리구에서는 유영저해 개체가 없었으나, 3,240, 5,830 및 10,500 mg/L 처리구에서 24시간 경과시 각각의 농도에서 30.0, 33.3, 56.7%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 각각의 농도에서 56.7, 86.7, 100.0%의 유영저해가 관찰되었다. 20,000mg/L 처리구에서는 24시간과 48시간 모두 100.0% 유영저해개체가 관찰되었다(Table 4). 시험기간 중 음성 대조군에서는 일반 중독 증상 및 특이증상은 관찰되지 않았다. 이는 유기물인 낙동벼와 비타민A 강화벼의 처리 농도가 높아짐에 따라 pH의 변화를 야기하고 또한, 두 시료가 시험용수에 지수적인 농도별로 현탁됨에 따라 물벼룩의 생육에 영향을 미쳐서 유영저해개체가 나타났을 것으로 사료된다.

Table 4. Cumulative immobility of Daphnia magna (n = 30).

 각 시험농도에서 품종간 물벼룩의 유영저해 개체수의 평균에 대한 t-test 검정결과 3,240, 5,830 및 10,500 mg/L 처리구에서 24시간후에는 각각  p값이 1.00, 0.37, 0.37이었으며, 48시간후에는 0.58, 0.25, 0.41이었다. 따라서 모든 처리농도에서 두 품종간 평균 유영 개체수에는 차이가 없었으며(p >0.05), 비타민A 강화벼가 일반중독 증상의 심화에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

비타민A 강화벼와 낙동벼의 급이에 따른 물벼룩의 급성독성

 비타민A 강화벼와 낙동벼의 물벼룩(Daphnia magna) 급성독성시험을 실시한 결과, 48시간-EC50은 낙동벼는 3,655.23mg/L(95% 신뢰한계 : 3,156.71 ~ 4,232.86 mg/L),  비타민A  강화벼는 3,311.40 mg/L(95% 신뢰한계 : 2,901.39 ~ 3,779.23 mg/L)로 비타민A 강화벼가 다소 높은 급성독성을 보였으나, 95% 신뢰한계 구간 내의 차이로 유의성은 없는 것으로 나타났다. 무영향 농도(NOEC, No Observed Effect Concentration)는  두  품종 모두 1,800 mg/L으로 확인되었다(Table 5). 이는  PSY와  CrtI가 도입된 비타민A 강화벼가 일반벼인 낙동벼에 비해 물벼룩의 급성 독성 증대에 영향을 미치지는 않은 것으로 보아, 비타민A 강화벼 및 낙동벼 모두 무영향 농도(NOEC)가 1,800 mg/L로 한계 농도를 설정할 수 있을 것이다. 따라서 Psy와  CrtI 유전자가 형질전환된 비타민A 강화벼 및 낙동벼가 환경 지표생물종인 물벼룩에 미치는 영향 평가 결과 상대적 동등성을 보였으며, 이는  Psy와  CrtI 유전자의 단백질 노출이 물벼룩에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

Table 5. EC50 values.

 국내에서도 생명공학작물의 실용화와 생명공학작물의 수입량 증가에 따른 환경지표생물종별 기준 설정과 이에 대한 영향 평가의 필요성이 요구되어, 국내에서 개발된 해충저항성 Bt벼에 대한 농경지의 환경지표생물종들에 대한 영향 평가가 보고되었다(Oh  et al., 2011a; Oh  et al., 2011b).  수생환경의 잉어(Cyprinus carpio)와  미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)에 대한 급성독성평가 수행한 결과에서 모품종인 낙동벼와 해충저항성 Bt벼에서 48시간 및 96시간-LC50에서 동등함을 확인하였으며(Oh  et al., 2011b),  벼물바구미의  살충제  감수성 실험에서도 72시간-LC50에 통계적으로 유의적 차이가 없는 것으로 보고되었고(Oh  et al., 2012), 본 실험과 동일한 농업환경 지표생물종인 물벼룩에서 급성독성시험 결과에서도 본 실험과 같이 차이가 없는 것으로 보고되었다(Oh  et al., 2011a).

 국외에서는 Thomas  et al. (2010)의  Cry1Ab유전자를 형질전환한 Bt  옥수수(MON810)의  급성독성  실험  결과에서 MON810과 비형질전환 옥수수의 처리 5일차 내에서의 생존률의 차이는 나타나지 않았으나, 42일간 장기영향 평가 시에는 후세대에서의 성숙기간, 산란수, 세대진전시기 등에 따라 차이가 나타냄을 보고하였다. 그러나 이 실험은 농도에 대한 기준설정이 없이 단일농도에서만 시험이 수행되었으며, Lee  et al.(2007)의 실험 결과에서 제시된 중금속 및 농약에 대한 물벼룩의 EC50과 LC50값이 상당히 광범위하게 형성되어 물벼룩의 영향 평가 실험 시 실험방법, 장소 및 조건의 차이가 있다는 보고와 같이 처리 농도 등이 고려되어야 될 것으로 사료된다.

 본 실험은 환경생물 독성 시험기준과 방법(농촌진흥청 고시제 2010-29호)에 준한 실험 방법으로 48시간 급성 독성 평가를 수행하였으나, 향후에 비타민A 강화벼의 물벼룩에 대한 영향 평가에 처리기간이 42일 이상의 장기간 세대 진전에 대한 안전성 평가를 수행하여 Thomas 등에 의한 해충저항성 Bt작물들의 장기 영향 평가 실험결과와 비교 분석할 필요성이 있다고 사료된다.

 본 실험의 결과 국내 개발된 비타민 A 강화벼의 환경지표생물종에 대한 영향 평가를 처음으로 시도하였으며, 관행적으로 경작지에서 재배되어온 비형질전환 낙동벼와  Psy와  CrtI 유전자가 형질 전환된 비타민A 강화벼는 수로, 하천 등의 담수환경에 방출되었을 때 환경 및 생물학적인 영향은 차이가 없을 것으로 사료된다. 이러한 급성독성 관련 동등성뿐만 아니라 향후 비타민A 강화벼를 포함한 GM작물에 대한 환경위해성 평가요소 중 환경 지표생물종에 대한 급성독성 분석시 세대 진전에 따른 생명공학작물의 장기간 노출에 따른 생식 독성과 유전독성 분석을 위한 표준 가이드라인을 구축함으로써 후대안전성 실험을 수행할 필요가 있을 것으로 사료된다.

사사

 본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원의 농업과학기술 연구 개발사업 지원(과제번호: PJ008484)에 의해 수행되었으며, 포장실험에 기술적인 지원을 주신 생물안전성과 지승욱님에게 감사드립니다.

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