• 재료 및 방법
• 공시재료 및 외부 형태적 특징
• DNA 추출
• nrDNA-ITS2 구간 PCR 증폭
• 염기서열 및 종간 계통분류학적 관계분석
• 결과 및 고찰
• 외부 형태적 구분
• nrDNA-ITS2 염기서열 분석에 의한 감초 종의 계통분류
• nrDNA-ITS2 염기서열 분석에 의한 유통감초 한약재의 판별
• 적요
• 사사

 감초(Licorice)는 콩과 (Leguminosae)의 감초속 (Glycyrrhiza)에 속하는 다년생 초본식물로 이명으론 국노(國老), 첨초(甛草), 영통(靈通),  밀감(蜜甘),  봉초(封草)라고  부르기도  한다(Kim, 2008). [대한약전  제9개정]에서  감초는  만주감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch.), 유럽감초(G. glabra L.), 창과감초(G. inf lat e Batalin)의 뿌리 및 뿌리줄기로 규정하고 있으며, 주로 뿌리와 주출경을 그대로 또는 주피를 제거하여 약재로 사용된다(Korea Food and Drug Administration, 2007).  감초의  가장  주요한 활성성분은 triterpenoid계 saponin인 glycyrrhizin으로 감초 뿌리에 3-5% 정도 함유되어 있으며, 항알레르기성, 항산화성, 항궤양성, 항바이러스성 및 항암성과 같은 생리활성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 감미가 높고 기포력, 유화력과 풍미를 개선하는 능력을 가지고 있어서 식품, 의약품 및 화장품 공업에서 널리 사용하고 있다(Fenwick  et al., 1990; Park  et al., 2011).

 감초속 식물은 전 세계적으로 만주감초, 유럽감초, 개감초 등 약 8종의 종속식물이 분포한다. 이 중 약재로서의 비중이 높은 만주감초는 주로 중국의 동북부와 서북부, 몽고, 시베리아에 분포하고 있으며, 유럽감초는 남유럽, 중앙아시아, 중국에 분포되어 있다(Nam  et al., 2011b). 감초는 국내 생산량이 거의 없어 중국,  우즈베키스탄에서  주로  수입되고  있으며  수입량은  약 1,100톤으로 복령에 이어 두 번째로 수입량이 많은 한약재이다(Korea Food and Drug Administration, 2011). 이와 같은 이유로 감초는 수입 대체 약용작물로서의 전망이 높다.

 한편, 중국산과 국내산 감초는 우즈베키스탄산 감초보다 고가에  거래되고  있으며,  감초식물의  종간  지표성분인 gly-cyrrhizin을 비롯한 생리활성물질들의 함량에 있어 차이가 있다고 보고되었다(Kondo  et al., 2007). 그러나 건조 가공되어 유통되는 한약재 특성상 원산지가 다른 한약재가 혼용 유통되는 사례가 발생하더라도 구분이 어렵기 때문에, 감초 약용식물의 종간구별 및 시중유통 한약재의 원산지 판별은 중요한 의미를 갖는다. 현재까지 사용되고 있는 한약재 구별방법에는 형태학적 특징, 성분의 정성과 정량분석 및 DNA 수준에서의 차이점 비교 등이 있다. Lee & Jo (2004)는 감초 뿌리의 외부 및 내부 형태를 비교한 결과, 형태학적인 특징은 식물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있어 식물 종판별에 어려움이 있으며, 특히 약재의 경우 건조·가공하여 유통되므로 육안으로 감별하기 쉽지 않다고 하였다. 또한 성분분석 비교에  의한  감초의  구분을  위해  미각센서(Choi  et al., 2011), NMR spectrometer(Yang  et al., 2010)등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 약재성분이 영향을 받을 수 있는 등의 한계가 있다.

 이러한  문제점을  해결하기  위해, Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD) (Williams  et al., 1990), Sequence Characterized Amplified Regions(SCAR) (Wang et al., 2001; Choi  et al., 2008), Amplified Fragment Length Polymor-phism(AFLP) (Ha  et al., 2002)  등 DNA  단편의  다형성을 이용한 분자생물학적 식물 종판별이 시도되고 있을 뿐만 아니라,  또한  최근에는,  한약재  판별에  있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA barcode를 이용한 분류법이 그  유용성을  인정받고  있다(CBOL Plnat Working Group, 2009).  특히  게놈  상에  존재하는  핵  리보솜 DNA  유전자(Nuclear Ribosomal DNA gene, nrDNA)의 nrDNA-ITS2부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져있다(Chen  et al., 2010; Kim  et al., 2005; Lee  et al., 2010).

 따라서 본 연구는 국내에서 한약재 자원으로 사용되고 있는 만주감초(G. uralensis), 유럽감초(G. glabra) 및 국내 자생종인 개감초(G. pallidiflora) 등을 대상으로 감초식물의 외부 형태학적 특징과 nrDNA-ITS2 염기서열의 차이를 구명하고자 수행되었다. 또한 이를 바탕으로 시중유통 감초 한약재의 원산지 판별에 적용함으로써, 한약재의 유통 질서 확립에 기여하고자 본 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

공시재료 및 외부 형태적 특징

 본 연구를 위해 36점을 공시재료로 사용하였다. 국내에서 약용으로 이용되는 감초인  G. uralensis  (자원번호:MPS000337-1)와 G. glabra  (MPS000953-1) 그리고 약용으로 이용되지 않는 국내 자생감초  G. pallidiflora  (MPS002506) 등 3종의 감초식물 각 3점을 농촌진흥청 국립원예특작과학원 약용작물과로부터 분양 받아 감초 종판별을 위한 표준시료로 사용하였다. 또한 유통 감초 한약재의 원산지 판별을 위해 서울 경동시장, 대구 약령시장, 금산 약재시장에서 중국산, 우즈베키스탄산, 한국산으로 판매되고 있는 한약재 27점을 구입하여 원산지 판별에 이용하였다(Table 1).

Table 1. Information of 39 licorice cultivars and accessions used in this study.

 외부 형태적 특성을 평가하기 위해 온실에서 3개월간 생육한 후 근경과 측근, 잎, 줄기를 관찰하였다. 특히 잎의 장폭비는 10개체에 대하여 3반복 측정하였으며, 뿌리 및 줄기의 형태적 구분은 대한식물도감을 참고하였다. 또한 한약재의 경우는 절편 색, 질감, 직경 등을 조사하여 생산지 별 차이를 비교하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Morphological characteristics of Glycyrrhiza spp. leaves and roots. (a) leaves form of G. pallidiflora, (b) root form of G. pallidiflora, (c) leaves form of G. uralensis, (d) root form of G. uralensis, (e) leaves form of G. glabra, (f) root form of G. glabra.

DNA 추출

 DNA추출은 Doyle & Doyle(1987)에 의해 제안된 Cetyltri-methyl ammonium bromide(CTAB)방법을 변형하여 사용하였다. 3개월간 생육한 감초 잎을 채취하여 액체질소와 막자사발을  사용하여  마쇄  한  뒤, 20% SDS가  포함된 Extrac-tion buffer [200mM Tris(pH8.0), 25 mM EDTA(pH8.0), 200 mM NaCl]를 4ml 첨가 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액에 동량의 CTAB buffer[100mM Tris(pH8.0), 20 mM EDTA(pH8.0), 1.4M NaCl, 1% PVP, 2 g CTAB]을  넣고 65℃에서 30분간 반응시킨 후, PCI용액(Phenol : Chloroform : Isoamylal-chol = 25 : 24 : 1)을 처리한 뒤 원심 분리하여 상등액을 취하였다. Phenol화합물 등의 불순물을 제거하기 위하여 1% PVP40을 첨가하여 사용하였다. 상등액의 2/3 volume의 isopropanol을  첨가한  뒤  −20℃에서 2시간  반응  후,  원심  분리하여 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 70% ethanol로 세척하고 건조시킨 뒤 3차 멸균수에 녹여 사용하였다.

Fig. 2. Representative appearances of cut roots of Glycyrrhiza species. (a), (b) Cultivated from China; (c), (d) Cultivated from Korea; (e), (f) Cultivated from Uzbekistan.

 또한 건조 감초 한약재 DNA 추출은 진동분쇄기로 마쇄한 시료에 HiYield™ Genomic DNA Mini Kit(RBC, Inc., Taiwan)를 사용하였다. 추출된 모든 감초 식물자원 및 건조 약재 DNA는 0.05% Ethidium Bromide(EtBr)를  포함한 0.8% agarose gel을 이용하여 확인하였다. 또한, 추출된 DNA는 UV spectrophotometer (Thermo scientific, Inc., US)를  이용하여 10ng/ul로 정량 후 PCR 증폭에 사용되었다.

nrDNA-ITS2 구간 PCR 증폭

 PCR을 위해 genomic DNA 40 ng, 10 pmol의 ITS2-F (5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’) 1 µl, ITS2-R (5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’) primer 1 µl, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각 250 µM, 10 mM Tris-HCl (pH8.3), 2.0 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 2 unit의 Taq-DNA polymerase를  사용하여  총 반응액의 양을 40 µl가 되도록 하였다. ITS2의 PCR 증폭은 94℃에서 5분간 pre-denature한 후, 94℃에서 30초 denatura-tion, 56℃에서 30초 annealing, 72℃에서 45초 extension으로 40회 수행하였으며, 최종 72℃에서 10분간 last extension을 수행하였다.  증폭된 PCR산물은 0.5x TBE buffer내에서 0.05% EtBr로 염색된 1.5% agarose gel에 전기영동(100 V)하여 UV-transilluminator 상에서 최종 산물을 확인하였다.

염기서열 및 종간 계통분류학적 관계분석

 염기서열  분석을  위해 HiYield™ Gel/PCR DNA Mini Kit(RBC, Inc., Taiwan)를 사용하여 PCR 산물을 정제 후, 염기서열  분석은 automatic DNA analyzer system 3730XL DNA sequencer(Applied Biosystems, Inc.)을 이용하였다. 유통 한약제의 원산지 판별을 위하여 본 실험의 기준시료 3종의 염기서열과 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 등록된 동일종을 비교 분석 후 수집 한약재와 함께 분석을 수행하였다. Data 분석은 MegAlin (DNAStar, Inc.)의 clustalW를 통해 각 재료의 염시서열을 정렬하였으며, 분류학적  계통  분석은 MEGA5(Tamura  et al., 2011)에  포함되어 있는 Neighbor-joining(NJ)을 이용하였다. Phylogenetic tree의 지지도는 Bootstrap을 이용하여 무작위로 1,000회 반복하였다(Felsenstein, 1985).

결과 및 고찰

외부 형태적 구분

 감초  식물의  형태적  특징  차이를  구명하기  위하여  G. uralensis,  G. glabra,  G. pallidiflora의 잎과 뿌리의 형태를 비교하였다.  잎의  형태에  있어서,  G. uralensis는  난형,  G. glabra는  타원형,  G. pallidiflora는  피침형에  가까웠다.  또한 감초 세종의 장폭비는 각각 1 : 1.52, 1 : 2.23, 1 : 2.58를 나타내었다. 복엽의 종류는 모두 기수 1회의 우상복엽으로 공통됨을 보였다. 감초의 뿌리는 직근성으로 배수가 잘되는 모래 함량이  높은 사양토에서 잘 자라는데(Nam  et al., 2011a), 본 공시재료로 사용한 감초의 경우 양질사토에서 생육한 것이다. 동일 환경조건에서 자란 감초 뿌리의 형태적 특징에 있어서, G. uralensis는 한국 자생종인  G. pallidiflora 및  G. glabra에 비해 지근의 발달이 적으며 직근성 형태를 보인다. 또한  G. pallidiflora와  G. glabra는 모두 여러 갈래의 지근이 발달해 있었으나 근직경에 있어서는  G. pallidiflora의 뿌리가 다소 가는 형태였다. 감초 뿌리의 색상은 각각  G. uralensis가 적자색을,  G. glabra가 회갈색을, 그리고  G. pallidiflora가 갈색을 나타내었다(Fig. 1).

시중유통 건조약재의 형태적 특징을 비교하기 위해 중국, 한국, 우즈베키스탄이 원산지인 감초 약재의 외부형질을 비교하였다. 중국에서 재배된 감초와 한국에서 재배된 감초의 뿌리한약재는 백색이었으며, 우즈베키스탄에서 재배된 감초는 황백색이었다. 또한 건조된 감초약재의 뿌리직경을 비교한 결과, 중국에서 재배한 감초가 11.12 mm, 한국에서 재배된 감초가 8.91 mm, 우즈베키스탄에서 재배된 감초가 16.23 mm를 나타내어 굵기에 있어 우즈베키스탄산, 중국산, 한국산 순이었다. 이러한 뿌리의 형태적 특징은 감초 재배지의 토양환경에 따라 식물개체 간에 큰 차이를 보일 수 있으며, 대부분의 시중유통한약재는 약용식물을 건조 후 절단 가공하여 유통되므로(Shin, 2006) 뿌리 형태적 특징에 의한 식물종 판별 및 약재의 구분은 적합하지 않을 것으로 판단된다.

nrDNA-ITS2 염기서열 분석에 의한 감초 종의 계통분류

 각기 다른 원산지와 종 차이를 고려해 수집한 감초 생체 표준시료와 건조약재시료로부터 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 nrDNA-ITS2부위로 PCR 증폭하여 약 500bp의 증폭산물을  확보하였다(Fig. 3).  본  실험에서  분석된  감초  종의 nrDNA-ITS2부위 염기서열 및 NCBI에서 얻은 서열을 이용하여 감초 표준식물의 분자유전학적 차이를 분석한 결과, 동일종 내에서 개체 간 동일한 염기서열을 보였으며, ITS2부위에서 각 종간 구분할 수 있는 변이를 확인하였다.  G. glabra는 98, 99, 100번째의 염기서열에서  G. uralensis 및  G. pallidiflora의 염기서열과는 다른 Single Nucleotide Polymorphism(SNP)가 존재 하여  G. glabra를 구분할 수 있는 특이 서열임을 확인하였다.  또한  G. pallidiflora의  경우 137, 161, 164, 203, 296 번째의 염기서열에서  G. uralensis 및  G. glabra와 다른 SNP가 존재 하여  G. pallidiflora를 구분 짓는 특이 서열임을 확인하였다(Table 2).

Fig. 3. PCR amplified portions of nrDNA-ITS2 region in Gly-cyrrhiza spp. (a) Fresh Glycyrrhiza spp., (b) Glycyrrhiza spp. for Geumsan medicinal market, (c) Glycyrrhiza spp. for Daegu medicinal market, (d) Glycyrrhiza spp. for Kyeongdong medicinal market.

Table 2. Seqence information of Glycyrrhiza spp.

또한, 감초의 기원 확인을 위한 phylogenetic tree를 알아보기  위해 Glycyrrhiza속에  대한 nrDNA-ITS2와 chloroplast DNA인 psbA-trnH, rpoB2, rpoC1  부위의  염기서열  정보를 NCBI에서  조사하여  감초의 phylogenetic tree를  작성하였다(Fig. 4).  본  연구  결과 Glycyrrhiza속의 3종의  감초인  G. uralensis,  G. glabra,  G. pallidiflora는 ITS2부위에서 서로 다른  염기서열을  나타내며,  종간  구분이  가능하였다.  반면 chloroplast DNA인 rpoB2, rpoC1에서는  G. uralensis와  G. glabra가 구분되지 않아 감초 한약재 판별에 부적합한 것으로 나타났다. psbA-trnH구간의 경우 감초 표준식물 세 종류에 대해 구분이 가능하였으나, 단 한 구간의 SNP에서 차이를 보여 보다 많은 구간의 차이를 보이는 ITS2구간이 감초의 구분에 적합한 것으로 판단되었다. 지금까지 한약재 약용식물의 식물종판별을 위해 사용된 방법에는 RAPD, AFLP, SCAR등이 수행된 바 있다(Cha  et al., 2003; Choi  et al., 2004; Bang  et al., 2004). 그러나 이러한 방법들은 특이적인 마커선발의 어려움과 재현성 또한 얻기 어렵기 때문에, 본 연구와 같이 유연관계가 근접한 식물종간의 판별에 적용하기에는 매우 용이하지 않다. 반면 DNA barcode를 이용한 SNP분석법은 실험이 간편하고, 다른 DNA분석법의 결과물 보다 얻어지는 PCR 산물의 크기가 작으며, 증폭산물의 재현성과 염기서열분석의 신뢰도가 높아 염기서열 비교가 용이한 장점이 있어, 차후 근연 속 식물의 계통분류에 있어 유용하게 사용될 것으로 사료된다(Mun, 2011).

Fig. 4. The Neighbor-joining tree based on sequences of species belonging to various Glycyrrhiza family(NCBI database and reference samples). Numbers on branches indicates frequencies of statistical occurrence out of 1000 bootstrap replicates. A: using nrDNA-ITS2 region, B: using cpDNA psbA-trnH, C: using cpDNA rpoC1, D: using cpDNA rpoB2.

nrDNA-ITS2 염기서열 분석에 의한 유통감초 한약재의 판별

 기원종이  확인된  감초  생체  표준시료를  이용하여  얻은 nrDNA-ITS2구간의 염기서열과 NCBI에서 확보한 염기서열을 바탕으로 국내에서 유통 중인 감초 한약재의 생산지별 식물원재료의 식물종 판별에 적용하였다. 각각의 염기서열 정보를 바탕으로 phylogenetic tree를 작성한 결과는 Fig. 5와 같다.

Fig. 5. The Neighbor-joining tree based on ITS2 sequences of fresh and dry sample used in this study. Numbers on branches indicates frequencies of statistical occurrence out of 1000 bootstrap replicates.

 생체  표준시료인 U1(G. uralensis), U2, U3와  유통  중인 국내산  및  중국산  감초에  대한 ITS2  부분의  염기서열을 NCBI에 등록된  G. uralensis와 비교한 결과 동일한 것으로 나타났다.

 따라서 중국으로부터 수입되어 시중 유통 중인 감초는  G. uralensis이며, 또한 국내에서 재배 생산중인 감초의 경우 중국에서 도입된  G. uralensis의 종자가 국내에 보급되어 일반 농가에서 재배되는 것으로 사료된다(조 등, 1998). 한편, 우즈베키스탄에서 수입한 감초의 경우 NCBI에서 얻은 감초 3종의 염기서열 정보 중  G. glabra인 BG와 생체 표준시료인 G1, G2 및 G3과 염기서열 정보가 동일하게 나타났으며, 이를 통해  G. uralensis는 중국동북부에,  G. glabra는 남유럽, 중앙아시아에 분포된다는 사실과 일치함을 확인되었다(Table 2). 또한 phylogenetic tree 분석을 통해 약재로 쓰이는  G. uralensis과 G. glabra는 약재로 쓰이지 않는 G. pallidiflora에 비하여 유전적 거리가 가까움을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

 [대한약전 제9개정]에서 규정하고 있는 약용 감초의 종은  G. uralensis,  G. glabra,  G. inflata으로 신규 편입된  G. inflata의 경우, nrDNA-ITS2구간에서  G. glabra  및  G. glandulifera와의 비교 결과, 감초 식물종의 구분이 어려운 것으로 나타났다. 그러나 NCBI에서 수집한 rbcL을 분석한 결과 각 감초 식물종간 1~2구간의 SNP가 확인되었다. 또한  G. pallidiflora,  G. uralensis, 및  G. glabra 의 식물종 판별이 가능한 ITS2와 더불어 rbcL을 이용한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

 본 연구 결과는 ITS2를 이용하여 한약재 자원으로 중요성이 높은 감초 2종  G. uralensis,  G. glabra, 및 국내에서 자생하나 약재로 사용되지 않고 있는  G. pallidiflora의 종 구분 뿐만 아니라 국내 유통되고 감초 한약재의 종 판별에 활용될 수 있을 것이다.

사사

본 연구는 2012년도 농촌진흥청 공동연구사업 특용작물 경쟁력 제고기술(과제번호: PJ008567) 연구비 지원에 의해 수행되었다.