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 생명공학의 발전은 기존의 육종방법으로는 불가능하였던 형질의 도입도 가능하게 한다. 이를 통해 유용한 식품요소의 생산, 생산성 증대 등의 다양한 방면에서의 발전이 이루어져 왔다. 이를 통한 GM작물의 개발은 1996년 최초로 상용화된 이후, 비약적인 발전을 통해 제초제저항성, 해충저항성, 기능성 작물의 상용화가 이루어져 왔고, 현재는 이를 넘어 유용자원의 생산, 환경스트레스 저감 작물들의 개발이 이루어지고 있다. 특히 제초제저항성은 현재까지 상용화된 가장 대표적인 특성의 하나이며 전 세계적으로 재배되고 있는 GM(genetically modified) 작물의 75%를 차지하고 있다(James, 2011).

 세계에서 네 번째로 많이 재배되는 작물인 감자는 재배품종의 대부분이 괴경의 영양번식에 의해 증식이 이루어지므로 우수품종의 육성이 어려운 작물이다(Davies, 1996; Ross, 1986). 이런 문제점을 해결하기 위하여, 생명공학 기술을 이용한 우수품종 육성이 시도 되었다. 이런 노력의 일환으로 해충저항성 감자(Boiteau, 2005; Jorge and Larry, 2001; Tang et al., 2001)와 바이러스저항성 감자(Larson et al., 1990; Missiou et al., 2004) 등에 대한 실용화가 이루어진 바 있다. 또한 GM작물 개발단계에서 형질전환개체의 선발을 보다 쉽게 하기 위한 수단인 선발마커로도 많이 사용되고 있다. 우리나라에서는 해충 및 바이러스 저항성에 관련된 4종의 유전자변형감자에 대한 수입이 승인된 상태이다(KFDA, 2007).

 제초제저항성은 pat와 bar 유전자에 의해 발현되는 phosphinothricin acetyltransferase(PAT) 효소에 의해 나타난다(Thompson et al., 1987; Strauch et al., 1988). 이 효소는 제초물질인 phosphinothricin(PPT)을 아세틸화 시켜 무독화하는 역할을 한다. 이를 이용하여 콩과 같은 여러 작물에서 제초제저항성 작물이 개발되었고(Rathore et al., 1993), 현재 여러 나라에서 재배 및 식품용으로의 승인이 이루어져 있다.

 특히 제초제 glufosinate ammonium(상품명 BastaTM)에 저항성인 작물은 제초제저항성 유전자 bar의 발견(Thompson et al., 1987) 이후 여러 작물에 성공적으로 도입되었으며, EPSPS 유전자와 더불어 전세계에서 가장 많이 이용되는 제초제저항성 유전자 이다. bar 유전자에 의해 발현되는 PAT(phosphinothricin Nacetyltransferase)단백질은 제초제성분인 glufosinate ammonium을 무독한 N-acetyl-L-glufosinate로 전환 시킨다(Droge et al., 1992).

 우리나라의 경우, 여러 작물에 대해 bar 유전자의 도입을 통해 제초제저항성 작물을 개발한 사례가 있으며(Choi et al., 2003), 감자의 경우에도 여러 사례가 보고되고 있다(Choi et al., 1996, 1999; Elliseu, 1994; Han et al., 1997).

 형질전환작물의 실용화를 위해서는 식품안전성평가와 환경 위해성평가의 수행이 필요하다. 그 중 식품안전성평가는 개발된 작물이 식품으로 사용될 때 안전성을 검정 하여야 하고, 이에는 독성 및 알레르기 유발 가능성에 대한 평가가 필요하다. 한국에서 통용되는 한국식품의약품안전청의 고시 “The guideline for the Safety Assessment of Genetically Modified Foods”에 따르면 GM작물의 안전성평가는 GMO가 식품에 적절한지 그리고 안전한지를 확인하기 위한 자료를 검토하도록되어 있다(KFDA, 2007).

 본 연구는 제초제저항성 감자의 실용화 시에 필요한 식품안전성을 평가하기 위하여 수행되었고, 이중 도입된 유전자의 발현산물인 PAT 단백질과 제초제저항성 감자에 대한 독성평가를 수행하였다.

재료 및 방법

PAT 단백질 분리

 제초제저항성 단백질(PAT)의 급성경구독성평가를 위해서는 대량의 단백질이 필요하다. 그러나 형질전환 감자에서 발현되는 PAT의 양이 너무 적기 때문에 대장균을 이용하여 대량발현 한 후, 순수 분리하였다.

 PAT 단백질은 pRSET vector(Invitrogen, USA)에 bar 유전자를 cloning 하여 발현 vector를 제작하였고, 이를 대장균 균주 BL21 CodonPlus(DE3) RIPL(Stratagene, USA)에 형질전환하였다. 이 균주는 아미노말단에 6개의 histidine residue가 붙어 있어서 Ni-charged column chromatography를 통한 쉬운 분리가 가능하다. 만들어진 재조합대장균을 암피실린 항생제가 포함된 Luria Broth(LB) 액체배지에서 37^oC에서 4시간 배양 후, 0.1 mM isopropyl β-D-thiogalcatopyranoside(IPTG, Sigma Co. USA)를 첨가하고 배양온도를 20^oC로 낮추고, 6시간 배양하였다. 발현된 PAT 단백질의 분리는 Q-sepharose resin과 Ni-charged resin을 이용하여 순수 분리하였다. PAT단백질의 순도는 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였으며, 수집된 단백질은 모두 모아서 동결건조 한 후에 급성독성 평가 시까지 −80^oC 초저온냉동고에 보관하였다.

 90일 반복투여경구독성 시험에 사용한 해충저항성 감자는 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구센터 GMO 포장에서 수확한 감자를 사용하였으며 대조군으로는 모품종인 대지감자를 사용하였다. 군별 사료의 조성은 Table 1과 같다.

Table 1. Composition of diet.

사료조제

 GM 및 non-GM 감자를 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지 농업연구센터 에서 분양 받아 분말 사료(Lab rodent chow)와 혼합 조제하였다. 시험에 사용된 사료의 영양성분(조단백질, 조지방, 섬유소, 조회분, 탄수화물)함량은 AOAC 법으로 측정하였다(AOAC, 1990).

급성독성 검정

 단백질에 대한 급성독성 평가기준은 명확하지 않다. 본 실험에서는 화학물질 독성시험에 대한 규정인 OECD 가이드라인 420조 및 423조에서 규정한 고정용량법을 바탕으로, 최고 농도인 2,000mg/kg body weight에 준하여 독성을 검정하였다.

 PAT 단백질에 대한 경구 급성경구독성을 보기 위하여 ICR계 마우스에 최초 2,000 mg/kg을 경구투여하고 14일 후 치사 정도와 체중변화, 사료섭취량을 측정하였다. 실험은 생후 4주 경과된 쥐를 1주일간 순화 시킨 후, 건강한 쥐 10마리(암수 각 5마리)를 대상으로 PAT 단백질을 투여하고, 일주일 단위로 체중과 치사율을 조사하였다.

90일 반복투여 경구독성시험

 90일 반복투여 경구독성시험은 한국화학융합시험연구원에 의뢰하여 수행하였다. 생후 6주 령의 Specific Pathogen Free(SPF) rat을 (주)오리엔트로부터 구입하여 약 일주일간 순화시킨 후, 건강상태를 확인하였다. 시험 시작 전 각 쥐 들의 몸무게는 수컷의 경우 214.2 ~ 230.6g, 암컷의 경우 166.2 ~ 183.5 g였고, 한 군당 암수 각 10마리씩 무작위로 분리하여 제조된 사료를 급여하였다. 군 분리는 시험군의 평균체중과 표준편차를 계산하여 균등성 여부를 확인 하였다. 사육은 온도 20 ± 3^oC, 상대습도 50 ± 20%, 환기횟수 10 ~ 15회/hr, 조명시간 12시간(오전 8시 ~오후 8시), 조도 200 ~ 300 Lux의 동물사육실 에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험기간 동안 격리 사육하였다. 투여기간은 13주(90일)이고, 사료 및 음수섭취량 그리고 체중은 주 1회 측정 하였으며, 투여 전 및 부검당일에도 측정하였다.

사망률 및 이상 증상 검정

 모든 동물에 대해 매일 사망동물이나 빈사동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 전 시험기간 동안 운동성, 외관 및 자율신경 등의 일반증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 체중은 입수 시 및 군 분리 시와 투여 개시 후 주 1회씩 측정하였다. 사료섭취량은 시험물질 투여 후 주 1회씩 측정하였다.

소변분석

 부검 24시간 전 metabolic cage에 각 한 마리씩 넣고 12시간 이상 소변을 채취하여 부치를 측정한 후, 뇨 검사는 시험 종료 마지막 주에 BayerDiagnostics Multistix 10SG(Not. 5J06C, U.S.A.) REF 2300(03536597) 스트립과 뇨 측정기(Clinitek 500, U.S.A.)를 이용하여 specific gravity, pH, leukocyte, nitrite, protein, glucose, ketone, urobilinogen, bilirubin, blood를 측정하였다.

혈액분석

 채혈 전에 하룻밤 절식시킨 동물을 Ether로 마취한 다음 복대동맥으로부터 채혈한 혈액 중 약 2 ml의 혈액은 EDTA가 함유된 CBC bottle(EDTA 3 K, Sewon Medical)에 취하여 자동혈구측정기(Hemavet, USA)를 이용하여 다음과 같이 측정하였고, 혈액응고시간의 측정은 채혈한 후 sodium citrate가 함유된 vacutainer(Sodium citrate 3.2%, USA)에 취하여 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 혈장을 자동응고시간 측정기(Coagrex-100s, Japan)를 이용하여 측정 하였다.

생화학분석

 채혈한 혈액 중 혈액검사에서 사용한 2 ml과 혈액응고시간 측정에 사용한 1 ml을 제외한 나머지 혈액은 실온에서 응고시킨 다음 원심 분리(3,000 rpm, 10분)하여 혈청을 취하여 자동혈청분석기 (Hitachi7060, Japan)와 전해질분석기 (Bayer 644 Na/K/Cl analyzer, US)를 이용하여 측정하였다. 분석한 항목으로는 Albumin, Alkaline phosphate, Alanine aminotransferase(ALT), Aspartate aminotransferase(AST), Total Bilirubin, Cholesterol, Triacylglycerids 등을 분석하였다.

부검 시 병리학적 소견

 시험 종료 시, 모든 동물을 Ether로 심마취시켜 채혈 및 안락사 시킨 후 체표, 모든 체공(external surface & all orifices), 두개강(cranial cavity), 흉강 및 복강의 모든 장기(thoracic and abdominal & their contents)에 대하여 육안적 검사를 실시하였다.

병리조직학적 검사

 부검한 동물을 육안으로 관찰한 후, 주요장기(간장, 신장, 비장, 부신, 폐장, 뇌, 심장, 뇌하수체, 고화/난소, 그리고 가슴샘)을 적출하여 중량을 측정하였고, 적출한 다음의 장기를 개체별로 10% 중성포르말린용액(neutral formalin)에 고정하였으며 조직슬라이드의 제작은 Lab rodent chow 투여군, non-GMO 5% 투여군 및 GMO 5% 투여군에 대하여 제작하였다

통계처리

 체중, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사 및 장기중량의 자료에 대해서는 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene’s test를 실시하였고, 분산의 동질성이 인정된 경우 one way ANOVA test를 실시하여 유의성이 관찰되면 사후검정으로 Scheffe 검정을 실시하였다. Levene’s test 결과 분산이 이질적이면 사후검정으로 Dunnett 검정을 실시하였다. 모든 통계분석은 SPSS통계 프로그램 (Ver. 10.0)을 이용하여 수행하였다.

결과 및 고찰

PAT 단백질 분리

 제초제저항성 감자에서 직접 PAT 단백질을 분리정제하기 어렵기 때문에, bar 유전자를 함유하고 있는 대장균에서 PAT 단백질을 대량 정제하여 급성경구독성의 실험재료로 사용하였다. PAT 단백질의 분리는 bar 유전자 형질전환 대장균을 분리하기 위하여, 세포 배양 후, PAT의 대량 발현을 확인하였다. 만들어진 recombinant PAT 단백질을 Q-sepharose와 Ni-charged chromatography를 통해 순수 분리하였다(Fig. 1). PAT 단백질임을 확인하기 위하여 아미노말단에 대한 아미노산 서열을 확인하였고, 만들어진 항체를 이용하여 affinity column을 제조하여 감자에서 발현되는 PAT 단백질을 분리하였고, 이의 아미노산 서열을 분석하여 대장균 유래 PAT 단백질과 비교 하였다(data not shown).

Fig. 1. PAT purification by Q-sepharose and Ni-charged column chromatography from bar recombinant E.coli.

 최종적으로 분리된 단백질은 동결 건조하였으며, 총량은 약 750 mg 정도였다. 이를 급성 경구독성 시까지 동결건조 하여 −80^oC 초저온 냉동고에 보관하였다.

급성 경구독성

 대장균에서 분리된 대장균 유래의 PAT 단백질을 쥐에 2000 mg/kg이 되도록 경구 투여하였다. 이런 고농도의 PAT 단백질을 먹은 쥐를 2주간 사육하면서 치사율과 체중변화 그리고 사료섭취량을 분석하였다. 이때 대조구는 일반적인 물을 투여한 쥐와 비교하였다. 고용량의 PAT를 먹은 쥐는 투여 후 14일 경과 후, 대조구인 dH₂0의 경우와 같이 치사된 경우가 없었다(Table 2). 또한, 체중변화와 사료섭취량과 관련하여 대조군과 유의적인 차이 없이 비슷한 양상을 보였다(data not shown).

Table 2. Death rate of the mice treated PAT protein

90일 반복 경구 투여 독성

 체중은 독성유무를 판단 할 수 있는 중요한 요소이다(Kwon et al., 2004). 90일 처리 기간 동안 치사한 동물은 없었으며, 각 시험군의 체중 증가량은 실험 기간 동안 암·수 모든 시험군에서 유의성 있는 체중 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 2, 3). 사료 섭취량 역시 암·수 모든 시험군에서 시험기간 동안 특기할 만한 변화는 관찰되지 않았다(data not shown).

Fig. 2. Group mean weekly body weight(Males).

Fig. 3. Group mean of weekly body weight(Females).

 시험에 사용된 모든 동물을 대상으로 시험 종료 시에 뇨 검사를 실시한 결과, 모든 시험군에서 시험물질 투여로 인한 변화로 판단되는 소견은 관찰되지 않았다(data not shown).

 혈액학적 검사에 있어서 수컷의 경우 GMO 5% 투여군의 망상적혈구수에서만 Lab rodent chow 투여군에 비해 유의성 있는 감소를 보였고, 암컷의 경우에서는 GMO 1%와 5% 투여군의 망상적혈구수가 Lab rodent chow 투여군과 non-GMO 50% 투여군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다. 이러한 변화는 모두 정상 범위 내의 변화이므로 시험물질 섭취와 관련된 독성이라 판단되지는 않는다(Table 3).

Table 3. Group mean hematological values and standard deviation.

 혈액생화학적 검사 결과 수컷의 경우 GMO 5% 투여군의 전해질(Cl-)치가 Lab rodent chow 투여군과 non-GMO 5% 투여군에 비해 유의성 있는 감소를 보였고, GMO 1% 투여군에서는 Lab rodent chow 투여군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다. 암컷의 경우에는 GMO 5% 투여군의 전해질(Cl−)치가 Lab rodent chow 투여군과 non-GMO 5% 투여군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다. 이러한 변화는 변화의 정도가 적고 모두 정상 범위내의 변화이므로 시험물질 섭취와 관련된 독성이라 판단되지는 않는다.

 암컷 GMO 5% 투여군의 Total-protein치는 rodent chow 투여군에 비해 유의성 있는 감소를 보였고, GMO 1% 투여군, GMO 5% 투여군, 및 non-GMO 5% 투여군의 calcium치는 rodent chow 투여군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다. 이러한 변화 또한 변화의 정도가 적고 모두 정상 범위내의 변화이므로 시험물질 섭취와 관련된 독성이라 판단되지는 않는다(Table 4).

Table 4. Group mean blood chemical values and standard deviations.

 장기중량 측정 결과 투여군간 유의성 있는 변화를 보인 장기는 없었다(Table 5). 부검 시 암·수 모든 동물의 주요장기에 대한 육안적 검사를 실시한 결과 시험물질 섭취와 관련 이상 소견은 관찰되지 않았다.

Table 5. Group mean organ weights and standard deviations. (Unit : g)

 부검 후 적출한 장기에 대한 조직병리학적 검사 결과, 모든 투여군의 간장에서 다소성 임파구 응집이 미약하게 산발적으로 관찰되었고, 간 세포 내 미세방울이 관찰되었으며, 비장에서 골수 외 조혈, 혈청소로 추정되는 갈색소 침착이 관찰되었다. 수컷 대조군 심장에서는 다소성 괴사와 국소성 임파구 침윤이 각 1 차례씩 미약하게 관찰되었다. 수컷 대조군에서 점막 하 증식이 약하게 1 차례 관찰되었고, 수컷 투여군의 폐에서 다소성 중도의 혈관주위염과 약한 간질성 임파구 침윤이 2차례 관찰되었다. 이상의 결과로부터 시험물질 섭취와 관련된 병변 및 표적 장기는 관찰되지 않았다(Table 6).

Table 6. Summary incidence of histopathological findings.

Table 6. Continued.

 Non-GMO 감자는 5%, 제초제 저항성 감자는 1%와 5%로 사료에 혼합하여 90일간 자유 공급한 결과, 수컷은 3.12, 0.68 및 3.46 g/kg/day을 각각 섭취 하였고, 암컷은 3.73, 0.79 및 4.03 g/kg/day을 섭취하였다.

 따라서, 본 시험 에서 유전자 재조합된 제초제 저항성 감자는 최고 투여용량인 5% 투여군에서 유의할 만한 독성이 유발되지 않았으므로 무해용량 (NOAEL; No Observed Adverse Effect Level)은 3 g/kg이상으로 판단된다.

고 찰

 우리나라에서 유전자변형작물(GMO)의 개발은 20년 전부터 시도되어 많은 다양한 품종의 개발이 이루어져왔다. 이를 통해 제초제저항성 벼, 고추 잔디, 그리고 해충저항성 벼 배추 등이 개발되었고 상업화를 시도한 사례가 있으며, 상업화를 위한 안전성평가가 수행된 바 있다. 그러나, 안전성평가 과정에서 드러난 소소한 문제의 발생에 의해, 현재까지 상업화된 작물의 출현은 이루어지지 않고 있다, 이중 제초제저항성 잔디의 경우, 자체적인 안전성평가를 마치고 상용화를 위한 심사과정 중에 있다.

 제초제저항성 작물의 경우 주로 bar 유전자를 이용한 개발이 이루어지고 있으며, 제초제저항성 작물의 개발 이외에도 선발마커로서 많이 이용되고 있다. 이는 제초제 살포를 통해 쉽게 유전자변형작물의 선발이 가능하고, 이를 뒷받침 할 수 있는 다양한 연구수단이 이미 개발되어 있기 때문일 것이다.

 생명공학을 이용한 제초제저항성 작물의 개발은 여러 가지면에서 장점을 가질 수 있다. Glufosinate ammonium은 비선택성 제초제로서 대부분의 잡초방제에 사용이 가능하고, 토양잔류독성이 낮은 특성이 있어 기존제초제를 사용하는 것보다 친환경적인 방제가 가능하다는 장점이 있다.

 유전자변형작물은 생명공학기술을 이용하여 기존의 육종법으로 도출 할 수 없는 형질을 발현시킨 것이다. 기존의 육종적 방법이 형질을 나타냄에 있어 다량의 유전자변이를 유발하는데 반해, 유전자변형작물은 목적으로 하는 하나 또는 수 개의 유전자만을 발현시키므로, 육종적 방법에 비해 유전적 변이가 적다. 그러므로, 표현형이나 작물의 특성변이에 대해 영향이 적은 편이다. 그러나, 현재의 규제정책은 인위적인 변이에 대해 엄격한 안전성평가를 요구하고 있다(Reis et al., 2006). 이 때문에 GM작물의 식품으로서의 안전성평가는 기존에 일상적으로 섭취되는 식품만큼 안전한지를 검정하는 것이다. 그러나 해당 식품의 완전한 안전성을 증명하는 것은 불가능하다(ILSI, 2003). 그러므로 유전자의 출처, 유전자 서열 그리고 활성 및 내재적인 특성에 따른 잠재적인 위험도 평가가 필요하다.

 본 연구에서는 이런 제초제저항성 작물이 식품으로 적절하고 안전한지를 검정하기 위하여 PAT 단백질과 제초제저항성 감자의 독성을 조사하였다. PAT 단백질에 대해, 현재 통용되고 있는 농약의 최대 독성기준인 2,000 mg/kg을 적용하여, 단백질을 쥐에 경구투여하고 2주간 관찰하였다. 고농도의 PAT 단백질을 먹인 쥐의 경우, 대조구와 같이 경구투여에 의한 치사동물은 발견되지 않았고, 체중 증가 및 사료 섭취량에서 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 또한 14일 후 외관 증상을 본 결과에서도, 특별한 병징을 보이지 않음을 확인하였다. 이 결과로 제초제저항성 작물에 사용된 PAT는 안전하다고 판단할 수 있고, 무해용량이 3,000 mg/kg 이상인 것으로 판단하였다. 이와 같은 결과는 기존에 발표된 다른 연구논문에서 나타난 바와 같아 PAT 단백질이 안전함을 알 수 있었다(Herouet et al., 2005).

 또한, 제초제저항성 감자의 장기적인 섭취에 따른 영향을 보기 위해 90일 경구독성을 살펴 본 결과, 급성독성의 경우와 마찬가지로 치사된 쥐는 없었고, 체중 증가와 사료섭취량도 대조구와 같이 정상적인 결과를 얻을 수 있었다. 이외에 부검을 통해, 장기중량, 혈액학적 분석 등을 통해서도 유의성 있는 차이를 발견하지 못했다.

 이상의 결과로 유추해 볼 때, PAT 단백질과 제초제저항성 감자는 식품으로서의 잠재적인 위험성이 없어, 충분히 식품 및 식품재료로 사용이 가능하다.

적 요

 제초제 성분인 phosphinothricin을 분해하는 phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 단백질을 과발현시킨 제초제저항성 감자가 개발되었다. 본 연구에서는 안전성평가 기준에 따라, PAT 단백질과 제초제저항성 감자에 대한 급성경구독성 및 아만성 독성 평가를 실시하였다.

 PAT 단백질을 재조합 대장균에서 분리정제 한 후, ICR계쥐에 2,000 mg/kg weight 용량의 PAT 단백질을 먹이고 14일 동안 치사율과 체중증가를 관찰한 결과, 죽은 동물이 없었고, 체중증가, 사료 섭취 및 특별한 이상증상을 발견하지 못했다.

 아만성 독성의 경우 제초제저항성 감자를 표준사료에 0, 1, 5% 섞어 90일 동안 경구 투여하였다. 이 경우에서도 사망한 개체는 없었으며, 조사한 여러 항목에 대해 특별한 이상증후를 관찰하지 못했다. 또한, 제초제저항성 감자를 먹인 동물군과 대조구로 일반감자를 먹인 동물 사이에서 유의 할 만한 차이는 발견되지 않았다.

 이런 결과를 토대로 볼 때, 제초제저항성 감자와 제초제 저항성 단백질인 PAT는 동물에게 독소로 작용하지 않음을 확인하였다.

사 사

 본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원(과제번호: PJ0084842012)의 지원에 의해 수행되었음.