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 세계 3대 곡물중 하나인 쌀은 전 인류 반 이상의 식량이며(Juliano, 2003), 특히 우리나라를 포함한 아시아 국가에서 가장 중요한 식량으로써 중요한 탄수화물과 단백질의 공급원이며, 특히 다른 곡류와 비교하여 전단백질 중의 우수한 아미노산 조성과 체내에서 소화흡수가 잘된다(Juliano, 1985).

 우리나라 벼 재배는 농업소득의 35% 내외(MIFAFF, 2011)를 차지하고 환경생태 및 아름다운 국토의 보전이라는 주요한 기능을 갖으며 안정된 국가 발전의 기본 근간이다. 국민소득의 증가와 식문화의 다양화로 전반적인 쌀의 소비 형태는 탑 라이스와 같은 극양식미 및 다양한 기능성을 갖는 고급 신형질미의 소비성향이 증가하는 추세를 나타내고 있다. 이와 같이 쌀소비의 고급화 및 고도의 다양화 등을 충족시키기 위하여 다양한 변이체 창출에 의한 새로운 신형질미의 연구개발을 위한 적극적인 유용유전자원의 개발이 중요한 과제로 대두되고 있다.

 종자 단백질은 종자 발아과정에서 초기생육에 필요한 질소성분을 저장하는 기능을 갖고 있으며 등숙과정에 배유에서 합성되어 단백질과립(protein body, PB)에 집적되어(Kawakatsu et al., 2010) 종자 발아 시 종자가 물을 흡수하게 되면 배나호분층에서 프로테아제가 합성, 분비되어 배유 중의 저장단백질을 분해하고 유식물 조직 성장에 필요한 질소원으로 이용된다(Kim et al., 2011). 쌀의 주요 저장단백질로는 glutelin과 prolamin이 있으며, 전자는 총 종자 단백질의 60 ~ 80%를 차지하며 15개의 유전자에 의해 인코딩되며, 종자는 20 ~ 30%로 34개의 유전자에 의해 인코딩된다(Kawakatsu et al., 2008; Xu & Messing, 2009). 쌀의 주요 저장 단백질인 glutelin은 GluA와 GluB 2개의 subfamilies로 구성되어져 있으며, GluB의 주요 subunits는 GluA의 subunits보다 평균 20% 더 많은 lysine을 가지고 있다.

 종자 저장단백질은 벼 품종 간 다양한 변이를 보이는데, 다양성을 탐색하기에 매우 유용한 방법으로 sodium dodecylsulphate–poly-acrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE)법이 널리 사용되고 있다. 생태형의 자포니카(japonica) 쌀 115점에서 배유 저장 단백질에 대한 유전적 다양성을 밝히기 위해 SDSPAGE를 이용하였고(Jin et al., 2006), Jugran et al. (2010)은 SDS-PAGE를 이용하여 분리된 70, 65, 60, 57, 37-39, 22-23, 13 그리고 10 kDa 크기의 저장단백질을 기초로 48개 쌀을 7개 그룹으로 구분하였다. 최근에는 쌀 외부표면에 13 kDa의 prolamin과 23 kDa의 glutelin에 형광 라벨이 표시된 항체를 사용하여 면역형광검사 현미경으로 13 kDa prolamin과 23 kDa glutelin을 관찰한 보고가 있다(Ohdaira et al., 2011).

 벼에 있어 배유의 저장물질에 관한 유전자원 개발 및 평가이용을 위해서는 자연계에서 변화하여 축적된 변이를 탐색하기위한 방법으로 Jahan et al. (2005)은 570여 벼 유전자원의 glutelin 함량 분석을 통해 다양한 변이를 보고한 바 있다. 또한 돌연변이 유기에 의한 유전자의 결손, 중복, 삽입 등에 의한 인위적 변이작성을 통한 배유 저장물질에 관한 유전자원을 개발하는 방법이 제안되었는데(Kwon & Lee, 1979), 새로운 변이창출을 위한 인위적 돌연변이를 유발시키는 유기원으로 γ-ray, X-ray 등의 방사선류와 N−methyl−N−-nitrosourea (MNU), Ethyl-Methane Sulfonate (EMS) 등의 화학물질이 연구되어 이용된 바 있다(Liu, 2002; Kim et al., 1991; Yano et al., 1985; Satoh & Omura, 1981). 이러한 처리에 의한 배유의 탄수화물과 전분의 구성함량을 변화시키는 돌연변이 개체에 대해 보고된 바 있으며(Koh et al., 1997; Kim et al., 1993; Kinoshita & Takahashi, 1991), 특히 벼 종자 저장단백질 중 16 kDa의 알러지 단백질이 감소된 돌연변이체(Nishio & Iida, 1993), 에틸렌아민 처리에 의한 저 glutelin 변이체(LGC-1, Iida et al., 1993, Nishimura et al., 2005) 및 γ-ray 조사에 의한 26 kDa glubulin 결손 돌연변이체(Iida et al., 1998) 등 다수의 저장단백질 변이체가 보고되었다.

 본 연구는 적극적인 유전자원 개발의 일환으로 신동진벼에 MNU 처리 및 감마선 조사에 의하여 유기된 변이계통을 공시하여 대표적인 저장단백질의 특성을 분석하였다. 유용 변이체는 다양한 기능성 신형질미 개량을 위한 육종소재로 활용하고, 나아가 유전연구 재료로 활용 할 목적으로 수행하였다.

재료 및 방법

공시재료

 본 연구의 공시재료는 다수계의 내도복성 및 양질미 특성을 갖는 신동진벼에 MNU 및 γ-ray 처리를 통해 선발된 55개 전분 돌연변이 계통(농업유전자원센터, RDA, 수원)과 변이모 본(신동진)을 2006년 4월 20일 파종육묘하여 이앙은 5월 30일 주당 1본씩(15주/1 계통) 조간과 주간을 50 × 15 간격으로 이앙하였다. 각 계통의 재배관리는 농촌진흥청 농사시험연구 벼 표준 재배법에 준하여 실시하였다.

돌연변이원의 처리

  MNU처리는 돌연변이체의 검출효율이 높은 Satoh & Omura (1979, 1981)의 방법을 적용하여 2002년 8월 25일 개화최성기에 pot로 이식하여 당일 개화수정된 것만 남기고 이외의 영화는 가위로 제거한 후, 수정되어 6 ~ 12시간 경과한 밤에 암실에서 25 ~ 30˚C의 1.0 mM MNU(N-methyl-N-nitrosourea) 수용액에 이삭이 완전히 잠기도록 1시간 침치 후, 흐르는 물에 24시간 수세하여 온실에서 격리 재배하여 결실한 종자를 얻었으며, γ-ray 처리는 2003년 4월 7일 한국원자력연구소에서 벼종자 돌연변이 유기의 적정처리 선량인 300gray의 γ-ray을 종자처리하여 돌연변이를 유기하였다. 유기된 돌연변이 종자는 2003년 4월 15일 파종하여 45일 성장된 어린모를 1주 1본 식재하여 격리재배에 의해 관행시비 및 관리방법으로 파종하여 불임을 보이는 개체에서 결실된 종자를 사용하여 선발하였다.

돌연변이계통의 농업형질 및 저장단백질 조성 분석

 변이모본 및 돌연변이 계통의 출수기, 간장, 수장 등 기본 농업형질에 대해 포장조사를 수행하였고, 현미 길이, 현미 폭, 현미 두께 및 현미천립중을 평가하였다. 또한 배유의 전분특성에 따라 waxy, dull, floury, giant embryo 등으로 구분하여 저장단백질 조성을 분석하였다. 종실의 저장단백질의 SDSPAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)분석은 Laemmli(1970)의 방법을 개량한 Kumamaru et al.(1988)의 방법으로 수행하였다. 전기영동 시료는 각 계통의 현미가루 20 mg을 취하여 사용하였고, gradient gel은 작성용액의 조성은 Table 1과 같다. 먼저 mini gel 작성용의 유리판 10조를 gel 작성 box(日本EIDO)에 넣고, 미리 4˚C에 냉각시켜 사용하였고, 농도구배 gel 용액 또한 미리 4˚C에서 각반하면서 충분히 기체를 제거하였다. Gel 용액은 gradient gel box에 gel 용액을 넣고 각반하면서 TEMED와 10% amonium persulfate 용액을 혼합시킨 후 micro tube pump를 이용하여 gel box의 밑 부분에서 주입시켰고, 주입완료 후 48시간 이상 상온에서 정치시켰다. 전기영동은 80 V에서 1시간, 120 V에서 1시간, 150 V에서 1시간, 180 V에서 1시간 20분 수행하였고, 완충용액과 단백질 염색은 Laemmli(1970)의 조성을 따랐으며, 약 1시간 진탕 염색 후, 약 12시간 탈색시켰다.

Table 1. Preparation of polyacrylamide gel (SDS-PAGE).

결과 및 고찰

돌연변이계통의 작물학적 특성

 2 가지 변이원에 의해 선발된 55 계통에 대하여 기본 농업형질 및 종실 특성을 평가한 결과는 Table 2, Fig. 1과 같다.

Table 2. Agronomical properties of endosperm and grain shape mutants of cv. Sindongjin.

Table 2. Continued.

Fig. 1. Distribution of major agronomic characteristics among mutant groups of rice variety Sindongjin, induced by two mutagens (MNU and γ-ray) (a) heading date, (b) culm length, (c) Panicle length, (d) Grain length, (e) Grain width, (f) Grain L/W ratio, (g) Grain thickness, (h) 1,000 grain weight).

 출수기(heading date)에 대해 변이모본과 비교해 보면, 신동진벼는 8월 21일이며 대부분 출수기 ±5일 내에서 출수하였고, waxy, dull, floury, white belly로 분류된 계통은 대부분 변이모본보다 다소 늦게 출수하는 경향을 나타냈다(Fig. 1(a)). 특히 Floury의 SM-22계통은 변이모본보다 8일 늦게 출수하여 공시변이계통에서 출수기가 가장 늦어졌다. 공시계통수가 가장 많은 opaque로 분류된 계통의 출수기는 각각의 opaque 계통마다 약간씩 차이는 있었지만 변이모본과 ±5일 내에 대부분 출수하였고, 그 밖의 배유 및 입형특성의 변이계통에서는 변이모본보다 다소 일찍 출수하는 경향을 보였다(Fig. 1(a)).

 Kim et al. (1998)은 감마선 처리에 의해 유묘의 초장이 작아진다고 하였고, Seetharami-Reddi et al. (1989)은 조사선량의 증가에 따라 생육초기의 초장에서도 감소가 심해진다고 하였다. 이와 같이 돌연변이원에 따른 변이계통의 출수기 변화, 간장 및 수장의 감소는 돌연변이체의 특성이라 할 수 있을 것이다(Lee et al., 1989). 한편 돌연변이 처리에 의한 변이계통은 단간화에 따라 수반된 제형질이 변화되어 수량성이 감소되는 경향이 있다는 보고가 있는데(Kim et al., 1976; IAEA, 1970), 공시된 변이계통에서도 대부분 간장 및 수장에서 짧아지는 경향을 나타냈다.

 간장에서 waxy로 분류된 계통에서만 모두 간장에서 변이모본보다 장간의 특성을 보였는데, SM-2의 waxy 계통이 104 cm로 변이모본인 신동진의 93.7 cm보다 10.3 cm 더 길었다(Fig. 1(b)). 반면 SM-19의 opaque 계통은 64.3 cm로 모본보다 29.4 cm의 짧은 특성을 나타냈고, waxy 이외 모든 계통에서 단간의 경향을 나타내며 각각의 계통에서도 변이 폭이 다양하였다(Fig. 1(b)).

 수장의 특성에 있어서는 변이모본이 24.3 cm를 나타냈고, SM-35의 심백(white core)계통에서 이삭길이 27 cm로 가장 길었으나 같은 특성의 SM-43이 17.7 cm로 9.3 cm의 넓은 변이폭을 나타냈고, 간장에서는 큰 차이를 나타내지 않으며 white core로 분류된 계통에서 이삭길이의 변이 폭이 특히 다양하였다(Fig. 1(c)). 그 외의 변이계통에서 수장은 간장의 패턴과 같이 변이모본보다 짧은 경향을 보였는데 생태적 특성에서 가장 대표적인 간장, 수장을 변이모본과 비교하여 보면 소수의 변이계통을 제외한 대부분이 모본과 유사하거나 다소 짧은 경향을 보였다. 이와 같은 주요 농업적 특성은 종실 수량성과 높은 상관을 갖기 때문에 모본보다 불리한 계통은 대체적으로 종실 생산성이 떨어진다.

 변이 모본인 신동진은 현미 길이가 6.15 mm, 폭은 3.16mm, 두께가 2.1 mm이며, 천립중 28.83 g으로 국제미작연구소(IRRI)의 종실형 분류기준에서 중간정도의 길이, 폭, 두께를 갖으며 천립중으로 보면 대립에 속하는 자포니카 형 다수계의 품종이다. 일반적으로 대립계통은 유전적으로 소립에 대하여 열성이며, 장간, 만생 등의 특성이 함께 발현되는 등 재배에 있어 부적합한 특성을 보이는 것이 많다. 하지만 변이계통인 SM-47은 현미 길이가 6.34 mm이고 천립중이 34.10 g으로 변이모본보다 대립(large grain)의 특성을 보이면서 출수기가 늦거나 불임발생도 없고 모본과 유사한 형태적 특성을 보여 초다수계육성이나 양조용, 사료용 등의 중간모본으로 이용할 수 있는 가능성을 시사하였다. SM-56은 현미 길이가 6.33 mm으로 모본보다는 약간 길었으나 장폭비가 2.31로 장립(long grain)의 특성을 나타냈으나 천립중은 모본보다 다소 떨어졌다. 소립(small grain)계통인 SM-53은 현미의 길이가 5.0 mm, 폭 2.93 mm, 천립중 23.10 g으로 변이체 중에서 가장 작았고, 원형립(round grain)으로 분류된 SM-48는 장폭비 1.57로 거의 원형에 가까운 특성을 보였다. 특히 미립내의 전분축적이 충실하지 않고 쭈글쭈글(Winkled)한 형태의 당질미(sugary)인 SM-31은 현미 두께와 천립중에서 1.01 mm, 14.10 g으로 신동진의 약 50% 정도였고, shrunken도 유사한 경향을 보였다. 자포니카 형의 동일 품종으로 유기된 공시재료의 돌연변이 55계통에서도 천립중 14.10g ~ 34.10g으로 2배 이상의 변이 폭과 장/폭 비 1.57 ~ 2.04의 다양한 분포를 보였다. 변이계통은 대부분 변이모본보다 종실특성의 현미 길이, 현미 폭, 현미 두께, 천립중에 있어 작거나 적은 특성을 나타냈다. 한편 종실의 배유 및 종실형태 변이 계통이 생태적 특성과 함께 발현되는 것은 유전자의 결실부분이 커서 다면발현으로 나온 결과라 생각된다. 옥수수의 opaque-2나 floury-2 (Mertz et al., 1964)에서도 고라이신 함량계통이 출현하였지만 열악한 생육특성으로 병충해에 약하며 수량이 떨어지는 등의 기피 특성으로 인해 실제 재배화가 되지 못한 예가 있다. 따라서 실제적 육종에 있어서는 종실변이 계통의 선발과 함께 낮은 수량성을 회복하기 위한 연구도 함께 수행되어야할 것으로 생각된다.

 한편 SAS프로그램을 이용한 ANOVA와 Duncan의 다중범위 검정의 결과 Table 3과 같이 배유특성 및 종실형태 별로 분류하였을 때 수장을 제외한 간장, 현미 길이, 현미 폭, 현미두께, 장폭비 및 천립중에서 0.01 수준에서 각 그룹 간 고도로 유의한 차이가 인정되었다. 간장의 경우 찰 돌연변이 계통이 다른 돌연변이 계통에 비해 유의하게 길어진 것으로 나타났고, round grain 돌연변이 계통의 경우 장폭비가 평균 1.6 수준으로 다른 돌연변이 계통에 비해 유의한 차이를 보였는데, 이는 현미 길이는 small grain 계통과 비슷한 수준으로 짧아졌고, 폭은 3.3으로 변이모본과 유의한 차이를 보이지는 않았지만 다른 돌연변이 계통에 비해 상대적으로 넓어졌기 때문이다. 현미 두께는 sugary 계통이 가장 얇았고, 쭈글한 형태인 shrunken 형태의 돌연변이 계통과 고아밀로스 계통에서 유의하게 감소된 것으로 나타났다. 천립중에서도 계통별 유사한 결과를 보였고 그 범위는 17.6 g에서 30.9 g로 나타났다. 조사된 돌연변이 계통이 대부분 감마선 조사에 의한 배유 및 종실형태변이 계통이지만, 돌연변이원에 의해 유기된 종실의 배유 및 종실형태 변이 계통은 각각의 분류에 의해 일정한 범위를 넘지 않는 종실의 형태적 특성을 갖는다는 것을 확인 할 수 있었다.

Table 3. Analysis of variance and Duncan`s multiple range test for classified mutants having endosperm and grain shape variations.

돌연변이계통의 저장단백질 조성분석

 선발된 변이 계통 55점에 대하여 배유형태에 따라 waxy, dull, opaque, floury, shrunken, sugary, giant embryo, white belly 및 고 amylose 특성을 보이는 11개 개체를 선발하여(Fig. 2) 종자 저장단백질에 관련된 변이체를 탐색하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(Fig. 3). 변이모본인 신동진의 저장단백질에 있어 SDS-PAGE에서 60 kDa의 waxy의 구분 peptide는 엷게 나타나고 있고(Echt & Schwartz, 1981), glutelin의 전구체 polypeptide 형태로 57 kDa에 나타나고(Yamagata et al., 1982), acidic subunit가 39 ~ 37 kDa에 basic subunit가 20 kDa에 polypeptide 형태로 농도가 강하게 나타났다. 또한 26 kDa에 globulin이 위치하고 있고, 저분자량의 16 kDa에 약하게 알코올 가용성의 prolamin band가 있고 14와 13 kDa에서 같은 정도의 강한 농도로 주된 prolamin의 polypeptide가 형성되고 10 kDa에도 약한 농도로 band가 나타나있다(Bhowmik et al., 1990; Ogawa et al., 1987; Sarker et al., 1986; Tanaka et al., 1980). waxy 계통인 SM-1은 60 kDa의 peptide band가 나타나지 않았고, dull 계통의 SM-4와 SM-5에서는 60 kDa의 peptide band가 약한 정도의 band가 나타났으며, 특히 SM-5에서는 전체적인 단백질의 band 농도가 변이모본보다 진하게 보여 변이모본보다 많은 단백질을 함유한 것을 알 수 있었다. opaque로 분류된 SM-18계통은 glutelin 전구체인 57 kDa에서 진한 농도의 band를 나타냈고 acidic subunit의 39 ~ 37 kDa의 농도는 낮게 보이면서 prolamin의 14와 13 kDa에서도 약한 농도로 나타났다. Kumamaru et al. (1988)이 3,000계통의 돌연변이체에서 SDSPAGE에 의해 4가지 형태의 변이형으로 나누어 보고하였는데 그 중에 57 kDa의 전구체의 량이 증가하면 glutelin의 acidic subunit과 basic subunit는 감소한다고 하였는데, SM-18의 단백질 구성변이형은 이와 다른 새로운 type인 것으로 판단된다. SM-22의 floury 계통은 전분합성과 관련되어 있는 고분자 peptide가 형성되어 있고 55 kDa의 peptide는 거의 없으나, 그 외의 glutelin, globulin, prolamin의 농도는 매우 높게 나타났다. 미립이 쭈그러든(winkled) 형태의 floury 변이체인 SM-23과 이와 유사한 형태이지만 shrunken으로 분류된 SM-26에서 65 ~ 55 kDa의 band패턴은 유사하지만, SM-26의 glutelin acidic subunit의 39 ~ 37 kDa과 16 ~ 10 kDa의 prolamin polypeptide를 형성하는 band는 매우 적은 농도를 나타냈다. sugary 변이체인 SM-31은 60 kDa band에서 높은 농도를 나타났지만, 그 외의 band 패턴은 SM-26과 유사하였다. giant embryo 변이체인 SM-34와 white belly 변이체인 SM-46은 신동진보다 전체적으로 높은 농도의 band 특성을 나타냈고, 특히 SM-34의 prolamin polypeptide인 13 kDa에서 모본보다 높은 농도의 band 특성을 보였다. sugary 변이계통인 SM-51은 전체적인 단백질 농도에서 매우 낮은 정도로 나타났다.

Fig. 2. Cross-sectional stereo-micrographs of whole seeds (brown) of selected endosperm mutants.

Fig. 3. SDS-PAGE gel photograph showing total proteins difference between mutants of rice variety Sindongjin.

 신동진을 모본으로 종실 배유 및 종실형태 계통에서 다양한 단백질 변이를 찾을 수 있었고, 이들 변이는 양적 변이와 분별추출에 의해 나누어지는 구성단백질의 peptide 간 변이체 및 전분합성에 관련된 고분자량의 변이체도 있었다. 특히 배유의 특성변이에 의한 변이체에서 고분자량의 변이는 차후 전분합성의 관련 유전자 탐색, 전분 및 단백질축적 메카니즘 규명 등에 유용한 재료로 이용될 것이라 생각되며, 용매추출에 따른 구성 단백질의 다양한 변이체는 미립 단백질의 양적 개선에 따른 용도와 기능성을 극대화할 수 있는 유전육종의 중요한 재료가 될 것이다.

적 요

 종실 돌연변이를 유기하여 미질개선을 위한 육종으로의 적극적인 활용을 목적으로 얻어진 신동진벼 돌연변이 계통의 작물학적 특성과 종실 저장단백질을 변이모본과 비교 분석을 검토하여 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다.

 1. 종실 변이계통의 작물학적 특성은 변이모본보다 생태특성의 출수기에서는 대부분 조생의 경향을 보였고, 간장 및 수장은 짧은 경향을 나타냈고, 또한 종실특성의 현미 길이, 현미폭 및 천립중에서도 변이모본보다 짧거나 낮은 정도를 나타냈다.
 2. SDS-PAGE 분석결과 opaque 군의 SM-22와 giant embryo 군의 SM-34는 글루테린 폴리펩타이드에서 높은 농도를 보였고, floury 군의 SM-23, shrunken 군의 SM-26, sugary 군의 SM-31은 전단백질 농도패턴은 낮게 보이면서 55kDa 이상의 고분자 band에서 다양성을 나타냈다.

사 사

 본 연구는 농림수산식품부 생명산업기술개발사업(No. 110136-5)에 의해 이루어진 것으로 지원기관에 감사드립니다.