13. 노태환.pdf4.49MB

 벼에 발생하는 세균병 중 벼 흰잎마름병은 벼 잎에 발생하여 광합성의 저해로 벼의 수량 및 미질에 큰 영향을 주고 있다. 본 병은 세계적으로 발생되며, 특히 벼 재배지인 우리나라를 비롯하여 일본, 대만, 필리핀, 인도, 인도네시아 등지에서 발생하여 피해를 주고 있다(Mizukami and Wakimoto, 1969; Mew, 1987). 본 병의 피해는 잎에 감염하여 잎의 조직을 괴사시켜 발생하기 때문에 광합성 부족에 의한 등숙율 저하로 쌀의 수량감소 및 품질의 저하로 나타난다(Ezuka an Kaku, 2000; Ou, 1985; Shin et al., 1992). 또한 벼 잎의 도관부를 중심으로 병원균이 증식하여 피해를 주기 때문에 방제약제의 침투가 적은 이유로 약제방제 효과가 낮아 방제하기가 곤란한 병이다. 따라서 본 병의 가장 효과적인 방제방법은 벼 품종의 저항성을 향상시키는 것이 가장 좋은 것으로 알려져 있으며, 벼를 재배하고 있는 대부분의 국가에서는 저항성 품종육성연구가 주를 이루고 있다(Adhikari et al., 1995; Ezuka an Kaku, 2000; Mew et al., 1993; Mew, 1987; Ogawa et al., 1991). 그러나 병원세균의 다양한 병원성 변이 때문에 진성저항성 품종으로 방제하는 것은 한계가 있다. 최근 국내의 남부지방을 중심으로 벼 흰잎마름병 발생이 지속적으로 증하고 있다. 특히 2002년 2,109 ha에서 2006년 29,485 ha로 14배정도의 급격한 증가 추세를 보이고 있어 이에 대한 근본적인 방제 대책이 시급한 실정이다. 본 병의 효과적인 방제를 위해서는 병 발생을 사전에 예측하여 예방하는 것이 중요하다. 지금까지 본 병의 발생을 예측하기 위하여 박테리오파지를 이용한 포장이나 농수로의 물에서 병원세균의 밀도를 측정하고 있다 (Lee, 1975; Murty and Devadath, 1982; Nino-Liu et al., 2006). 그러나 이러한 방법은 박테리오파지의 균주 특이성 때문에 검출용 병원균의 균주에 따라서 그 결과가 크게 달라지고 (Gill and Abedon, 2003; Goodridge, 2004), 병원균의 밀도를 알고 있어도 병의 만연된 시기와 거의 동시에 측정이 되기 때문에 예찰자료로서 충분하지가 못한 실정에 있다 (Wakimoto and Mew, 1979). 한편 벼 흰잎마름병균의 완전 해독된 유전체 정보를 이용하여 개발된 PCR 검출방법을 이용하여 병원세균의 존재여부를 발병상습포장에서 검출이 가능하여졌다(Lee et al., 2005; Lee et al., 2004; Shim et al., 2012). 이러한 연구결과들은 병원균의 존재여부를 진단하는데 효과적이지만 병원세균의 밀도를 측정하는데 어려운 실정이다. 최근 개발된 Real Time PCR 기술은 병원균의 진단을 하는데 이용하고 있는데 감도가 좋은 것으로 확인 되어 식물의 다양한 병원균 진단에 이용되고 있다(Schena et al., 2004). 따라서 본 연구는 병원세균의 밀도를 실시간으로 측정이 가능한 Real Time PCR을 이용하여 벼가 재배되고 있는 포장에서 병원세균의 밀도를 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 특히 새롭게 개발된 Minor Groove Binder (MGB) probe는 기존의 Taqman probe보다 짧은 probe로 Duplex에 안정적인 것으로 알려져 있다(Kutyavin at al., 2000).

재료 및 방법

 정량 PCR을 이용하여 병원균의 검출을 위하여 Xan_PahgeF & Xan_PahgeR primer를 제작하여 특이성 및 병원세균의 검출 특성을 비교하였다. Primer 제작은 벼 흰잎마름병균의 유전체 정보로부터 탐색된 phage-related integrase 유전자(GenBank: AE013598.1 Region: 637152 ~ 638426, Fig. 1) 염기서열 정보를 이용하여 벼 흰잎마름병균에 특이적이면서 병원세균의 밀도를 정확하게 측정할 수 있는 Xan_PahgeF & Xan_PahgeR primer와 FAM을 이용한 MGB probe를 개발하였다. 본 primer를 제작하기 위하여 ABI Prism primer Express 2.0(Applied Biosystems, USA)을 이용하였다. 정량 PCR 반응액은 Xan_PahgeF (0.9uM), Xan_PahgeR (0.9uM), Xan_Pahge FAM MGB probe (0.25 uM), 2X TaqMan Universal PCR Master Mixture (Applied Biosystems, USA) 12.5μl, 검출용시료 1 μl, D.W 10.25 μl를 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25 μl의 양으로 조제하였다. PCR 증폭반응은 7300 Real Time PCR(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 실시하였으며, PCR반응 조건으로서는 50℃ 2분, 95℃ 10분을 초기설정 온도로 하였고, 95℃ 15초, 60℃ 60초로 40회 반응하였다. 반응 후 CT(Cycle Threshold) 값과 표준농도와 비교하여 검출시료에서 병원균의 밀도가 측정되었다.

Fig. 1. The sequence of phage-related integrase gene of Xoo (¹⁾: forward primer, ²⁾: MGB Taqman probe primer, ³⁾: Reverse primer).

 PCR을 위한 표준농도 설정을 위하여 배양된 병원세균과 병원세균의 genomic DNA를 이용하여 표준농도를 설정하였다. 병원균의 배양은 Nutrient Broth 배지에 18시간 배양하여 OD 0.2(450 nm)를 이용하였다. 병원세균의 DNA 추출은 Quagen(USA)사의 Genomic DNA purification kit을 이용하여 추출하여 병원세균과 비교하여 설정하였다.

 논물 등 자연환경에 존재하는 병원세균을 효율적으로 검출하기 위하여 PCR의 저해인자의 제거 방법으로는 여과지, 증류수 희석, 원심분리를 이용하였다. 증류수 희석배수는 10, 100배액으로 관개수를 희석하였으며, 원심분리는 1,000 μl를 1,000 rpm에서 2분간 원심분리 후 상등액을 다시 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 가라앉은 pellet을 같은 양의 증류수로 희석하여 실시하였다.

결과 및 고찰

 벼 흰잎마름병 Real Time PCR 최적 분석을 위해 TaqMan MGB probe를 이용한 프라이머인 Xan_PahgeF [5'-ATG GCT ACT GCA AGG AGA ATC C-3'] & Xan_PahgeR [5'-GGC ATC CTG AAG GCC TTA GC-3'] 와 Xan_Pahge FAM MGB probe [5'-6FAMTCG CCT GGA GAA CACMMGBNFQ-3']를 벼 흰잎마름병균의 phage-related integrase 유전자 염기서열에서 제작하였다(Fig. 1, 2). Xoo가 가지고 있는 phagerelated integrase 유전자의 염기서열은 NCBI blast 결과 특이성이 확인 되었다. Taqman 이용의 장점은 형광물질인 FAM, TAMRA 등을 이용하여 probe를 제작하여 염기서열의 비특이적인 SYBR Green을 이용하는 것보다 특이성이 높다고 하였다(Schena et al., 2004). 특히 MGB probe는 높은 온도에 안정적이었으며 probe를 짧게 할 수 있는 장점이 있는 것으로 보고되어있다(Kutyavin et al., 2000). 따라서 본 MGB probe프라이머는 본 세균을 진단하는데 특이성을 높이는 것이 되었다고 생각한다. 벼 흰잎마름병 검출용 primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과 벼 관련 세균인Burkholderia glumae, Acidovorax avenae subsp. avenae, Pantoea herbicola, Pseudomonas syringae pv. syringae, 벼 종자 및 논물에서 분리된 12종의 세균 등을 검출하지 않고 벼 흰잎마름병균만 검출되어 그 특이성이 인정되었다(Table 1). 이러한 결과를 바탕으로 다양한 농업환경에서 병원균을 정량적으로 검출하기 위하여 표준밀도를 설정한 결과 DNA 10 ng이 1.14 × 10⁷ cfu/ml로 CT(Cycle Threshold)값의 평균은 16.2 ± 1.2이었고, 세균의CFU(Colony Formation Unit)는 18시간 배양하여 OD(optical density)값을 1.0(600 nm)에서 1.14 × 10⁷ cfu/ml로 CT값은 15.5±1.1이었다. 이렇게 표준농도를 설정하여 각각의 시료를 기준으로 10^-1부터 10^—5까지 희석하여 각각의 농도별 CT값을 구하였다(Table 2, 3). 그러나 CT값은 실험할 때 마다 변화를 보여 가변적인 특징이 있는 것으로 확인 되었다. 세균밀도가 1.14 × 10⁷~ 1.14 × 10³CFU/ml에서 Cell과 DNA에서의 CT값이 클수록 편차가 커지는 경향이었으나, 1.14 × 10²CFU/ml에서는 편차가 작아지는 경향을 보였다. 표준밀도의 설정의 정확도 확인은 표준곡선(Standard Curve)의 R²값이 0.996704로 정확한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다(Fig. 3, 4). 이러한 결과는 Real Time PCR을 이용하여 벼 흰잎마름병균의 밀도측정이 가능하다는 것이 확인 되었다. 이러한 결과는 지금까지 벼 흰잎마름병을 진단하는 방법으로는 일반 PCR 방법을 이용하여 병원균의 감염정도를 확인하였으나(Lee et al., 2005; Lee et al., 2004; Shim et al., 2012) 앞으로는 본 연구에서 개발된 정량 PCR 방법을 활용하면 병원균 존재 뿐만 아니라 밀도까지 측정할 수 있을 것으로 기대된다. 개발된 프라이머를 이용하여 농수로나 벼에서 벼 흰잎마름병균의 밀도를 정량하기 위해서는 PCR 저해인자인 염류 및 미량요소를 제거하고 병원균만 검출해야 효과적인 밀도 측정이 가능하다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 관개수의 희석, 원심분리(10,000 g/10분), 여과방법(여과지)를 이용하여 실험을 수행한 결과 관개수를 증류수로 10배 희석한 것과 원심분리 처리에서 정량 PCR이 저해를 받지 않았다. 그러나 관개수 원액과 여과지를 이용한 것에서는 일부 PCR 증폭이 되었으나, 일부에서는 저해를 받아 증폭되지 않아 10배 희석한 것과 원심분리한 것 보다는 안정적이지 못 하였다(Table 4). 이러한 결과는 시료의 상태에 따라서 달라질 수 있으나 자연환경 시료를 희석하는 방법만으로도 PCR이 가능하다는 것을 확인할 수 있었고, 원심분리시 토양입가 같은 굵은 입자는 작은 원심력으로도 분리할 수 있기 때문에 1,000 rpm에서 1차 분리 후 세균이 존재할 것으로 추정되는 상등액을 다시 10,000 rpm으로 원심분리하여 pellet을 처음과 같은 부피로 희석하면 각종 염류나 미량요소들이 제거되는 것으로 추정된다. 그러나 희석배수가 10^-2인 처리에서 병원균의 밀도를 측정하기 어려운 것은 병원균의 밀도가 너무 낮거나 없는 것으로 추정된다. 또한 여과지를 이용한 방법은 자연시료가 여과지를 통과하면서 PCR 저해인자의 제거와 동시에 흰잎마름병균을 동시에 제거하거나, 남아있는 미량요소들이 그대로 존재하기 때문인 것으로 생각된다. 따라서 PCR저해인자 제거 방법의 결정은 자연에서 채취한 시료의 상태에 따라서 희석 또는 원심분리 방법을 결정해야 할 것으로 생각된다. 최근까지 벼 흰잎마름병의 예찰을 위해서 벼 재배포장이나 관개수로의 물에서 박테리오파지의 밀도를 측정하여 벼흰잎마름병균의 밀도를 간접적으로 측정하였으나 박테리오파지의 균주 특이성으로 인하여 측정결과의 변이성이 크기 때문에 벼 재배포장에서의 정확한 벼 흰잎마름병균의 밀도를 측정하는데 어려움이 많았다 (Gill and Abedon, 2003; Goodridge, 2004). 정량 PCR 방법을 활용하면 포장에서 병원균의 밀도를 정확하게 측정할 수 있을 것으로 생각된다.

Fig. 2. Alignment of phage-related integrase gene DNA sequence.

Fig. 3. The amplification plot of each density of Xoo using real time PCR.

Fig. 4. The Standard curve of Xoo after real time PCR.

Table 1. Species used in this study and result of real time PCR with Taqman primers for detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

Table 2. Standard set up for Real Time PCR.

Table 3. The efficiency comparison cycle threshold between DNA and bacterial cell.

Table 4. The results of Real time PCR each inhibitor removal method from irrigation water.

 이와 같은 연구결과를 기반으로 자연환경 즉 농수로 물, 벼잎, 그루터기 등에서 벼 흰잎마름병균의 밀도를 파악하여 병의 발생을 사전에 예방할 수 있을 것으로 생각된다.