12. 방경환.pdf4.78MB

 인삼(Panax ginseng C. A. Mey.)은 두릅나무과(Araliaceae), 인삼 속 (Panax)에 속하는 다년생 약초로서 아주 오래전부터 우리나라, 중국, 일본 등에서 매우 귀한 한약재로 사용되어져 왔다. 전 세계에 분포하고 있는 인삼 속 식물은 고려인삼을 비롯하여 약 10 여종이 존재하고 있는 것으로 알려져 있는데, 이 중 고려인삼(Panax ginseng C. A. Mey.), 전칠삼(P. notoginseng (Burkill) F. H. Chen), 화기삼(P. quinquefolius L.)의 3종이 그 효능과 가치를 인정받아 한약재 시장에서 널리 활용되고 있다(Wen & Zimmer, 1996).

 고려인삼은 4,500 ~ 5,000년 전에는 민간요법으로 사용되어져왔으나, 옛 소련의 약리학자 Brekhman에 의해 인삼이 함유하고 있는 대표적인 유용물질인 사포닌의 효능이 과학적으로 입증되기 시작하였고(Brekhman & Dardymov, 1969), 그 후로부터는 사포닌을 포함한 다양한 활성성분 탐색 및 효능에 관한 연구가 활발히 진행되어져 왔다. 특히, 고려인삼은 가공방법에 따라 밭에서 수확하여 말리지 않은 상태인 수삼, 수삼을 햇빛이나 열풍에 건조한 백삼, 수삼을 끓인 물에 데쳐서 건조한 태극삼, 수삼을 껍질째 쪄서 건조한 홍삼 등의 다용도로 활용되어져 왔다. 이 중에서도 홍삼은 국내 건강기능식품기능성원료로서 면역력 증진, 원기회복, 혈류 및 기억력 개선의 효능을 인정받고 있으며, 이밖에도 인삼은 항스트레스(Lee et al., 2008), 항암(Shin et al., 2000; Yun et al., 2001), 면역체계 강화(Liu et al., 1995; Kim et al., 2008) 등의 효능이 있는 것으로 보고되고 있다.

 한편, 인삼은 다년생 작물로서 품종을 육성하는데 30여년이 소요될 정도로 육종연한이 긴 약용작물로 알려져 있다. 우리나라 인삼의 품종 육성은 1990년대 후반부터 주로 재배 농가에서 생육이 우수한 개체들을 선발하여 순계분리육종법에 의해 천풍(Kwon et al., 1998), 연풍(Kwon et al., 2000), 고풍(Kwon et al., 2003), 금풍, 선풍, 선원, 선향, 청선의 9품종이 개발되어 품종으로 등록되어있다(국립종자원, www.seed.go.kr). 하지만 아직까지 체계적인 유전자원 관리, 보존 및 활용이 미흡한 실정이며 특히 인삼 유전자원 및 육성 계통에 대한 분자유전학적인 특성 평가 등의 육종에 근간이 되는 기초 기반 연구가 취약한 실정이다.

 20세기 후반부터 눈부시게 발달한 생명공학 기술 개발에 힘입어 식물 유전자원의 분류 및 육종 등에 활용 가능한 다양한 분자생물학적 분석기법 개발을 위하여 단백질, DNA 마커 등이 유용하게 활용되어져왔다. 특히 DNA 마커는 형태적인 특성 및 단백질 마커에 비하여 활용할 수 있는 마커의 수가 제한적이지 않고, 재배환경에 영향을 받지 않는 장점이 있어 최근 게놈프로젝트의 급속한 발전과 더불어 그 연구가 활발히 진행되고 있다.

 DNA 마커를 이용한 분자생물학 연구는 Mullis et al.(1986)에 의해 특정한 DNA를 빠른 시간 내에 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction) 기술이 개발됨에 따라 급속한 발전을 이루게 되었다. 한편, PCR을 기반으로 하는 주요한 DNA 마커로는 RAPD(Random amplified polymorphic DNA) (Williams et al., 1990), SSR(simple sequence repeat) (Harmada et al., 1982; Trautz & Renz, 1984), AFLP(amplified fragment length polymorphism) (Vos et al., 1995), STS(sequence tagged site) (Olsen et al., 1989)등이 있는데, 이러한 분자기법들이 식물의 유전자원 집단, 품종 및 개체 간의 유전분석에 널리 활용되어져 왔다. 이중 RAPD 분석 방법은 template DNA의 양이 적게 소요되고, 실험방법이 편리하며 실험에 소요되는 비용 또한 적어 아직까지도 다양한 유전분석에 꾸준히 이용되고 있다.

 인삼을 대상으로 한 DNA 마커 활용에 관한 연구는 주로 인삼의 종을 구분하기 위해 연구가 진행되어져 왔는데, 유전자의 염기서열이 잘 보존되어 있는 5.8S rDNA와 상대적으로 염기서열의 변이가 존재하는 ITS(internal transcribed spacer)부위를 대상으로 목적하는 실험 대상재료의 염기서열의 차이를 분석하여 왔다(Wen & Zimmer, 1996; Ngan et al., 1999; Fushimi et al., 1997; Komatsu et al., 2001; Yang et al., 2001; Kim et al., 2007). 한편 RAPD 분석방법은 Lim et al.(1993), Shaw and But(1995), Um et al.(2001), Kim & Choi(2003), Shim et al.(2003), Lim et al.(2007)등에 의해서 연구가 진행되어져 왔는데, 이들에 의해서 인삼종간 구분 및 고려인삼 수집종 및 국내산 품종 판별에 관한 연구결과가 보고되었다. 최근에는 STS-CAPS(sequence tagged site-cleaved amplified polymorphic sequence)와 SSR(simple sequence repeat) 마커를 이용한 인삼 품종 판별에 관한 연구도 진행되고 있다(Bang et al., 2010; 2011a; 2011b).

 이처럼 인삼을 대상으로 진행되어온 DNA 마커 개발에 관한 연구는 주로 인삼 속에서 다른 종들 간의 구분에 관한 연구와 인삼 품종 구분을 목적으로 연구가 진행되었지만, 아직까지 인삼 품종 육성의 전 단계인 육성 계통을 대상으로 한 유전분석 연구는 진행된 바 없다. 따라서 본 연구는 RAPD분석방법을 이용하여 인삼 품종 및 계통의 유전적 다양성을 조사하고, 또한 유전적 구별성과 균일성을 확인하여 종자순도 향상과 향후 교배모본 선정 시 활용할 수 있는 유전육종의 기초자료를 얻기 위하여 수행하였다.

재료 및 방법

1. 시험재료

 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부의 재배포장에서 육성중인 G04009 등의 20계통과 고려인삼 천풍 등의 4품종을 대상으로 하였으며, 인삼의 년근은 4년생을 기준으로 하였다(Table 1). 인삼 육성 계통은 2004년에 여주를 비롯한 인삼 재배 지역에서 선발하여, 4년을 한 세대로 하여 3세대를 진전시켰으며, 인삼 재배, 병해충 방제 및 기타 관리는 인삼 GAP 표준재배지침서에 준하였다(RDA, 2009).

Table 1. Information of four Korean ginseng cultivars and twenty breeding lines used in this study.

2. DNA 추출 및 정량

 Genomic DNA를 확보하기 위하여 4년생 잎을 채취하여 세척한 후 액체질소로 급랭시켜 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 다음 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)을 이용하여 Protocol에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel에서 Lambda DNA(Promega)와 함께 전기영동한 후, EtBr(Ethidium Bromide)로 염색하여 UV transilluminator에서 DNA band의 밝기를 상대 비교하여 농도를 측정하였다. 농도 측정이 완료된 각각의 DNA샘플들은 멸균된 증류수를 이용하여 최종 DNA농도를 5 ng/μl로 정량하였다.

3. STS 마커를 이용한 분석

 RAPD 유전분석 시 사용되는 인삼 품종과 계통들의 샘플에 대한 대표성을 확보하기 위하여, Bang et al.(2010)과 Lee (2010)에서 제작한 8종의 STS marker를 이용하여 유전분석을 수행하였으며, 8종의 마커는 다음과 같이 제작되었다. methylation-filtered library와 methylation-unfiltered library를 각각 구축한 후, 두개의 library로부터 확보된 clone들을 sequencing하여 염기서열을 확보하였고 blast search 등을 통하여 시퀀스를 분석한 후 STS primer를 제작하였다. 200여개 이상의 STS primer를 인삼품종 판별에 적용한 결과로서 Fig. 1과 같이 8개의 다형성을 갖는 primer를 선발하였다.

Fig. 1. Amplification products of the STS marker system on Korean ginseng breeding line. (A) MFGp183A, (B) MFGp130A, (C) MFGp110A, (D) UFGp74, (E) UFGp163,(F) MFGp108, (G) MFGp81A, (H) UFGp156. Lanes 1-20 : discrimination of breeding lines in Table 1.

 PCR에 사용된 혼합용액의 조성은 genomic DNA 약 5 ng/μl, primer 20 pmole, 2.5 mM MgCl₂, 0.25 mM dNTPs, 0.5 UTaq polymerase(Neurotics, Deajeon, Korea)로 총 반응액의 volume은 25 μl이었다. DNA 증폭기기는 Tprofessional thermocycler(Biometra, Gottingen, Germany)을 이용하였고, PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 또는 65℃ 30초 결합 및 72℃ 1분 신장의 조건으로 총 40 cycles를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 신장 반응을 수행하였다. MFG 110와 UFG 74 primer는 PCR을 수행한 후 37℃에서 5시간 동안 HinfI의 제한효소를 처리하였다. 그 후 0.5X TBE buffer를 사용하여 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 EtBr(Ethidium Bromide)로 염색한 후 UV transilluminator로 유전양상을 확인하였다.

4. RAPD 마커를 이용한 분석

 RAPD 분석은 Operon Technology Inc.에서 제작된 130개의 primer를 이용하여 유전분석을 수행하였다. PCR 에 사용된 혼합용액의 조성은 genomic DNA 약 10 ng/2 μl, primer 30 pmole, 2.5mM MgCl₂, 0.25mM dNTPs, 0.5U Taq polymerase(Neurotics, Deajeon, Korea)으로 총 반응액의 volume은 30 μl이었다. DNA 증폭은 Tprofessional thermocycler(Biometra, Gottingen, Germany)를 이용하였고, PCR 반응은 95℃에서 3분간 초기변성 후, 95℃ 5초 변성, 45℃ 30초 결합 및 72℃ 1분 신장의 조건으로 총 35 cycles를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 DNA products는 0.5 X TBE buffer를 사용하여 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 EtBr(Ethidium Bromide)로 염색한 후 UV transilluminator로 유전양상을 확인하였다.

5. 통계처리를 통한 유연관계 분석

 증폭된 PCR 산물의 분석은 band가 있는 것을 “1” 없는 것을 “0” 으로 하여 data matrix를 작성하였으며, 유전적 다양성 및 유전적 거리를 산출하기 위하여 POPGENE software(version1.31) (Yeh et al. 1997)를 이용하여 분석하였다. 또한 UPGMA(Unweighed Pair Group Method using Arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하여 유연관계를 비교분석하였다.

결과 및 고찰

1. STS 마커를 이용한 분석

 Bang et al.(2010)과 Lee(2010)는 인삼 주요 품종들을 구분하기 위하여 genomic DNA 라이브러리 구축을 통해 인삼 품종 판별에 유용한 8종의 STS primer를 선발하였다. 이중 4개의 primer(MFGp130A, MFGp183A, MFGp81A, UFGp156A)는 InDel(Insertion or Deletion) variation에 의한 다형성을 나타냈고, 2개의 primer(MFGp110A, UFGp74)는 단일염기서열다형성(Single Nucleotide Polymorphism)이었으며, 2개의 primer(UFGp163, MFGp108)는 DNA 단편의 증폭 유무를 나타내는 우성마커 라고 하였다. 결론적으로 총 8종의 STS primer를 이용하여 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선운, 선원의 고려인삼(Panax ginseng C. A. Mey.) 6품종과 화기삼(P. quinquefolius L.)을 구분할 수 있다고 보고하였다.

 본 실험에서는 8종의 STS primer를 이용하여 인삼 1 계통 당 10개의 식물체를 대상으로 유전분석을 수행하여 계통의 균일성을 검정하였는데, G04012 등 일부 계통의 경우 10개체 중 일부 개체가 유전적으로 균일하지 않아 실험 대상에서 제외하여, 유전적으로 균일한 샘플들만을 RAPD 분석에 활용하였다. Fig. 1은 계통의 균일성 검정을 통하여 대표성이 확보된 샘플을 대상으로 8종의 STS primer를 이용하여 유전분석을 수행한 결과로써, 20계통 간에 유전적인 차이가 있음을 1차적으로 확인할 수 있었다. 하지만 G04012 등 5계통은 STS primer를 이용하여 1차로 확인했음에도 불구하고 증폭된 DNA 밴드 양상이 Hetero로 나타나, 유전적으로 완전히 고정되지 않은 것으로 판단되었다. 따라서 향후 이들 계통에 대한 유전분석을 통해 유전적으로 고정된 재료 육성을 위한 일들을 지속적으로 해나가야 할 것으로 사료된다.

2. RAPD 마커를 이용한 분석

 130개의 RAPD primer를 사용하여 인삼 우량계통 및 품종을 대상으로 PCR을 수행한 결과, polymorphism을 나타내는 70개의 primer를 1차적으로 선발하였다. 1차로 선발된 primer중 재현성이 있으면서 polymorphism이 높은 primer를 탐색한 결과 최종적으로 25개를 선발하였다. 최종 선발된 프라이머를 이용하여 인삼 계통 및 품종을 대상으로 유전분석을 수행한 결과, 증폭된 총 band수는 189개이었고, 증폭된 DNA 단편 크기의 범위는 100 ~ 2,800 bp 이었다(Table 2). 각 primer에 의해 증폭된 DNA 단편의 수는 최소 3개에서 최대 17개로 다양하였으며, primer 한 개당 평균 7.6개의 DNA 단편이 증폭되었다. 24개의 인삼 계통 및 품종에서 polymorphism을 보이는 DNA 단편의 수는 136개(71.9%)이었으며, 그렇지 않은 DNA 단편은 53개(28.1%)이었다. OPA5, OPB8, OPE20 및 OPF2 primer를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 미국에서서 수집하여 육성된 계통인 G04116에서만 다른 19계통 및 4품종과 구별되는 특이적인 유전양상을 보였다(Fig. 2).

Table 2. RAPD primers amplifying polymorphic bands among 4 Korean ginseng cultivars and 20 breeding lines and their marker information.

Fig. 2. Polymorphic band patterns with OPA5(A), OPB8(B), OPE20(C) and OPF2(D) primers. Lanes 1-24 : discrimination of Korean ginseng breeding lines and cultivars in Table 1. White arrows indicate examples of polymorphic bands.

 한편, 국내외 인삼시장에서 국내산 고려인삼은 중국, 캐나다, 미국 등에서 생산되는 화기삼에 비하여 가격이 높아서, 외국산이 국내산으로 둔갑하여 부정 유통될 수 있는 가능성 높아, 이러한 문제를 사전에 예방하기 위한 과학적인 판별기술 개발이 시급한 실정이다(Park et al., 2006, Kim et al., 2007). 따라서 본 연구 수행을 통해 선발된 OPA5를 비롯한 4종의 primer는 우리 고려인삼 품종 및 육성계통들을 미국삼과 구분하는 목적에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

 또한 다른 RAPD primer들을 이용하여 인삼 계통 및 품종간에 특이적으로 나타난 DNA banding pattern을 비교해 본 결과, Fig. 3과 같이 특정한 계통 및 품종에서만 나타나는 특이적인 유전양상을 확인할 수 있었다. OPA2 primer를 이용한 유전분석 결과, 약 1,300 bp에서 인삼 품종인 고풍에서만 특이적인 DNA 단편이 관찰되었고, G04009에서는 약 800 bp의 DNA 단편이 증폭되지 않았으며, G04116은 약 950 bp정도에서 특이적인 유전양상이 나타났다. OPA19 primer에서는 약 2,000 bp에서의 DNA 단편의 증폭 유무로 2개의 유전양상이 나타남을 확인하였는데, 4품종 중 연풍에서만 2,000 bp에서 DNA 단편이 관찰되어 이 primer로 연풍을 구분할 수 있음을 알 수 있었다. 한편, OPD19 primer를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 다양한 유전양상을 확인할 수 있었는데, 결과적으로 5개의 유전양상이 관찰되었으며 약 500 ~ 1,300 bp의 특이적인 DNA 단편들로써 품종 및 계통들을 구분할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 3. Polymorphic band patterns obtained with OPA2(A), OPB19(B), OPC14(C) and OPD1(D) primers. Lanes 1-24 : discrimination of Korean ginseng breeding lines and cultivars in Table 1. White arrows indicate examples of polymorphic bands.

Fig. 4. Polymorphic band patterns obtained with OPD19(A), OPD20(B), OPE1(C) and OPH3(D) primers. Lanes 1-24 : discrimination of Korean ginseng breeding lines and cultivars in Table 1. White arrows indicate examples of polymorphic bands.

 선발된 프라이머별 대립인자는 최소 1.33에서 최대 2.00의 범위였고, 평균 1.71이었다. 프라이머별 유전적 다양성을 추정한 결과, Nei의 유전적 다양성은 전체 평균이 0.085로 나타났으며, OPD15가 0.247로 가장 높았고, OPF2가 0.013으로 가장 낮은 값을 나타내었다. 또한 Shannon’s Index 값도 Nei의 유전적 다양성 값과 비교해 수치간의 차이는 있으나 동일한 경향을 나타내었다. Shannon’s Index 값은 전체 평균이 0.161로 나타났으며, OPD15가 0.410으로 가장 높았고, OPF2가 0.029로 가장 낮은 값을 나타내었다(Table 3).

Table 3. Genetic diversity within Korean ginseng cultivars and breeding lines.

 본 연구에서 분석에 이용된 25개의 RAPD primer 중에서 OPD15, OPD19, OPB5, OPA19등은 인삼 품종과 계통에서 비교적 높은 수의 대립단편과 높은 유전적 다양성 값을 나타내는 primer이었으며, 반면에 OPF2, OPH3등은 비교적 낮은수의 대립단편과 낮은 유전적 다양성 값을 나타냈다. Table 4는 계통간의 유전적 거리를 Nei의 공식에 따라 구한 것으로 24개의 품종 및 계통의 유전적 거리는 0 ~ 0.91 범위로 분포하였다. G04046과 G04076이 유전적 거리가 가장 가까웠고, G04090과 G04116이 유전적 거리가 가장 멀었으며, 미국에서 수집하여 육성된 G04116 계통은 모든 품종 및 계통과 유전적거리가 멀었다. G04116을 제외하고 국내 계통 및 품종의 유전적 거리는 0 ~ 0.094의 범위로 근연의 특성을 나타내었다. 유사도 계수 0.98을 기준으로 품종 및 계통 24개의 군집분석을 한 결과, 인삼 품종 및 계통을 2그룹으로 분류할 수 있었는데, I그룹에는 고풍과 G04012 등의 11계통(50%)이, II그룹에는 G04021 등의 3계통(1.3%)이 포함되었다(Fig. 5).

Table 4. Matrix values of genetic similarity and genetic distance of Korean ginseng cultivars and breeding lines by RAPD analysis.

Fig. 5. Dendrogram of genetic similarity among Korean ginseng cultivars and breeding lines constructed on the data obtained with 25 RAPD primers.

 25개의 RAPD 프라이머를 이용한 유전분석 결과를 종합하여보면, 유사도가 같은 G04046과 G04076의 2계통을 제외한 22개의 품종 및 계통을 구분할 수 있었으며, 구분되는 계통 및 품종 중에서도 G04009, G04026, G04069, G04084, G04086, G04116의 6계통 및 천풍, 연풍, 금풍의 3품종은 확실하게 구분되는 결과를 보였다.

 우리나라에서 현재 재배되고 있는 고려인삼(P. ginseng C. A. Mey.)은 다른 작물에 비해 유전적인 다양성이 매우 작은 약용작물로 보고되고 있다(Lim et al., 1993; Choi et al., 2003; Bang et al., 2011b). 본 연구결과에서도 인삼 품종 및 계통의 유전적인 다양성이 매우 작게 나타나 이에 대한 대응책 마련이 필요한 실정이다. 우리 고려인삼의 유전적인 다양성을 높여 이로부터 다양한 신품종을 육성하기 위해서는, 우선 국내외에서 다양한 유전자원을 확보하여 유전적 pool을 높여야 할 것이며, 이들 유전자원들로부터 유용한 형질을 지닌 유망 계통을 선발하기 위한 DNA 마커, 물질분석 등의 과학적인 선발지표 마련이 필요하리라 판단된다. 결론적으로 본 연구를 통해 도출된 연구결과는 추후 지속적인 마커 개발과 차별화된 물질 탐색 등의 상호보완적인 연구 수행을 통하여, 인삼 품종 육성 시 유망 계통들의 유전적 구별성, 균일성 및 차별성 확보와 교배모본 선정 시에도 활용하는 등 인삼 육종의 기반 기술로 유용하게 활용할 예정이다.