12.유전자변형.pdf8.22MB

 전 세계적으로 유전자변형(Genetically Modified: GM) 작물은 2011년 1억 6,000만 헥타르가 재배되어 처음 상업적인 재배해인 1996년보다 무려94배가 증가하였고, 25작물 196품목의 GM작물이 상업화 승인된 것으로 국제생명공학응용정보서비스(ISAAA)는 보고하고 있다(James 2012). 국내에서는 상업화와 재배가 승인된 GM작물은 아직 없으나, 벼, 토마토, 감자, 콩, 고추, 배추, 들깨 등 경제적 가치가 큰 주요 작물을 대상으로 유용 GM작물들이 개발되고 있으며 안전성평가를 통한 실용화 연구를 수행하고 있다(Shin et al., 2010; Woo et al., 2006). 특히, 중요한 에너지원이고 주식으로 이용되는 벼(Oryza sativa)를 대상으로 생명공학작물의 개발이 집중적으로 이루어지고 있다.

 벼는 우리나라를 비롯하여 동남아시아 국가의 주요 농산물 중 하나로 재배면적이나 생산량 및 소비량에 있어서 가장 우위를 차지하고 있다. GM벼의 개발은 미국, 일본, 중국, 인도 및 우리나라에서 활발하게 이루어지고 있다. 벼 형질전환체는 Toriyama 등(1988)에 의해서 최초 개발됨으로써 농업생명공학 분야에 큰 관심을 일으키며 연구가 시작되었다. 지금까지 세계적으로 다양한 GM벼가 개발되었고, 대표적으로 Bayer CropScience사의 제초제저항성의 LLRICE 62 및 관련 event, 중국 Huazhong대학이 개발한 해충저항성의 Shanyou63, 일본농업과학원(NIAS)에서 개발한 꽃가루 알레르기 저항성의 7Crp#10 GM벼 등이 규제당국으로부터 승인되었다(ISAAA Database, http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/). 또한 유아 및 아동의 비타민A 결핍 문제를 극복하기 위한 방안으로 황금쌀(Golden Rice)이 개발되었고(Paine et al., 2005; Ye et al., 2000), 머지 않아 개발도상국가에서 필요하다면 공급이 가능할 것이다. 한편, 이와 같이 비타민과 미네랄 또는 의약품과 백신 등 기능성을 갖는 GM작물 개발은 해충 및 제초제저항성의 농업적 편의를 제공한 1차 GM작물에서 벗어나 인간의 건강에 직접적인 이익을 주는 GM작물의 시대를 열고 있다.

 GM작물의 상업화를 위해서는 환경위해성 및 인체안정성평가가 요구되고 있으며, 국내에서는 ‘유전자변형농산물의 환경위해성평가 심사지침(농림축산부고시, 2002-2호)’ 규정에 따라 상업화를 추진하도록 하고 있다. 이의 심사지침 중 별표 2의 8항의 내용에는 도입 유전자에 대한 분자생물학적 분석, 도입 유전자의 검출 및 발현의 확인, 유전자변형 농산물에 대한 검정방법 등을 명시하도록 하고 있다. 또한 GM 작물의 환경위해성평가 심사는 사례별(case-by-case)로 다루어지고 있으며, 심사에 제출되는 각 품목에 대해서 해당 자료가 마련되어야하기 때문에 각각의 GM 작물에 대한 검정방법 확립은 중요한 사안이고, 검정법 개발은 GMO (Genetically Modified Organism)의 비의도적 환경방출에 따른 안전성 확보를 위한 사후모니터링 기술의 적용에 필수적이라 할 수 있다(Rho et al., 2004; Shin et al., 2012).

 GMO의 주요 검정방법으로는 도입유전자의 DNA를 검출하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)이 국제표준분석법으로 추천되고 있으며, 분석법으로 도입된 T-DNA내의 유전자를 검출하는 스크리닝(screening), 유전자 특이(gene specific) 및 구조 특이(construct specific) 방법과 외래유전자가 삽입된 염색체 게놈내의 삽입 인접염기서열 및 TDNA염기서열을 바탕으로 분석하는 이벤트 특이(eventspecific)방법을 들 수 있다(Pan et al., 2006; Taverniers et al., 2005; Yang et al., 2005). 특히, 이벤트 특이 방법은 도입유전자가 삽입되어 새롭게 형성된 특정 염기부위를 검출하기 때문에 각 형질전환체의 계통간 구별이 가능하고, 교배에 의해 파생된 개체의 모본을 쉽게 파악할 수 있어 GMO 모니터링 및 이력추적에 용이하다. 따라서 최근 GM작물의 PCR검출방법으로 권장되고 있다(Querci et al., 2007; Su et al., 2011; Zhang & Guo, 2011).

 최근 국내에서는 벼 유래의 Choline kinase 유전자(OsCK1)를 과발현하도록 형질전환하여 벼도열병과 벼흰잎마름병에 저항성을 나타내는 병저항성 GM벼로 개발하였고(Lee et al., 2007), 실용화를 위한 작물로 개발하고자 환경위해성 영향평가 연구를 수행하고 있다. GM작물은 안전한 사후관리를 위해서 도입유전자에 대한 해당 이벤트(event)의 검출법이 요구되고 있으나, 현재까지 OsCK1 유전자를 도입한 GM벼의 PCR 검정분석법은 개발되어 있지 않다. 따라서 본 연구는 병저항성(OsCK1) GM벼에 대한 검출 특이마커를 도출하여 정성 PCR 및 이벤트 특이 정량 real-time PCR 검정법을 개발하였다.

재료 및 방법

식물재료 및 DNA 추출

 본 실험의 병저항성 벼는 벼 유래의 OsCK1 유전자를 벼에 형질전환하여 식물체 내에서 과다발현시켜 벼흰잎마름병 및 벼도열병에 대한 저항성을 높게 한 GM벼(OsCK1 GM벼)로 농촌진흥청에서 개발하였으며 non-GM 낙동벼와 같이 Oryza sativa L., Japonica 종이다. 우수선발계통 LS28-30-32-20을 OsCK1 GM벼의 이벤트로 선정하여 실험을 수행하였으며, 동일한 형질전환 운반체(Fig. 1)로 형질전환하여 얻어진 계통들을 대조구로 사용하였다. 또한, 옥수수, 배추, 콩, 감자, 고추, 상추, 토마토, 들깨, 피망, 가지 등 non-GM작물을 PCR 특이성 확인을 위한 대조구로 이용하였다.

Fig. 1. Schematic diagram of the transferred DNA (T-DNA) into disease resistant GM rice (A), and nucleotide sequences between the rice genome and the integrated T-DNA (B). Underlined letters in B represent the flanking genomic sequences and non-underlined letters show the T-DNA sequences of right border region. RB: right border; MAR: matrix attachment region; P-actin: rice actin promoter; OsCK1: choline kinase gene; PinII: potato proteinase inhibitor II gene; P-35S: CaMV 35S promoter; bar: phosphinothricin acetyltransferase gene; T-nos: A. tumefaciens nopaline synthase poly A; LB: left border.

 식물체의 게놈 DNA추출을 위해서 벼 종자는 Planetary Mono Mill Pulverisette 6 (Fritsch, Germany)로 분쇄하였고, 각 작물 시료는 잎조직 1 g씩을 취하여 막자 사발에 액체질소를 넣어 분말화 한 후, DNeasy Plant kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc. USA)를 이용하여 260/280 nm 값이 1.7 ~ 2.0 사이인 DNA액을 각 실험의 주형DNA로 사용하였다.

검출 primer 및 probe 제작

 OsCK1 GM벼의 검출을 위해서 벼 염색체에 삽입된 TDNA의 유전정보를 바탕으로 구조 특이(construct-specific) primer쌍을 제작하였고, 선발계통 LS28-30-32-20만의 특이적인 검출이 가능하도록 도입 T-DNA와 벼 염색체 DNA사이의 삽입 인접염기서열(Fig. 1)을 바탕으로 이벤트 특이(eventspecific) primer를 제작하였다. 벼 내재유전자의 검출 primer는 SPS (sucrose-6-phosphate synthase) 유전자의 염기로부터 작성하였다. 본 실험의 SPS 유전자는 벼 염색체 내에 단일 copy 유전자로 존재하고 PCR 검정의 내재유전자로 이용되고 있다(Ding et al., 2004). 또한, 정량 real-time PCR 검정분석을 위해서 SPS 내재유전자 및 OsCK1 GM벼 이벤트의 5’ 삽입 인접염기서열 부위에 대한 primer 및 TaqMan probe를 제작하여 사용하였다. 본 실험에 이용된 정성 PCR 및 정량 realtime PCR을 위한 primer 및 probe의 염기서열을 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Sequences of primers and probes used in this study.

정성 PCR 분석

 본 실험의 정성 PCR 분석은 AccuPower® Multiplex PCR PreMix (containing Hotstart Top DNA polymerase, Reaction buffer and dNTPs; Bioneer, Korea)를 사용하였으며, 시료 당반응액을 총 20 μL로 하고, 각 10 μM의 forward 및 reverse primer와 50 ng/μL의 template DNA를 첨가하여 PCR반응을 수행하였다. PCR반응조건은 이용하였고, 초기 95℃에서 10분간 실시한 후, 95℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 1분을 총 35 cycle 반복하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 5분간으로 하여 TProfessional Thermocycler (Biometra, Germany)에서 DNA 증폭반응을 수행하였다. 증폭된 PCR산물은 전기영동 장치를 이용하여 2% agarose gel 상에 전개한 후 UV로 전개된 반응산물의 밴드를 확인하였다.

표준plasmid 제조 및 real-time PCR 분석

 OsCK1 GM벼의 정량 real-time PCR 분석을 위해서 표준 plasmid의 제작은 도입유전자에 대한 이벤트 특이primer 쌍 (CKRB-1/CKRB-2) 및 벼 내재유전자 primer 쌍(RiSPS05-1/ RiSPS05-2)을 이용하여 PCR 증폭산물(amplicon)을 얻은 후, 제한효소 SmaI 또는SrfI의 인식부위(CGGGCCCG)를 부여한 프라이머를 이용하여 서로 연결하고, pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 삽입하여 표준plasmid를 제작하였다. 이후, Escherichia coli DH5α (RBC Bioscience, Taiwan)에 cloning하여 배양하고 다량의 plasmid DNA를 추출하여 정량PCR분석의 표준물질(reference molecule)로 사용하였다.

 배양균으로부터 추출한 표준plasmid를 real-time PCR 분석의 표준물질로 이용하기 위해서, 먼저 제한효소 SmaI을 처리하여 선형화 시킨 후, ColE1/TE DNA (Nippon Gene Co. Japan)로 단계별 농도(2.0 × 10⁷, 2.0 × 10⁶, 2.0 × 10⁵, 2.0 × 10⁴, 2.0 × 10³, 2.0 × 10², 2.0 × 10¹ 및 1.0 × 10¹ copy)로 희석하여 사용하였다. Real time-PCR 반응액은 각 1.25 μM primer 및 0.5 μM TaqMan probe 혼합액을 Brilliant II QPCR Master Mix (Agilent Technologies, USA)와 반응 전에 1 : 1.25의 비율로 조제하여 사용하였다. Real-time PCR 반응은 Master Mix/primer/probe 혼합액에 template DNA (50 ng/μL)를 첨가하여 총 20 μL 반응액으로 하고 Stratagene Mx3005P system (Agilent Technologies, USA)을 이용하여 초기 95℃에서 10분간 실시 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 총40 cycle을 수행하였다. 시료는 내재유전자 및 도입유전자에 대하여 각각 반응을 실시하였고, 대조구는 시료 DNA를 넣지 않은 음성 대조구(NTC, no template control)로 ColE1/TE DNA를 첨가하여 수행하였다. Real time-PCR 분석은 시료 당 3반복으로 분석하였다.

 제작한 표준plasmid에 대한 real-time PCR정량분석의 정밀성 및 정확성 확인은 표준물질을 단계별 희석하여 얻어진 내재유전자 및 도입유전자의 각 표준곡선(Standard curves)을 이용하여 산출하였다. 표준plasmid 대한 real-time PCR 분석의 보정계수(Cf, Conversion factor) 및 시료의 GMO 정량 확인은 OsCK1 벼 이벤트 종자로부터 100, 10, 5, 3, 1 및 0.5% DNA 시료를 조제하여 수행하였으며, 보정계수는 내재유전자의 수에 대한 도입유전자의 수의 비로 계산되었고, GMO의 혼입율(%)은 다음 식을 이용하여 산출하였다(Kuribara et al., 2002).

PCR 산물의 염기서열 분석

 PCR 증폭산물의 염기서열 분석은 전기영동을 통해 agarose gel상에 전개된 PCR산물을 취하여 Gel Extraction kit (Qiagen, USA)로 정제하고 pGEM-T easy vector에 삽입한 후, Escherichia coli strain DH5α로 형질전환하여 얻어진 plasmid DNA로부터 염기서열을 확인하였다.

결과 및 고찰

병저항성(OsCK1) GM벼에 대한 primer의 특이성 확인

 최근, 병저항성을 나타내는 OsCK1 유전자를 벼에 형질전환하여 병저항성GM벼가 개발되었고, 재료평가 및 안전성평가의 관련시험을 수행하고 있다. GM작물의 실용화를 위해서는 환경 및 식품위해성평가를 수행해야 하고, GM작물의 안전한 관리 및 이력추적을 위해서 해당 이벤트(event)의 검출방법이 요구되고 있기 때문에OsCK1 GM벼의 PCR 검정을 위해서, 벼내재유전자, 도입유전자 및 삽입 인접염기서열을 바탕으로 유전자 특이적(gene-specific), 구조 특이적(construct-specific) 및 이벤트 특이적(event-specific)인 각종 primer를 제작하였다(Table 1).

 벼 내재유전자 및 OsCK1 GM벼의 검출을 위한 각 primer 쌍의 특이성 확인을 위해서 벼(Oryzae sativa L.)을 포함하여 옥수수(Zea mays L.), 배추(Brassica rapa), 콩(Glycine max L.), 감자(Solanum tuberosum L.), 고추(Capsicum annuum L.), 상추(Lactuca sativa L.), 토마토(Lycopersicon esculentum), 들깨(Perilla frutescens), 피망(Capsicum annum var. angulosum), 가지(Solanum melongena L.) 등 11종의 작물로부터 분리한 게놈 DNA를 template로 하여 PCR을 수행한 결과, 벼 내재유전자 검출 primer쌍(RiSPS04-1/04-2)은 예상된 벼 식물체에서만 115 bp 크기의 PCR 산물을 증폭하였으며, OsCK1 GM 벼에 대한 유전자 특이(LSCK-1/-2), 구조 특이(ActCK-1/-2) 및 이벤트 특이 primer (CKRB32-1/02-2)는 해당 GM벼에서 각각 134, 306 및 243 bp의 뚜렷한 증폭산물을 형성하였다(Fig. 2). 반면 다양한 작물들에 대해서는 어떠한 비특이적인 PCR 반응산물을 나타내지 않았다. 이러한 각각의 PCR 산물들은 DNA sequencer의 염기서열 분석을 통해서 각각의 목적염기서열임을 확인하였다. 따라서, 본 실험에서 제작한 각종 primer쌍이 OsCK1 GM쌀의 PCR 분석을 위한 특이적인 검정 마커로 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 2. Specificity analysis of the gene-, construct-, and eventspecific primer pairs for disease resistant GM rice and various non-GM crops. PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel. (a): LSCK-1/-2; (b): ActCK-1/-2; (c): CKRB32-1/02-2; (d): RiSPS04-1/-2 primer pairs. Lane M: 100bp DNA ladder, lane 1: non-GM nakdong rice; lane 2-3: disease resistant GM rice; lanes 4-13: non-GM crops (maize, Chinese cabbage, soybean,potato, papper, lettuce, tomato, perila, pumpkin, and eggplant, respectively); lane N: no template control.

동일 유전자 형질전환 계통에 대한 primer 특이성 확인

 일반적으로 동일의 유전자 발현벡터를 이용하여 작물에 형질전환을 수행하게 되면 많은 형질전환체를 얻게 된다. 이렇게 얻어진 형질전환 개체들은 동일의 유전자가 게놈내로 도입되지만, 게놈 상 각기 상이한 위치에 목표유전자가 삽입되어 서로 다른 계통이 된다. GM작물의 검정에 있어서 외래로부터 동일한 유전정보가 삽입된 이러한 계통들에 의해서 GMO 판별에 어려움이 발생한다. 특히, 상업화 GMO의 경우 동일 유전자를 갖는 다른 계통의 GMO 또는 미승인 GMO 검정의 오류는 경제적, 사회적 손실을 발생시킬 수 있다. 최근, 게놈상의 도입유전자의 삽입 인접염기서열을 이용함으로써 각 계통에 대한 구분이 가능하다(Querci et al., 2007; Su et al., 2011; Zhang & Guo, 2011; Yang et al., 2005). 따라서, 본 실험에서는 OsCK1 GM벼의 지속적인 사후관리 및 이력추적을 위해서 도입유전자의 삽입 인접염기서열을 바탕으로 primer를 제작하였고, 이들 이벤트 특이 primer에 대한 특이성을 확인하고자 동일 형질전환 벡터로 유도된 GM벼 계통들에 대하여 유전자 특이 및 구조 특이 primer와 비교 분석하였다.

 이벤트, LS8-30-32-20는 이벤트 특이 primer쌍(CKRB32-1/02-2)을 이용한 PCR 분석에서 예상된 243 bp의 증폭산물을 명확하게 나타내었으나, 이벤트와 동일한 벡터로 형질전환된 3개 계통들에서는 어떠한 PCR 산물도 형성되지 않았다. 반면 유전자 특이(LSCK-1/-2) 및 구조 특이 primer쌍(ActCK-1/-2)을 이용한 경우에는 이벤트 및 그 외 계통 모두에서 각각 134, 306 bp의 PCR 증폭산물을 형성하여 계통간 특이적인 구분을 보이지 않았다(Fig. 3). 본 결과는 이벤트 특이 primer가 향후 OsCK1 GM벼의 실용화 또는 재배에 따른 환경 방출 시 GMO 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있음을 나타내고 있다.

Fig. 3. PCR amplification using the gene-, construct-, and eventspecific primer pairs for disease resistant GM event line and other disease resistant GM lines. PCR products were electrophoresed on 2% agarose gel. (a): LSCK-1/-2; (b): ActCK-1/-2; (c): CKRB32-1/02-2; (d): RiSPS04-1/-2 primer pairs. Lane M: 100bp DNA ladder, lane 1: non-GM nakdong rice; lane 2-3: disease resistant GM rice LS28-30-32-20 line; lanes 4-5: LS28-3-33-2, LS28-13-39-1, and LS28-18-33-1 line, respectively; lane N: no template control. Disease resistant rice lines were transferred with the same construct vector as that of LS28-30-32-20.

정성 duplex PCR의 민감도 측정

 OsCK1 GM벼 LS8-30-32-20 계통은 Fig. 1에서 보는 바와 같이 OsCK1 유전자 및 bar 유전자를 갖는 벡터로 이루어져 있고, 게놈 내 삽입 인접염기서열 분석을 통해 right border (RB) 부위의 염기가 밝혀졌다. 따라서 해당 이벤트에 대한 특이적인 검출을 위해서 RB부위의 T-DNA 및 게놈 DNA 사이의 염기서열에 대한 특이 primer를 제작하였고 검출 특이성이 확인되었다. 이의 primer쌍과 벼 내재유전자의 primer쌍을 이용하여 OsCK1벼 이벤트의 template DNA 농도 별 duplex PCR을 실시하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Sensitivity detection of disease resistant GM rice using duplex-qualitative PCR. PCR analysis was carried out with a mixture containing CKRB32-1/02-2 and RiSPS04-1/-2 primer pairs. Lane M: 100bp DNA ladder; lanes 1-9:100, 10, 5, 3, 1, 0.5, 0.1, 0.05, and 0.01% of GM rice; lane 10: 50 ng of non-GM nakdong rice; lane N: no template control.

 각 primer쌍의 PCR 산물로 OsCK1 GM벼 이벤트에 대한 243 bp와 벼 내재유전자의 115 bp의 PCR 산물을 동시에 얻을 수 있었고, 100 ~ 0.05% 농도에서 OsCK1 GMO의 검출이 가능하였다. 따라서 이벤트 특이 primer쌍, CKRB32-1/02-2의 사용으로 0.05%까지 구분이 가능한 것으로 판단되어 이의 농도범위를 정성 PCR 검정의 검출한계(limit of detection, LOD)로 설정하였다. 세계 각 국의 표시제 혼입허용치는 EU 및 러시아는 0.9%, 뉴질랜드, 브라질, 이스라엘 및 사우디아라비아는 1%, 한국은 3%, 일본, 태국, 대만, 필리핀 및 캐나다는 5%로 규정하고 있다(Pan et al., 2006; Shin et al., 2012; Taverniers et al., 2005 Zhang & Guo 2011). 본 실험의 검출한계는 세계 각국의 비의도적 혼입허용치인 5 ~ 0.9% 범위를 충분히 검정할 수 있는 측정치로 OsCK1 GM벼의 사후 안전관리에 충분히 적용 가능할 것으로 판단된다.

정량 검정용 표준plasmid 제작

 GMO 검정을 위한 최적의 PCR 정량분석은 primer 및 probe의 선택이 중요하다. Primer는 비특이적 반응을 최대한 배제해야 하고, PCR 산물이 비교적 작은 크기를 갖고 검출감도가 우수해야 하며, 반응시약, DNA추출액 중 저해물질, 반응 증폭온도 등에 안정해야 한다. 또한 다양한 계통의 GM작물들이 혼입되어 있을 경우에 정확한 GMO 혼입율을 분석하기 위해서는 각 계통별로 판별하여 혼입율을 산출할 수 있기 때문에 계통별 판별이 가능한 primer의 설계가 무엇보다 중요하다. 따라서 정량검정을 위해서 검출감도 및 정확성을 고려하여 real-time PCR 조건에 최적반응을 나타내는 벼 내재유전자와 이벤트 삽입 인접염기서열의 primer쌍 및 각 TaqMan probe를 선발하였다(Table 1).

 Real-time PCR에 의한 OsCK1 GM벼의 정량분석을 위해서 각 primer로 PCR 증폭된 염기단편을 포함하는 plasmid을 표준물질로 이용하고자 하였다. 정량 분석용 plasmid는 작물별내재유전자와 각 계통 특이 도입유전자의 PCR산물이 동일 plasmid 내에 연결되어 있기 때문에 각 GM계통 및 non-GM 작물 시료의 GMO 표준품이 없어도 용이하게 시료의 GMO 농도를 정량적으로 산출할 수 있다. 또한 대장균의 배양으로 항상 균일하고 일정한 plasmid의 확보가 가능하여 정량분석의 오차를 줄일 수 있다(Kuribara et al., 2002; Yang et al., 2005). 표준plasmid 제작은 벼 내재유전자 primer쌍(RisPS05-1/05-2)과 이벤트 특이primer쌍(CKRB-1/-2)으로 증폭된 PCR 산물을 서로 연결하고 T-Vector에 도입하여 pSPSCKR을 제조하였다(Fig. 5). 제조된 plasmid, pSPSCKR은 목적하는 각 염기단편들이 벡터 내에 삽입되었는지 염기서열 분석을 수행하였고, 내재유전자 및 이벤트 특이 염기를 포함하는 193 bp의 예상된 염기서열과 정확하게 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 5). 따라서 pSPSCKR의 이용은 5’ 삽입 인접염기서열이 포함되도록 제작하였기 때문에 OsCK1 GM벼 LS28-30-32-20에 대한 특이적인 검출이 가능하다.

Fig. 5. Standard plasmid pSPSCKR as a reference molecule. (a) Schematic diagram of pSPSCKRB: SPS indicates the rice endogenous gene, and OsCK-RB represents the event-specific region between the native rice genome DNA and the 5’-juction of T-DNA. SmaI/SrfI indicates the restriction enzyme site. (b) Nucleotide sequence of the integrated PCR amplicons in pSPSCKRB. Squared boxes indicate the location of primers, and bold bars indicate TaqMan probes.

정량 real-time PCR 검정

 Real-time PCR 분석을 위해서 먼저, pSPSCKR을 제한효소 SmaI으로 절단하여 선형의 DNA로 하고 각 유전자 수를 2 × 10⁷~ 1 × 10 농도범위에서 단계적으로 희석하여 표준물질로 사용하였다. Real-time PCR 반응의 수행으로 각 내재유전자 및 이벤트의 표준물질로부터 표준곡선을 구하였으며, 내재유전자 SPS에 대한 검량선의 상관계수(R2) 및 효율성(efficiency)은 각각 0.999 및 96.1%을 나타냈고, 이벤트 특이적 염기는 1.000 및 97.5%을 나타내어 real-time PCR 분석의 정밀성을 보였다(Fig. 6).

Fig. 6. Amplification plots and standard curves of quantitative real-time PCR assay for disease resistant transgenic rice. (a) Amplification plots for the rice endogenous SPS gene were 2.0 × 10⁷, 2.0 × 10⁶, 2.0 × 10⁵, 2.0 × 10⁴, 2.0 × 10³, 2.0 × 10², 2.0 × 10¹, and 1.0 × 10¹ copies of standard plasmid. (b) Event-specific real-time PCR amplification plots for the 5’-junction site of transgene were established using 2.0 × 10⁷, 2.0 × 10⁶, 2.0 × 10⁵, 2.0 × 10⁴, 2.0 × 10³, 2.0 × 10², 2.0 × 10¹, and 1.0 × 10¹ copies of standard plasmid. Parameters of the regression line through data points are indicated within the plot.

 pSPSCKR을 이용한 real-time PCR에 대하여 각 표준물질의 검출 반복성 및 재현성을 확인하였으며, SPS는 단계별 농도의 Ct값(fluorescence values)이 14.57 ~ 36.13 내에서 반응이 이루어졌고, 표준편차(standard deviation, SD) 및 상대표준변이(relative standard deviation, RSD)는 각각 0.11 ~ 0.25 및 0.34% ~ 1.11% 범위로 나타났다. 이벤트 특이적 염기에 대해서는 Ct값이 14.54 ~ 36.07 범위 내였고, 표준편차 및 상대표준변이는 각각 0.05 ~ 0.25 및 0.19% ~ 1.17%를 나타내어 높은 검출 재현성을 보였다(Table 2). 또한, pSPSCKR의 최저 희석농도인 10 copies에서도 높은 검출감도를 나타내어, 이의 농도범위가 real-time PCR 검정에 대한 정량한계(limit of quantitation, LOQ) 임을 확인할 수 있었다.

Table 2. Absolute limit, repeatability and reproducibility of the real-time PCR using pSPSCKRB as calibrant.

 pSPSCKR을 이용한 real-time PCR 반응 후 표준곡선으로부터 OsCK1 GM벼의 증폭된 copy수를 측정하여 도입유전자수 및 내재유전자 수의 비로서 GM계통별 보정계수(Cv, coefficient value)를 확인한 결과 1.07로 나타났다(Table 3).이상의 pSPSCKR을 표준물질로 이용한 real-time PCR 분석의 검출감도 및 보정계수의 결과는 OsCK1 GM벼에 대한 정확한 정량분석이 가능할 것으로 판단되었다. 따라서 pSPSCKR을 표준물질로 이용할 경우 정량분석의 정밀성 및 정확성을 확인하고자 OsCK1 GM벼를 0.5, 1, 3, 5 및 10% 농도로 각각 조제하여 real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR 분석의 표준곡선으로부터 산출한 OsCK1 GM벼 시료에 대한 정량값은 각각 0.36, 1.20, 3.36, 5.93 및 11.5%의 측정치가 얻어졌으며 실제값(true value)에 매우 근접한 수치를 보였고, GMO 0.5% 농도에서 다소 높은 변이를 제외하고 대부분 20% 이하의 측정값 오차(Bias)를 나타내어 정량분석의 정확성을 나타냈다. 또한, 각 시료에 대한 상대표준변이(RSD)가 대부분 10% 이하의 정밀성을 나타내어 OsCK1 GM벼의 정량 분석에 있어서 pSPSCKR을 표준물질로 적용 가능함이 확인되었다(Table 4). OsCK1 GM벼의 분석 편차값은 기존 보고된 옥수수, 콩, 감자 및 벼 등(Kuribara et al., 2002; Shindo et al., 2002; Pardigol et al., 2003; Rho et al., 2004; Su et al., 2011)에서 분석된 30% 내의 상대표준편차 범주보다 낮은 편차를 보여주는 것으로 정량분석의 정확성을 나타내고 있다.

Table 3. Coefficient value (Cv) of the quantitative PCR assay.

Table 4. Accuracy and precision statistics for quantitative method.

 이상과 같이 본 연구에서는 국내 개발된 병저항성(OsCK1) GM벼에 대하여 각종 특이 primer를 이용한 검출 특이성을 확인함으로써 정성 PCR 검정법을 도출하였고, 벼 내재유전자 및 이벤트 특이적 염기서열을 포함하는 pSPSCKR을 표준물질로 이용하여 높은 검출감도 및 재현성 있는 분석조건을 수립하고 OsCK1 GM벼에 대한 정확하고 정밀한 real-time PCR 정량 분석이 가능함을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 확인된 이벤트 특이적인 정성 및 정량 PCR 검정법은 추후 OsCK1 GM벼의 비의도적 환경방출 또는 실용화에 따른 사후 안전관리 시 GMO의 검정에 이용할 수 있을 것이고, 특히 계통 특이의 삽입염기서열 검출이 가능하여GM 계통의 이력추적에 보다 효율적으로 적용할 수 있을 것으로 본다.

사 사

 본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 연구비(과제번호: PJ00848404) 및 차세대바이오그린 21사업(과제번호: PJ00799501)에 의해 지원되었습니다.