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 방풍은 한방에서 감기, 두통, 발열, 관절통 등의 치료에 쓰이는 생약중 하나로, [대한민국약전 제 10개정(2012)]에서는 산형과(미나리과, Umbelliferae) 다년생 식물인 Saposhnikovia divaricata (Turcz) Schischkin의 뿌리 및 뿌리줄기를 방풍의 기원식물로 정의하고 있다. 그러나 한국, 중국, 일본 등에서는 여러 상이한 식물들이 방풍의 대용으로 이용되고 있는데, 우리나라의 경우 방풍, 원방풍, 진방풍, 해방풍, 식방풍, 산방풍 등 다양한 식물들이 방풍류로써 방풍과 혼용 유통되고 있는 실정이다. 중국의 경우 방풍으로 이용되는 식물은 모두 11종이지만, 우리나라와 마찬가지로 산형과 식물인 S. divaricata의 건조된 뿌리를 방풍의 정품으로 정의하고 있으며, 일본에서도 동일 식물을 중국으로 부터 수입하여 방풍으로 사용하고 있다.

 특히 한방에서 중요성이 높아 기원정립이 필요한 식물은 방풍, 해방풍, 식방풍인데, [대한민국약전(2012)] 및 [대한민국약전외한약(생약)규격집(2012)]에서는 방풍 이외에 갯방풍의 뿌리를 해방풍으로, 그리고 갯기름나물의 뿌리를 식방풍으로 수재하고 있다. 특히 갯방풍(Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.)과 갯기름나물(Peucedanum japonicum)은 방풍과 같은 산형과 식물에 속하지만 서로 속과 종이 다른 식물이다. 그럼에도 불구하고 효능이 비슷하여 방풍의 대용으로 사용되고 있어, 한약재 유통 상 방풍의 진품과 위품 논란의 대상이 되고있다(Choi et al., 1997).

 한국은 물론, 중국과 일본에서 방풍으로 정의하고 있는 S. divaricata (Turcz) Schischkin와 분류학적으로 다른 속 식물인 갯방풍과 갯기름나물의 뿌리가 정확한 효능의 검증 및 기원식물의 객관적 판별법이 확립되지 않은 채 혼용되고 있다(Nam & Ryu, 1975). 따라서 한방재료의 품질관리 및 규격화를 위해서는 방풍의 기원식물 정립과 시중 유통한약재의 판별법 확립이 매우 중요한 사안이다. 방풍류 판별을 위해 Nam과 Ryu(1975) 및 Park 등 (2004)은 방풍의 형태적 특성을 연구하였으며, Jeong과 Lee(2008)는 방풍류 식물의 이화학적 성분을 분석하였다. 그러나 이러한 형태적 특성 및 성분 비교연구는 건조약재의 유통 상 혼용품을 명확히 판별하기 어려운 단점이 있다.

 식물의 형태와 성분은 식물 생육과정 중 환경 영향을 받을 수 있으나, genomic DNA를 대상으로 한 분자생물학적 연구 방법은 환경의 영향을 받지 않아 분석결과의 명확성 및 재현성에 있어서 신뢰도가 높다(Kazan et al., 1993). DNA 마커를 이용한 연구사례를 보면, Choi et al.(1997)은 방풍, 식방풍, 및 갯방풍의 genomic DNA를 대상으로 Internal Transcribed Spacer (ITS) primer를 이용한 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)분석연구를 보고한 바 있으며, Hong 등(2004)은 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 마커를 이용한 방풍류의 Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) 마커 개발 및 방풍류 판별법을 제안한 바 있다. 그러나 이들 연구는 석방풍(Peucedanum terebinthaceum Fisher)과 갯방풍 식물체 판별에 제한적으로 적용되었으며, 시중 유통 한약재 대상의 판별법 개발은 미약하였다.

 최근 Consortium for the Barcode of Life (CBOL) Plant Working Group에 의해 제안된 DNA barcode 분류법은 식물 종판별에 유용한 것으로 인정되고 있다(CBOL Plnat Working Group, 2009). DNA barcode는 식물의 chloroplast DNA (cpDNA)와 핵 리보솜 DNA (nrDNA)에 위치한 짧은 단편을 이용하며, 실험방법이 간단하고 실험결과의 재현성이 높은 장점을 갖고 있어서 식물계통분류 및 종간 유전변이 탐색 등에 널리 이용되고 있다(Peter et al., 2011; Chen et al., 2010; Lee et al., 2010; Kim et al., 2005). 또한, 최근 감초(Lim et al., 2012), 콩과 작물(Ting et al. 2011), 칡(Park et al., 2012), 귤핵, 형개, 하고초(Mun, 2011), 조뱅이(Moon et al., 2013) 등의 다양한 식물의 판별에 있어 DNA barcode를 이용하는 연구사례가 늘어가는 추세이다. 그러나 DNA barcode를 이용한 판별 연구는 현재 초기단계로, 많은 종의 한약재에 대한 명확한 분류기준에 논란이 있어, 한약재의 유통 질서의 확립과 한약재의 객관성 및 유효성 확대 측면에서 분자마커를 이용한 한약재 판별분야의 관심이 절실하게 요구되고 있다.

 따라서 본 연구는 방풍으로 혼용되고 있는 방풍(S. divaricata), 해방풍(G. littoralis) 및 식방풍(P. japonicum)의 외부 형태적 특징과 분자유전학적 염기서열의 차이를 구명함으로써 방풍류식물을 판별코자 수행되었다. 또한 이를 바탕으로 시중유통 방풍 한약재의 원산지 판별에 적용함으로써 한약재 유통체계 확립은 물론 국내외 방풍 식물유전자원 수집 및 보존체계에 기여코자 수행되었다.

재료 및 방법

공시재료

 방풍류 분류 및 한약재 원산지판별연구를 위해 방풍, 식방풍(갯기름나물), 해방풍(갯방풍) 등 31점을 공시재료로 사용하였다(Table 1). 방풍과 식방풍은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 약용작물과로부터, 해방풍은 포항 기청산 식물원으로부터 분양받아 방풍류 판별의 기준 식물로 이용하였다. 또한, 시중유통 한약재의 경우 서울 경동시장, 대구 약령시장, 금산 약재시장에서 수집하였다. 수집 방법은 중국산 및 한국산 등 생산지별로 그리고 방풍, 식방풍, 해방풍 등 식물종별로 수집하였으며, 식물 종판별 후 원산지 판별에 이용하였다.

Table 1. Informations of Bang-Poong plant resources and accessions.

외부 형태적 특성

 방풍 기준 식물 3종의 형태적 특성을 평가하기 위해 3개월간 생육시킨 후, 대한식물도감(Lee, 2003)을 참고하여 잎, 줄기, 뿌리를 관찰하였다. 또한 건조 한약재의 외부 형태적 특성을 평가하기 위해 식품의약안정청에서 제시한 [유전자 분석을 이용한 한약재 종 감별 가이드라인(2010)] 및 [대한민국약전 제10개정(2012)]을 참고하여 약재시장에서 원산지별, 종별로 구분하여 구입한 한약재를 대상으로 절편 색, 질감, 직경 등을 조사·측정 하였으며, 특히 절단면의 경우 약재 뿌리를 비스듬히 자른 것을 고려하여 직경만 조사하여 비교하였다.

DNA 추출 및 PCR 증폭

 DNA 추출을 위해 방풍 식물체 및 건조 한약재를 진동분쇄기로 마쇄한 후 HiYield™ Genomic DNA Mini Kit (RBC, Inc., Taiwan)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출된 모든 방풍 식물자원 및 건조 약재 DNA는 0.8% agarose gel에서 전기영동 한 후 UV-transilluminator 상에서 확인하였으며, UV–VIS spectrophotometer (Microplate Spectrophotometer Multiskan GO; Thermo Scientific, USA)를 이용하여 농도를 측정한 후 10 ng/ul로 정량하여 PCR 증폭에 사용되었다.

 PCR 분석을 위해 40 ng genomic DNA, forward 및 reverse primer 각각 10 pmol, 250 μM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10mM Tris-HCl (pH8.3), 2.0mM MgCl₂, 50mM KCl, 2 unit의 Taq-DNA polymerase을 혼합하여 총 반응액 양을 40 μl가 되도록 하였으며, Thermo-cycler (PTC-200 DNA Engine, Bio-Rad Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한 PCR 및 염기서열 분석을 위해 식물의 종판별에 주로 사용되는 matK, psbA-trnH, rpoB2 및 rpoC1 등 엽록체 유전자(cpDNA)와 핵 DNA (nrDNA) ITS2 유전자 부위를 선정하였으며, 선정된 유전자 부위를 증폭하기 위해 제작한 primer 및 증폭 조건은 Table 2와 같다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel (0.5 X TBE buffer) 상에서 100 volt 조건으로 40분간 전기영동하였으며, UV-transilluminator로 증폭된 DNA 단편을 확인하였다.

Table 2. Informations of barcode primer sequences and PCR reaction condition.

염기서열 및 종간 계통분류학적 관계분석

 증폭된 유전자 부위의 염기서열 분석은 HiYield™ Gel/PCR DNA Mini Kit (RBC, Inc., Taiwan)를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후, Automatic DNA analyzer system 3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 수행하였다. 유통 한약재의 원산지 판별을 위해 기준 식물자원 3종의 염기서열과 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록된 동일종을 비교 한 후 cpDNA-matK, psbA-trnH와 nrDNA-ITS2 부위를 선정하여 한약재 시료에 동일한 조건으로 적용하였으며 수집한 염기서열을 비교·분석하였다. Data 분석은 Bioedit 7.1.7 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/, 1999)의 ClustalW를 통해 각 시료의 염기서열을 정렬하였으며, 분류학적 계통 분석은 MEGA5 (Tamura et al., 2011)에 포함되어 있는 Neighbor-joining (NJ)을 이용하였다. Phylogenetic tree의 지지도는 Bootstrap을 이용하여 무작위로 1000회 반복하였다(Felsenstain, 1985).

결과 및 고찰

외부 형태적 특성

 방풍류 식물자원의 형태적 특징 차이를 구명하기 위해 방풍, 해방풍, 식방풍의 전초와 잎의 형태를 비교한 결과는 Fig. 1과 같다. 방풍, 해방풍, 및 식방풍 모두 잎은 호생이며, 잎자루 밑부분에 잎집이 있어 산형과 식물의 특징을 보였다. 방풍은 3회 우상복엽이며, 잎은 끝이 뾰족한 난형 또는 장원형을 나타내었다(Fig. 1(a)). 식방풍은 2 ~ 3회 우상복엽으로, 소엽의 형태는 도란형이었으며, 치아 모양의 거치가 있었다. 또한, 잎이 두꺼우며 흔히 3개로 갈라진다(Fig. 1(b)). 해방풍의 경우 1 ~ 2회 3출엽이며, 소엽은 불규칙한 잔 톱니를 갖은 타원형 및 도란형으로 끝이 둥글었다(Fig. 1(c)).

Fig. 1. Morphological characteristics of fresh plants and dried roots of Bang-Poong. Seedling and leaf of S. divaricata (A), P. japonicum (B), and G. littoralis (C). Dry and cut roots of China Sapochnikoviae Radix (D), Peucedani japonici Radix (E), and Glehniae Radix (F).

 시중에 유통되는 방풍류 한약재의 형태적 특징을 비교하기 위해 방풍 및 대체 약재인 식방풍과 해방풍의 외부형질을 비교하였다. 방풍 건조 약재의 경우 표면이 회갈색에 거칠며 목부는 연한 황색을 띠었다(Fig. 1(d)). 식방풍 역시 표면이 회갈색이며, 질은 거칠고, 목부는 연한 황색을 나타내었다. 식방풍의 피층은 넓고 짙은 황색을 보였다(Fig. 1(e)). 해방풍의 겉껍질은 연한갈색을 보이며 가느다란 세로 주름무늬와 세로 홈이 관찰되었다. 해방풍의 목부는 백색이었으며, 질감은 부서지기 쉬웠다(Fig. 1(f)). 또한, 방풍류 한약재의 뿌리절편을 비교한 결과, 방풍과 식방풍은 비스듬히 잘린 절편상태로 시중에 유통되고 있었으나, 해방풍의 경우 횡단면으로 잘린 한약재가 유통되고 있었다. 절편의 직경을 비교한 결과 식방풍이 19.73 mm, 방풍이 17.6 mm, 해방풍이 9.94 mm의 순서였다.

 이러한 뿌리의 형태적 특징은 방풍 재배지의 토양환경에 따라 식물 개체 간에 큰 차이를 보일 수 있으며, 대부분의 시중 유통한약재는 약용식물을 건조 후 절단 가공하여 유통되므로 (Shin, 2006) 뿌리 형태적 특징에 의한 식물종 판별 및 유통 한약재 판별에 용이하지 않을 것으로 생각된다.

DNA barcode 염기서열 분석에 의한 방풍 식물자원의 계통분류

 각기 다른 원산지와 식물 종 차이를 고려해 수집한 방풍류의 생체 표준시료 및 건조약재시료로부터 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여, nrDNA-ITS2, cpDNA matK, psbAtrnH, rpoB2, rpoC1 부위로 PCR 증폭한 결과, 각각 약 450 bp, 800 bp, 300 bp, 500 bp, 500 bp의 증폭산물을 확보하였다. 방풍류에 대한 서로 다른 primer PCR 산물의 염기서열분석 결과, 동일 개체 내에서는 동일한 염기서열을 보였으며, 모든 primer에서 종간 차이를 보이는 Single nucleotide polymorphism (SNP)를 확인하였다(Table 3).

Table 3. Amplified DNA sequences of S. divaricata, P. japonicum and G. littoralis by using the primers of nrDNA (ITS2) and cpDNA (matK, psbA-trnH, rpoB2, and rpoC1).

Table 3. Continued.

Table 3. Continued.

Table 3. Continued.

 nrDNA-ITS2 부위에서는 72, 99, 109, 118, 206, 428번째 염기서열에서 방풍(S. divaricata)을, 28, 81, 109, 280, 410, 416번째 염기서열에서 식방풍(P. japonicum)을, 그리고 39, 98, 136, 179, 232, 236, 240, 303, 413번째 염기서열에서 해방풍(G. littoralis)을 구분 짓는 종간 특이적 SNP가 확인되었다. 또한 65, 109, 427, 428번째 염기서열에서는 gap을 확인하였다. 그 외 cpDNA matK에서 138번째 등 10개의 부분에서 종간구분 짓는 특이적 염기서열을 확인하였고, rpoB2구간에서 213 등 두 부분, rpoC1구간에서 255 등 세 부분에서 차이를 보였으며, 특히 cpDNA psbA-trnH에서는 77번째 염기서열 등 43개의 부분에서 특이적 SNP를 나타내어 가장 많은 차이를 보였다.

 현재까지 방풍류의 판별을 위하여 Choi 등(1997)은 RFLP를 통한 판별법을 제안하였으며, Hong 등(2003)은 RAPD, AFLP, Random Amplified Microsatellite Polymorphism (RAMP)를 이용한 SCAR 마커 개발에 대한 연구 등 다양한 방법이 제시되었다. 그러나 이러한 방법들은 특이적인 마커 선발 및 재현성 또한 얻기 어려워 이번 실험과 같이 유연관계가 근접한 식물 종간의 구별을 위한 전략으로는 한계가 있다. 반면 DNA barcode를 이용한 SNP분석법은 다른 DNA분석법의 결과물 보다 얻어지는 산물의 길이가 짧아 실험이 간편하고, sequencing quality가 높아 염기서열 결정이 쉬운 장점이 있어, 차후 근연속식물의 계통분류에 있어 유용하게 사용될 것으로 사료된다(Mun, 2011).

DNA barcode 염기서열 분석에 의한 유통 방풍 한약재의 판별

 방풍류 식물자원의 염기서열 분석을 통해 5가지 후보 primer 중 각 종에 특이적 SNP를 포함하는 primer 제작 및 방풍류 세 종에 대해 모두 판별이 가능한 nrDNA-ITS2와 cpDNA-matK, psbA-trnH를 선발하여 한약재 판별에 적용하였다. 방풍 식물시료에 적용한 동일한 조건으로 PCR 및 염기서열 분석을 수행한 결과 ITS2에서 약 450 bp, matK와 psbAtrnH에서는 각각 800 bp과 300 bp의 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 또한 이들 PCR 산물의 염기서열분석 정보를 바탕으로 phylogenetic tree를 작성하여 유연관계를 확인하였다(Fig. 2, Fig. 3).

Fig. 2. The Neighbor-joining tree based on the cpDNA(matK and psbA-trnH) sequence analysis with fresh and dry samples. Numbers on branches indicates frequencies of statistical occurrence out of 1000 bootstrap replicates. A: using cpDNA matK region, B: using cpDNA psbA-trnH region.

Fig. 3. The Neighbor-joining tree based on nrDNA-ITS2 sequence analysis with fresh and dry samples. Numbers on branches indicates frequencies of statistical occurrence out of 1000 bootstrap replicates.

 방풍류 식물자원과 한약재의 염기서열을 비교한 결과, 해방풍은 갯방풍(G. littoralis)과 동일한 종이며, 식방풍은 갯기름나물(P. japonicum)과 동일한 종임을 알 수 있었다. 또한 국내산 방풍 한약재의 경우 식방풍과 동일한 종으로 분석되어 이는 국내에서 재배하지 않는 방풍(S. divaricata)의 대체품으로 식방풍의 뿌리를 건조시켜 방풍으로 유통되고 있다고 판단된다. 반면 중국에서 수입하여 국내 한약재시장에서 방풍으로 유통되고 있는 한약재의 경우, 그 기원이 방풍(S. divaricata) 식물자원과 동일한 것으로 확인되었다(Fig. 2).

 한편, nrDNA-ITS2 구간에서의 염기서열 분석에 따르면 식방풍은 두 종으로 분류되는데, NCBI에도 두 종류의 염기서열 모두 P. japonicum으로 표기되어있다(Fig. 3). 이는 식방풍의 아종(subspecies) 혹은 환경변화에 따른 변종(variety)으로 판단되며, 이의 명칭이 따로 규정되지 않아 혼재되어 쓰이고 있다고 추정된다.

 방풍류의 경우 GenBank에 ITS와 matK, psbA-trnH 이외의 구간에 대한 정보가 매우 미흡한 실정이므로, 본 연구를 통해 확인된 방풍류의 rpoB2, rpoC1구간의 염기서열은 차후 방풍류의 연구에 있어 기초자료로 제공될 수 있다고 사료된다. 한약재 자원으로 중요성이 높음에도 불구하고 약재명에 따른 사용에 있어 혼란을 야기하는 방풍류 3종(S. divaricata, P. japonicum, 및 G. littoralis)에 대해 nrDNA-ITS2, cpDNAmatK, psbA-trnH의 이용이 원산지 판별에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 본 연구에서 확립된 식물 genomic DNA를 대상으로 한 barcode 연구는 한약재의 특성상 한국, 중국, 일본 등 국가 간 거래가 빈번하므로 기타 다른 한약재 원료 약용식물의 체계적 유통질서 확립에 확대 기여할 수 있으며, 약용식물 유전자원 보존 관리체계 확립에 기여할 것으로 생각된다.

사 사

 본 연구는 2013년도 농촌진흥청 공동연구사업 (과제번호:PJ008567072013) 연구비 지원에 의해 수행되었음.