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 국화는 전세계 주요 화훼작물 중 하나로, 관상용, 식용, 약용, 생산용 등으로 다양하게 이용되고 있는데, 그 중 관상용 국화가 가장 상업화되어 널리 재배되고 있다(Woolman, 1953). 국화는 품종에 따라 꽃의 크기, 화색, 잎모양 등이 다양하여 국화를 분류함에 있어서 4가지(용도, 재배형태, 개화기, 꽃의 크기)로 나누어 분류한다. 용도에 따라 분류 하는 경우에는 식용국과 관상국으로 구분하고, 재배형태에 따라 분류하는 경우에는 절화재배와 분화재배로 나누며, 개화기에 따라 분류하는 경우에는 하국, 하추국, 추국, 동국으로 구분하며, 꽃의 크기에 따라 분류하는 경우에는 스탠다드, 스프레이로 나눈다.

 국화의 기원은 분명치 않으나 중국에서 약 2,000년 전에 처음으로 재배되었다고 추측한다. 중국에서 우리나라로 전래된 정확한 경로나 그 시기는 알 수 없으나, 백제 16대 진시왕때(A.D. 386) 5가지의 국화종자를 일본으로 보냈다는 기록으로 보아 그 이전에 국화가 우리나라에 도입되어 재배되었을 것이라고 추정한다 (Ackerson, 1967). 서양에서는 1688년 네덜란드가 처음으로 국화를 재배하여, 네덜란드로부터 영국(1754년), 미국(1798년) 등지로 국화 재배지역이 확산되었다(Clark, 1962; Dowrick & El-Bayoumi, 1966; Choi, 2005). 상대적으로 국화가 국내에 일찍 도입되었음에도 불구하고, 과거 우리나라 육종의 관심이 식량문제 해결에만 집중되어, 화훼작물인 국화의 육종은 1980년도 중반에서야 뒤늦게 시작되었다. 2001년에 품종보호대상작물로 국화가 지정됨에 따라 종자산업법에 의해 육성자의 권리가 법적으로 보장받게 되어, 2013년 현재 까지 총 660 품종이 등록되었다(Choi, 2005).

 1991년 국제식물신품종보호동맹 (UPOV) 가입, 1994년 WTO 가입 등과 같은 지적재산권 보호를 위한 국제적 협력활동에 우리나라도 참여함으로써, 국내에서도 품종 구분 기술 정립 및 품종 보호 분야와 같은 일이 중요한 일로 평가받게 되었다. 작물의 품종 판별을 위해 과거에는 주로 형태적 특성이나 생화학적 특성에만 기초하여 평가되었으나, 유전적 특성이 비슷한 근연종 간에 구별이 용이하지 않아 사용이 매우 제한적이며, 또한 이런 형질이 환경에 영향을 받기 때문에 다양성의 평가가 어려운 실정이다(Chen & Nelson, 2004). 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 최근에는 DNA 단편의 다형성을 이용하는 분자생물학적 판별을 이용하는데, 이 방법은 형태적 특성에 관계없이 보다 쉽고 정확하게 유전적 특성 평가가 가능하다고 알려져 있다(Hosaka et al., 1994). DNA 마커의 종류에는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Randomly Amplified Polymorphism DNA), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), SNP(Single Nucleotide Polymorphism), 및 SSR(Simple Sequence Repeat) 등이 있으며, 이들 마커들은 유전적 다양성의 평가, 유전자원의 도입과 선발, 계통선발 및 품종구별 등의 육종분야에 널리 이용되고 있다(Bernet et al., 2003; Cho et al., 2010). 다양한 DNA 마커 중 microsatellite라고도 불리는 SSR 은 식물체 게놈 전체에 널리 분포하며 단순반복 염기서열의 반복 motif의 개수 차이로 인해 다형성(polymorphism)을 나타낸다. SSR 마커는 기존에 개발된 DNA 표지인자보다 다형성 정도가 아주 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 효율적이다. 이러한 이유로 최근 국내에서 SSR 마커를 이용하여 다양한 작물에서 품종판별 연구가 많이 활용되고 있지만, 아직 SSR 마커를 이용한 재배국화의 품종 판별 연구는 수행되지 않았다(Cho et al., 2010; Dixit et al., 2005; Moe et al., 2010; Zhao et al., 2012). 따라서 본 연구는 국내에서 육성 또는 도입된 재배국화 품종을 SSR 마커를 이용한 유전자형 분석을 통해 품종판별에 대한 활용성을 검토하고 유전관계를 분석하여 국가 간 종자분쟁 및 국화품종 육성에 필요한 기초자료를 제시하고자 한다.

재료 및 방법

시험재료 및 DNA추출

 본 연구에 사용한 시험 재료는 예산국화시험장에서 육성 또는 도입한 재배국화 85점(관상국 10점, 스탠다드국 25점, 스프레이국 34점, 분화국 10점, 화단국 6점)을 사용하였다(Table 1). DNA추출은 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하였으며, 추출한 국화 DNA의 상대적인 순도나농도를 확인하기 위해 분광광도계인 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)으로 정량하여 10 ng/ml로 희석하여 PCR반응에 사용하였다.

Table 1. Information of 85 chrysanthemums accessions and their usage type.

Table 1. Continued.

Table 1. Continued-2.

SSR 분석

 실험에 사용한 4개의 SSR마커는 Khaing et al.(2013)이 논문에서 사용한 12개의 마커 중 다형성지수(Polymorphic information content; PIC) 값이 높고 대립인자 수가 많은 4개의 마커 (KNUCRY-84, KNUCRY-98, KNUCRY-77, KNUCRY-35)를 선발하여 분석에 사용하였다 (Table 2). PCR 반응은 Schuelke(2000) 방법을 변형하여 수행하였다. 4개의 forward 프라이머에는 M13-tail 염기서열 (TGTAAAACGACGGCCA GT)을 붙여 합성하였고, 형광 물질로 6-FAM, VIC, HEX, NED를 사용하였다.

Table 2. Characterization of four simple sequence repeat markers.

 유전자형을 분석하기 위하여 PCR 산물 1 uL, internal size standard 500 ROX (ABI, Foster city, CA) 0.25 uL, Hidi formamid (ABI, Foster City, CA) 9.25 uL을 첨가 후 ABI 3130xl Genetic Analyzer (ABI, Foster City, CA)를 이용하여 분석하였다. 자료 분석을 위하여 GeneMapper 4.0 (ABI PRIZM Applied Biosystems)프로그램을 이용하였다

SSR 마커 다양성 및 국화 품종 판별

 PowerMarker (ver 3.25) 프로그램을 이용하여 마커에 대한 Number of allele (N), Major Allele Frequency (MAF), Gene Diversity (GD) 및 Polymorphic Information Content (PIC)에 대한 분석을 수행하였으며, POPGENE 프로그램으로는 expected heterozygosity을 분석하였다. 계통분류학적 분석을 위해서는 PowerMarker에 포함되어있는 CS Chord 1967 distance를 이용하여 각각의 품종에 대한 유전적 거리를 분석후, UPGMA 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하여 분석하였다.

품종판별

 SSR마커를 이용하여 85점 재배국화에 대한 품종판별을 위해서 4개의 마커 중 allele 수, gene diversity 및 PIC값이 가장 높은 KNUCRY-84 마커를 이용하여 phylogenetic tree를 작성한 후 1차 품종 판별 분석을 수행하였다. 구분이 되지 않은 자원에 대해서는 자원들이 가지고 있는 특정 allele을 포함하고 있는 마커 (KNUCRY-98, KNUCRY-77, KNUCRY-35)를 선발하여 순차적으로 하나의 마커를 추가하여 phylogenetic tree를 작성하여 최종 4단계로 재배 국화 85점의 품종을 판별하였다.

결과 및 고찰

유전적 다양성과 유연관계

 국내에서 개발되어 보급되고 있는 재배국화 품종 판별을 위해 다형성지수가 높은 4개의 SSR 마커를 이용하여 85점의 재배국화에 대한 유전자형을 분석한 결과, 총 95개의 대립인자가 관찰되었다. 대립인자의 수의 범위는 11개(KNUCRY-35)에서 34개(KNUCRY-84)로 비교적 다양하게 나타났으며, 평균 대립인자 수는 23.8개였다. MAF(Major allele frequency) 범위는 KNUCRY-77에서 0.23로 가장 낮았으며 KNUCRY-84에서 0.35로 가장 높게 나타났고 평균은 0.31이었다. 유전적 다양성을 나타내는 GD(Gene Diversity)와 PIC(Polymorphism Information Content)는 KNUCRY-35에서 두 값 모두 가장 낮았고 (0.81, 0.79), KNUCRY-77에서 두 값 모두 가장 높게 나타냈으며 (0.89, 0.89), 평균은 각각 0.84, 0.82이였다(Table 3).

Table 3. Genetic variables of four simple sequence repeat markers.

 Huang et al. (2000)의 22개 RAPD 마커를 이용한 재배국화 품종의 유전도 분석, Shao et al. (2010)의 22개 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)마커와 26개 SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism)마커를 이용한 유전적 다양성, 및 Lui & Yang (2009)의 ISSR마커를 이용한 야생국화와 재배국화 품종의 유전도 분석과 비교하였을 때, 본 연구에서 사용한 SSR마커가 더 높은 유전적 다양성을 나타내는 것으로 보여, 품종판별에 SSR마커가 다른 마커들에 비해 효율적으로 보여 진다.

 국화의 이용에 따라 재배국화를 관상국, 스탠다드국, 스프레이국, 분화국, 화단국으로 그룹을 나눠 집단 간의 유전적 다양성을 분석하였다. 각 집단의 평균 Heterozygosity(H)와 PIC 값을 비교하였을 때 화단국이 0.25와 0.42로 가장 낮게 나타났고, 스프레이국이 0.80과 0.79로 가장 높게 나타났다(Table 4). 그룹간의 유전적 거리를 비교한 결과는 관상국화와 화단국 간의 유전적 거리는 0.89로 가장 멀었고 분화국과 화단국은 0.43으로 가장 가까웠다(Table 5, Fig. 1).

Table 4. Comparison of chrysanthemum genetic characteristics among usage groups.

Table 5. Allele frequency divergence among clusters (net nucleotide distance, below diagonal) and average distance (expected heterozygosity) within individuals in same usage groups (above diagonal).

Fig. 1. UPGMA dendrogram based on a genetic distance matrix among usage groups of chrysanthemum. Dendrogram showing genetic relationships.

품종판별

 국화는 6배체로 하나의 locus에 1 ~ 6개의 allele이 존재할 수 있는데, 가장 높은 PCR 증폭량을 나타내는 2개의 allele들을 선택하여 유전자형을 분석하였다. 본 실험은 재배국화 85점의 판별을 위하여 SSR마커 4개 중 allele 수, 특이적 allele 수, gene diversity 및 PIC 값이 가장 높은 KNUCRY-84마커를 이용하여 phylogenetic tree를 작성한 후 분석하였다. 총 4단계로 분석을 수행하였으며 단계별로 KNUCRY-84, KNUCRY-98, KNUCRY-77, KNUCRY-35 마커를 순차적으로 추가하여 단계별 tree를 작성하여 분석하였다(Fig. 2, Table 6).

Fig. 2. Diagrammatic display of cultivar discrimination by phylogenetic trees using 85 chrysanthemum cultivars at each stage by four SSR markers.

Table 6. Genotype information of 85 chrysanthemum cultivars by 4 SSR markers.

Table 6. Continued.

Table 6. Continued-2.

 KNUCRY-84 마커를 이용하여 1단계 판별을 수행한 결과 총85점의 재배 국화 자원 중 24점(관상국 3점, 스탠다드국 12점, 스프레이국 7점, 분화국 1점, 화단국 1점)이 유전적 거리를 기준으로 분리되는 것을 확인할 수 있었으며, 2단계에 KNU-98 마커를 추가하여 분석한 결과 1단계에서 판별되지 않았던 61점 중에서 33점(관상국 3점, 스탠다드국 7점, 스프레이국 17점, 분화국 4점, 화단국 2점)이 분리되었다. KNUCRY-77 마커를 이용한 3단계에서는 18점(관상국 2점, 스탠다드국 3점, 스프레이국 9점, 분화국 3점, 화단국 1점), 4단계인 KNU-35 마커는 10점(관상국 2점, 스탠다드국 3점, 스프레이국 1점, 분화국 2점, 화단국 2점)의 자원이 각각 다른 자원들과 분리되었다. 1단계에서 4단계 까지의 마커 조합으로 85점의 재배 국화 자원들이 판별되었다.

 작물의 유전적 다양성과 그들의 유전관계에 대한 연구는 육성의 효율성을 증대할 수 있을 뿐만 아니라 품종구분 기반정보로 활용이 가능하여, 최근에 DNA마커를 이용한 유전관계연구가 다양한 작물에서 활발히 이루어지고 있다. Yang & Quiros (1993)은 19개 RFLP 마커를 이용하여 23개의 밀 품종 판별을 하였고, Arnau et al. (2003)은 18개의 ISSR 마커를 이용하여 30개의 딸기 품종 판별에 사용하였다. 또한, Chung et al. (2009)은 10개의 SSR 마커를 이용하여 40개의 구기자 품종을 구분하였으며, Jang et al. (2009)은 15개의 SSR 마커로 26개의 육성종 콩 품종을 구분하였다는 연구가 보고 되었다.

 결론적으로 본 연구를 통하여 최소한의 마커세트인 4개의 SSR 마커를 이용하여 재배국화 85점을 구분이 가능하였고, 관상국, 스탠다드국, 스프레이국, 분화국, 화단국 나눠 그룹 간의 유전적 관계를 비교 할 수 있었다. 본 연구 결과는 재배국의 품종보호와 종자관리를 위해 표지로 활용될 것이며, 육종가들에게는 국화 품종 육성에 기반자료로 이용될 것으로 기대된다.