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 벼멸구(Nilaparvata Lugens Stál)는 아시아 벼 재배지역에서 식물체의 체관을 직접 흡즙하여 막대한 수량감소를 가져오는 해충이며, 또한 Ragged Stunt Virus(Rivera et al., 1966), Grassy Stunt Virus(Ling et al., 1978) 등을 매개하여 더 큰 피해를 가져온다(Khush & Brar 1991). 벼멸구의 피해정도와 발생빈도는 1960년대 이후 동남아시아 지역을 중심으로 계속해서 증가하고 있는데, 그 주된 이유로 준단간 품종의 재배면적 증가로 질소 및 살충제의 과다사용이 지목되고 있다(Dyck & Thomas 1979, Pathak & Heinrichs 1982, Sogawa 1982). 벼멸구는 우리나라에서 월동 하지 못하고 6월 중 중국남부지역으로 부터 장마전선을 타고 비래하는 것으로 알려져있다(RDA 1997). 벼멸구 방제는 저항성 품종을 육성하여 재배하는 것이 가장 경제적이며 자연친화적인 방제 방법이다(Bonman et al., 1992). 지금까지 28개의 벼멸구 저항성 유전자가 보고되어 있으며(Fujita et al., 2013), 대부분은 인디카형야생벼 또는 재래벼로부터 유래한 것이다(Brar & Khush 1997, Ishii et al., 1994, Yang et al., 2004). 그 중 8개는 열성 유전자인데 12번 염색체상의 bph2와 6번 염색체상의 bph4는 각각 우성 유전자 Bph1 및 Bph3과 연관되어져 있고 나머지는 독립적으로 좌위한다(Kawaguchi et al., 2001). Bph13(t)는 2번, Bph19(t), Bph14는 3번, Bph6, Bph12(t), Bph15, Bph17, Bph20(t)는 4번, Bph3, bph4, BPH25(t) qBPH6(t)는 6번, Bph21(t)은 10번, Bph1, bph2, Bph9, Bph10, Bph18(t), BPH26(t)은 12번 염색체상에 위치한다(Fujita et al., 2013). 벼멸구 저항성 자포니카 품종을 개발하기 위해서는 저항성 인디카형과의 교잡으로 저항성 유전자 도입이 필요한데, 인디카형으로부터의 저항성 유전자 도입은 linkage drag 발생으로 농업적 열악형질이 수반되어 실용품종을 육성하는데 많은 어려움이 따른다(Kaneda 1984, Shin et al., 1990, Yeo & Sohn 1995). 우리나라에서는 1977년 벼멸구 저항성 유전자 Bph1을 가진 통일형 ‘밀양30호’와(RDA 1978), 1986년 bph2를 가진 자포니카형 ‘화청’을 최초로 개발하였다(RDA 1989). 야생벼로부터 유래된 Bph18 유전자를 가진 ‘안미’가 육성되기 전까지 우리나라에서는 Bph1 또는 bph2를 활용하였다(RDA 2011, Table 1). Bph1과 bph2는 1980년대 이전부터 전통육종법을 통해 품종에 도입되었지만(Jena et al., 2006) 지난 이십년 동안 Bph1 또는 bph2 유전자를 가진 품종은 감염패턴과 생태형의 변화로 점점 감수성화 되고 있어(Li et al., 1999), 새로운 벼멸구 저항성 유전자를 가진 품종의 개발이 매우 중요하다. 논문에서는 야생벼 O. australiensis에서 유래한 12번 염색체 장완에 위치하는 Bph18 유전자 연관 분자표지(Jena et al., 2006)를 활용하여 자포니카형 벼에 Bph18 유전자와 흰잎마름병 저항성 유전자 Xa3, 그리고 줄무늬잎마름병 저항성 유전자 Stvb-i를 가지는 복합 병해충 저항성 계통 육성과정을 보고하고자 한다.

Table 1. Rice variaties of brown planthopper resistance developed in Korea.

재료 및 방법

시험재료 및 재배방법

 벼멸구 저항성 우량 계통을 육성하기위해 중만생종이며 벼멸구에 감수성인 고품질 품종 ‘황금누리’를 모본으로, 야생벼 O. australiensis로부터 유래된 Bph18 유전자를 가지는 중생계통 SR30071-3-7-23-6-2-1-1를 부본으로 교배하여 F1을 양성하였다. F2 세대에서는 집단 선발을 하였고 F3 이후부터는 계통육종법으로 선발과 함께 벼멸구 유묘검정을 실시하였다. F5세대에서는 벼멸구 저항성 유전자 Bph18, 흰잎마름병 저항성 유전자 Xa3 및 줄무늬잎마름병 저항성 유전자 Stvb-i 보유여부를 분자마커로 판정하였다. 선발된 계통의 주요 농업형질을 조사하기 위하여 모본, 부본 및 대비품종과 함께 4월 27일 파종하여 6월 1일에 재식거리 30 × 15 cm, 주당 3본씩 이앙하였다. 시험구는 완전임의배치법 3반복으로 하였고 기타 재배관리 및 시비량은 농촌진흥청 표준재배법에 준하였다.

벼멸구 유묘검정 및 주요 병해 검정

 벼멸구 유묘검정은 국립식량과학원 벼맥류부 해충사육실에서 ‘동진1호’를 먹이로 사육한 벼멸구를 분양 받아 증식하여 사용하였다. 20개 공간이 있는 플라스틱육묘상자에 상토를 넣고 계통종자를 파종하였고 육묘상자의 2개 공간에는 각각 감수성 품종인 ‘남평벼’와 저항성 품종인 ‘안미’를 함께 파종하였다. 유묘가 4~5엽기 정도 되었을 때 2 ~ 3령 벼멸구 유충을 개체당 5 ~ 7마리를 접종하였다. 충 접종 1주일 후 감수성 품종인 ‘남평벼’가 완전히 고사한 시기에 저항성여부를 판정하였다. 도열병 저항성 검정은 질소 다비조건에서 밭못자리에 파종 골을 낸 후 계통종자를 파종하여 유묘기 상태에서 농업과학기술 연구조사분석기준(RDA 2003)으로 조사하였다. 흰잎마름병 저항성 검정은 벼 흰잎마름병 4개 균주 K1(HB1013), K2(HB1014), K3(HB1015), K3a(HB1009)를 벼맥류부 작물병해충관리연구실에서 분양 받아 배양하여 사용하였다. 각각의 균주를 PSA배지 조성분에서 한천을 제외시킨 액체배지를 이용하여 28℃의 항온진탕기 내에서 3일간 배양한 후 멸균수로 희석하여 분광광도계(Ultraspec 4300 pro, UK)를 이용하여 병원균의 농도를 10⁸ ~ 10⁹ cell/ml로 조정하여 접종에 사용하였다. 균 접종시기는 최고분얼기인 7월 25일에 각 균주별로 계통의 엽선단 약 5 cm 부위를 가위 절엽 접종하였다. 접종 3주 후 감염 정도를 조사 하였으며 농업과학기술 연구조사분석 기준(RDA 2003)에 따라 병반면적율 5% 이하는 저항성, 25% 이하는 중도저항성, 26% 이상은 이병성으로 측정하였다.

 줄무늬잎마름병 저항성 검정은 망실검정법으로 보독매개충을 월동시켜 개체 밀도가 충분히 유지시킨 망실에서 계통종자를 파종한 후 감수성 품종인 ‘일품벼’가 고사할 때 저항성과 감수성으로 판정하였다.

DNA 추출 및 PCR 활용 마커 검정

 Genomic-DNA는 계통별 파종 후 2 ~ 3엽기의 어린잎을 1 cm 크기로 잘라 마쇄한 후 BS 96 DNA plant kit를 활용하여 Biosprint 96(Qiagen)로 추출하였고 Nanodrop(Nanodrop Co.)으로 DNA 농도를 측정하여 10 ng/ul로 조절하여 사용하였다.

 저항성 유전자의 마커 검정은 벼멸구, 흰잎마름병 및 줄무늬잎마름병에 각각 7312.T4A, 9643.T4 및 ST10 마커를 사용하였다(Hayano-Saito et al., 2000, Jena 2006, Table 2). PCR 증폭 조건은 pre-denaturation 95℃ 5분간 1회, denaturation 94℃ 40초, annealing 57℃ 40초, extension 72℃ 1분을 35회, final-extension 72 5분으로 하였다. 벼멸구 저항성 유전자 Bph18, 흰잎마름병 저항성 유전자 Xa3 마커 검정을 위해서는 각각 Hinf I(37℃, 2시간 반응), Taqα I(65℃, 2시간 반응) 제한효소 처리하고 1.5% agarose gel에서 100 V 40분간 전기영동 한 후 유전자형을 판정하였다.

Table 2. DNA markers and restriction enzymes used to detect of R-genes against the brown planthopper, bacterial blight, and rice stripe virus.

결과 및 고찰

저항성 계통 육성

 흰잎마름병과 줄무늬잎마름병에 저항성이고 벼멸구에 감수성인 중만생종 고품질 황금누리와 벼멸구 저항성 유전자 Bph18을 가진 준단간 중생종 계통 SR30071-3-7-23-6-2-1-1-1간 교잡으로 F1을 육성하였다. F2는 F1 20개체에서 개체군당 60개체씩 총 1,200개체를 이앙하였고, 그 중 단간이며 출수기가 중만생종이고 이삭과 초형이 우수한 60개체를 선발하였다. 선발한 60개체 중 쌀외관형질검정을 통해 장립형과 심복백이 있는 계통을 도태시키고 23개체를 F3로 공시하였다. 벼멸구 유묘검정, 도열병 밭못자리검정, 흰잎마름병 K1 균계 접종을 실시하여 저항성이며 이삭 및 초형이 우수한 4계통에서 계통당 5개체씩 선발하여 총 20계통의 F4를 ’10/’11년 동계온실에 전개하였다. F4 계통에서 다시 이삭과 초형이 우수한 개체를 계통당 5개체씩 선발하여 F5 100계통을 2011년 하계 포장에 공시하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Scheme for the development of a multi-resistant elite line Iksan562(HR28011-1-2-3-2-1).

분자표지와 생물검정을 이용한 병해충 저항성 계통 선발

 벼멸구 유묘검정에 있어 Bph1과 bph2를 가진 자포니카형 품종은 벼멸구 접종 후 감수성 품종이 고사되는 시점에서 4~5일은 더 저항성 반응을 보이나 이후 고사되며, 자포니카 품종은 최고분얼기 이후에는 통일형 품종보다 더 강한 저항성을 발현한다고 하였지만(Shin et al., 1990, Yeo & Sohn, 1995) 실제 포장에 비래하는 벼멸구는 이앙에서 최고분얼기까지 벼멸구의 발육이 가장 좋은 시기로(RDA, 1997), 벼멸구 밀도가 적은 경우가 아니라면 자포니카형 품종이 성체까지 살아가기에는 한계가 있으리라 보인다. 그러나 Bph18 유전자를 가진 자포니카형 계통은 유묘기에서도 거의 정상적으로 저항성을 발현하기에 벼멸구 저항성 품종 육성에 매우 효과적인 유전자로 생각된다(Shin et al., 2011).

 F5 세대에서는 분자마커를 이용하여 벼멸구 저항성 유전자 Bph18, 흰잎마름병 저항성 유전자 Xa3, 줄무늬잎마름병 저항성 유전자 Stv-bi를의 보유유무를 개체별로 판정하였다. 공시된 F5 100계통 중 Bph18은 92계통, Xa3는 96계통, Stv-bi는 98계통에서 각각의 저항성 유전자가 확인되었다. 생물검정에서는 100계통 중 94계통이 유묘기 벼멸구 저항성, 27계통이 흰잎마름병 K3 균계에 저항성 반응을 보였고 73계통은 중도저항성을 보였다(Table 3, Fig. 2, Fig. 3). 줄무늬잎마름병은 F5 세대에서는 분자표지 검정만 수행 하였고, 생물검정은 생산력검정시험에 우량계통으로 선발된 F6 계통에서 수행 하였다.

Table 3. Efficiency of bioassay and marker selection during F3 and F5 generations.

Fig. 2. Detection of Bph18 gene using DNA marker 7312.T4A to brown planthopper resistance line Iksan562. PCR products were cleaved by Hinf and gels were stained by RedSafe. P1 : Hwanggeumnuri(susceptible), P2 : SR30071-3-7-23-6-2-1-1-1(resistance).

Fig. 3. BPH bioassay selection for resistance lines at seedling stage. NP : Nampyeong(susceptible), AM : Anmi(resistance), DC : Dacheong(resistance), SR : SR30071-3-7-23-6-2-1-1-1(resistance), HN : Hwanggeumnuri(susceptible).

 F5 세대 100계통 중 주요 농업적 형질이 우수한 11계통을 생산력검정시험에 공시하였고 보통기 보비조건에서 병해충 성적이 우수한 4계통을 지역적응시험 최종예비계통으로 선발하였다(Table 4). 선발한 4계통 중 이삭형과 초형이 우수하며 출수기는 중만생종이며 간장이 작고 수량이 모본인 ‘황금누리’와 비슷한 ‘HR28011-1-2-3’을 최종 선발하여 ‘익산562호’ 로 계통명을 부여하였다.

Table 4. Reaction to three major diseases, blast, bacterial blight and brown planthopper in selected lines.

벼멸구 저항성 계통의 농업적 특성

 육성 계통의 모본인 ‘황금누리’는 출수기 8월 15일의 중만생종으로 간장이 76 cm의 단간이며 주당수수 13개, 수당립수 123개, 등숙비율을 80.1%, 현미천립중은 21.6 g, 정현비율은 82.4%이고 백미수량은 540 kg/10 a이다. 부본인 ‘SR30071-3-7-23-6-1-1-1’은 출수기 8월 10일의 중생종으로 간장은 80 cm, 주당수수 11개, 수당립수는 138개, 등숙비율은 79.7%, 현미천립중은 21.2 g, 정현비율은 81.3%였으며 백미수량은 518 kg/10 a이다. 모본과 부본에서 차이점은 출수기가 부본이 5일 빠른 중생종이고 간장이 4 cm 크며 주당수수가 11개로 2개 적고 수당립수가 15개 많으며, 백미수량도 Bph18 유전자를 가진 부본이 4.2% 적은 518 kg/10 a 수준이다(Table 5). Bph1과 bph2는 출수기와 상관없다고 보고하였지만(Lee et al., 2005, Yeo et al., 2002), 야생벼 유래 Bph18 유전자는 출수일수는 짧은쪽으로 작용한다(Shin et al., 2011)고 하였는데 벼의 출수기를 지배하는 유전자는 최근까지 2, 3, 6, 7, 8 및 9번 염색체 상에 여러 개가 존재하는 것으로 보고되었고(Ebana et al., 2011), 출수기와 간장은 여러 유전자의 상호작용과 일장, 온도, 토양환경 등이 복합적으로 좌우하는 만큼 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 보인다.

Table 5. Major agronomic traits and yield components of selected lines.

효율적인 복합 내병충성 계통 육종 방향

 최근 소비자들의 친환경제품에 대한 선호 현상이 높아지고 있으나 재배기간 동안 기상환경의 다 변화(Heo & Lee 2006)에 따른 병해충의 다발생으로 인해 안정적인 친환경 벼재배가 어려워 수량성이 높으면서 복합내병충성 계통의 육성이 필요하다.

 선발한 4계통의 주요 선발기준은 벼멸구와 흰잎마름병, 줄무늬잎마름병에 저항성을 가지면서 간장이 작은 계통이었다. 육성된 대표적 자포니카형 벼멸구 품종인 화청, 하남 다청, 중모1006호, 친농, 친들은 Bph1 또는 bph2 유전자를 가지고 있으며 하남을 제외하고 간장이 큰 관계로 도복에 취약점을 가지고 있다(Kim et al., 2010). 2005년 여교배 육종법으로 육성한 ‘하남’은 대표적 단간 품종인 ‘주남’을 반복친으로 활용하여 이러한 도복관련 열악형질을 극복하였다(Yeo et al., 2008). Bph1과 bph2 유전자를 가지는 계통 및 품종은 간장과 3절간장이 길다고 보고 된 바 있다(Yeo et al., 2002, Lee et al., 2005). Bph1과 bph2는 모두 12번 염색체에 위치하는데 본 시험에서 육성한 계통이 가지는 Bph18 유전자 또한 동일한 염색체 부위에 위치하고 있으며 이 유전자 주위로 간장에 영향을 주는 장간 유전자가 매우 밀접하게 연관되어있는 것으로 추정하고 있다. 따라서 간장이 작으며 도복지수가 낮은 계통을 선발하거나 여교배 육종법을 활용하는 것이 실용적인 벼멸구 저항성 계통 육성에 중요 요인이라 할 수 있다.

 현재 육종방향은 전통육종만의 방법에서 DNA 마커를 활용한 선발방법의 혼합 된 형태로 가고 있다. 마커를 활용한 선발은 노력절감과 고정된 저항성 유전자형을 초기세대에 선발할 수 있다는 것 등 많은 장점이 있다(Peleman & Voort 2003). 본 연구에서 분자표지와 생물검정 결과를 비교하면 벼멸구와 흰잎마름병은 저항성 계통 선발 효율성이 90% 이상이었으나, 현재 DNA 분자표지만 이용하여 저항성 유전자를 선발할 수 있는 병해충 유전자는 제한적이다(Fujita et al., 2013). 앞으로 다양한 병해충에 대한 저항성 유전자 선발마커를 개발함으로써 기후변화 대응 복합병해충 저항성 벼품종 개발 효율성을 증진할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구를 통해 육성된 ‘익산562호’는 전통육종과 분자육종을 활용한 벼멸구, 흰잎마름병 및 줄무늬잎마름병 복합 저항성을 발현하는 우량계통으로 금후 친환경 재배용 복합병해충 저항성 벼품종육성에 활용되기를 기대해 본다.

사 사

 본 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호 : PJ008710022013)의 지원에 의해 이루어진 것임.