유전자변형(Genetically Modified, GM)

대두가 상 업적으로 재배된 1996년 이래로 식물생명공학기술에 의한 GM 작물의 상용화는 사료용 및 식품가공용을 중심으로 세계적으 로 널리 실용화되고 있다. GMO의 식품안전성 및 환경위해성 논란에도 불구하고 전 세계 GM작물 재배면적은 1억 7,030만 헥타르에 달하고 있으며, 28개국에서 1,730만여 명이 GM작물 재배에 종사하고 있다(James, 2012).

GM기술의 발달로 식물에 새로운 형질을 부여함으로서 제초 제와 병충해에 대한 저항성 향상, 식량 증산, 영양 개선, 기능 성 강화, 의약 성분 물질의 생산 등이 가능해졌고 이러한 기술 이 농작물 개발에 다양하게 활용됨에 따라 많은 GM 식품이 상업화되는 단계에 이르렀다.

우리나라에서 GM 농산물의 재배는 아직 허용되고 있지 않 지만 콩, 옥수수, 면화, 캐놀라 등 많은 종류의 GM 작물이 수 입되어 유통되고 있어 이들 작물에 대한 노출은 피할 수 없는 실정이며 이에 대한 안전성 평가가 시급한 것으로 판단된다. GM 작물의 안전성에 관하여 독성 및 영양학적 측면에 대한 검토는 이미 다양한 기관의 평가 및 연구를 통해 이뤄졌으나, 유전자재조합 단백질로 인한 새로운 알레르기 발생 가능성에 대한 평가는 전 세계적으로 많은 연구가 진행 중임에도 불구 하고 아직 그 평가방법이 완전히 정립되지 않은 상태이다 (Shon, 2003). 새로운 GM 식품의 알레르기 안전성에 대해 2001 년 FAO/WHO의 전 세계 알레르기 전문가 회의에서 유전자재 조합 식품의 알레르기 안전성 평가를 위한 흐름도(decision tree)를 제시하였으며(FAO/WHO, 2001) 이후 2003년 국제식품 규격위원회(Codex Alimentarius Commission)에서 다소 보완된 유전자재조합식품의 알레르기 안전성 평가체계를 제안한 바 있 다(Codex, 2003). 현재 대부분의 경우 Codex guideline을 따 르고 있으나 평가 방법이나 판단 기준을 보편화하기 위해서는 국제적인 연구와 합의가 필요한 상태이다(Lee, 2008). 국내 식 품의약품안전처에서 수행하고 있는 유전자재조합산물의 안전 성평가 항목 중 알레르기 유발성 평가 방법 역시 FAO/WHO 전문가 자문회의나 CODEX에서 제시한 안들과 서로 공통점이 있지만, 세부적으로 차이가 있고 계속하여 개선되어야 할 부분 들이 있어 이에 대한 지속적인 모니터링이 필요하다.

최근 국내에서는 벼 내에서 과다 발현시키면 벼의 흰잎마름 병 및 도열병에 대한 저항성이 높아지는, 벼 유래의 Choline kinase 유전자(OsCK1)를 과발현하여 벼도열병과 벼흰잎마름병 에 저항성을 나타내는 병저항성 GM 벼를 개발하였고(Lee et al., 2007), 실용화 GM작물로 개발하고자 안전성 평가를 수행 하고 있다.국내 식품의약품안전처에서는 식품위생법의 가이드 라인에 의해 GM 농작물, 미생물 등에 대한 심사를 수행하고 있으며 옥수수와 콩 등 93개 품목을 승인하고 있으나 현재까 지 벼를 대상으로 심사 및 승인을 한 예는 없다. 이에 본 연 구의 목적은 병저항성 GM 벼의 알레르기 안전성을 평가하고 자 알레르기성 평가에서 필수적으로 요구되는 사항 중 알레르 기 원인물질(알레르겐)데이터 베이스(D/B)에 의한 상동성 비 교 조사, 유전자 산물의 물리화학적 처리에 대한 감수성, 단백 질의 소화성 상관 조사 등을 수행하였다.

재료 및 방법

재료

본 실험의 GM 벼는 농촌진흥청에서 개발한 것으로 벼 유 래의OsCK1 유전자를 벼에 형질 전환하여 흰잎마름병 및 도 열병에 대한 저항성을 높게 한 병저항성 GM 벼로 비형질전 환 모품종인 낙동벼와 같이 Oryzae sativa L., Japonica종이 다. 병저항성 GM 벼와 낙동벼를 GMO 격리 포장(경북 군위 군 효령면 소재)에서 재배하였으며 잎 부위를 수확하여(출수 기) 동결 건조한 후(일신랩 FD8518, 한국) 분쇄기를 이용하여 (한일전기, HMF-3100S, 한국) 분말화하였다.

알레르기 D/B를 이용한 상동성 비교

현재 일반적으로 이용되고 있는 알레르겐과의 상동성 검색 은 FAO/WHO에서 권장하는 방법에 준하여 실시되고 있는데 우선 단백질 D/B에서 알레르겐에 대한 정보를 확보한 뒤 GM 작물에 도입된 단백질의 아미노산 서열을 80개 단위로 끊어 전체 아미노산 서열에 비교 검색을 실시하였다. 알레르겐과 아 미노산 서열이 함께 제시되어 있는 대표적인 사이트 allergenonline에서 삽입유전자 OsCK1의 알레르기 유발 가능 성을 검정하였다.

발현 단백질 분리

발현 단백질 대량분리를 위해 목적단백질 유전자 OsCK1을 His-tagged vector pET32+ (Novagen, Madison, USA)에 전 이시킨 다음, 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 형질전환 한 후, 배양하여 단백질 대량 분리를 위한 시료로 사용하였다. 용출 된 단백질은 Ni-charged와 Q-sepharose chromatography(Bio- Rad, CA, USA)를 통해 분리하였으며 분리된 단백질의 순도 및 분리양상은 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

항원 추출 및 단백질 전기영동

GM 벼와 낙동벼 식물체 시료를 각 1 g씩을 취하고, 막자사 발에서 액체질소와 함께 분말화한다. 분말화 된 시료에 단백 질 추출용액(0.5M Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.7M sucrose, 0.1 M KCl, protease inhibitor cocktail)을 첨가한 후, 원심분 리(4°C, 15,000 rpm, 20분)하여 단백질을 분리, 추출한 후 Bovine serum albumin(BSA)을 기준으로 protein assay reagent(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 단백질 정량하였 다(Kim et al., 2010). 단백질 전기영동(SDS-PAGE)은 Laemmli (Laemmli, 1970) 방법에 준하였으며 12%의 separation gel을 미리 설치된 전기영동용 glass plate에서 중합시킨 후 그 위에 4.5%의 stacking gel을 중합시켰다. 준비된 gel은 전기영동 buffer(25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)가 들어있는 전기영동조에 설치하고, 5X sample buffer(60 mM Tris/HCl (pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromphenol blue)와 시료를 1 : 4로 혼합 후 100°C에서 5분 동안 가열한 뒤 lane당 20 μg의 시료를 전기영동하였다. 전기영동은 우선 100 볼트에서 10분 시행하여 시료가 stacking gel에 진입한 후 130 볼트에서 35분 정도 추가로 진 행하였다. 전기영동 후 gel은 단백질 확인을 위해 염색 용액 (1 g Coomassie Blue R-250, 450 mL methanol, 450 mL H₂O, 100 mL glacial acetic acid)으로 착색하였다.

인공 위액 분석

인공위액처리는 Astwood등의 방법(Astwood et al., 1996)을 약간 변형하여 사용하였다. E. coli로부터 분리되어 정제된 OsCK1단백질 20μg에 인공위액 (3.2 mg pepsin/mL 0.03M NaCl, pH1.2)을 넣고 37°C 항온조에서 교반하면서 일정시간 반응시켰으며 0초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 20분에 각각 20 μL 씩 샘플링하였다. 그 후 상등액을 취하여 인공위 액 20 μL 당 160 mM Na₂CO₃용액을 7.5 μL 가하여 반응액 을 중화하여 효소반응을 정지시키고 SDS-PAGE로 확인하였다.

열안정성 및 당화(Glycosylation)분석

열안정성을 확인하기 위해 OsCK1 단백질을 100°C 항온조 에서 배양하면서 5분, 10분, 20분, 30분, 45분, 60분에 각각 20 μL씩 샘플링하여 항원 추출에 사용한 방법과 동일하게 SDS-PAGE를 수행한다. 발현 과정에서 번역 후 변이(posttranslational modification)가 일어나는지 확인하기 위하여 당화 분석을 실시하였다. GM 벼 시료 1 g을 막자사발에서 액체질 소와 함께 분말화하여 단백질추출용액 (0.5 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.7 M sucrose, 0.1 M KCl, protease inhibitor cocktail)을 첨가한 후, 원심분리(4°C, 15,000 rpm, 20분)하여 침전물을 제거한 상등액을 취하여 Glycoprotein Staining Kit (Pierce, USA)를 이용하였다.양성 대조군으로는 다수의 공유결 합으로 연결된 탄수화물 변형체를 가진 것으로 알려진 horseradish peroxidase (HRP) 단백질을 사용하였다.

결과 및 고찰

D/B 검색을 통한 알레르기 유발 가능성 검정

삽입유전자 OsCK1으로부터 유추된 아미노산의 염기서열을 allergenonline에 제시한 후 알레르겐의 존재 유무를 검색한 결 과, 연속되는 80개 이상의 아미노산 절편에서 35% 이상의 상 동성을 보이는 서열은 없었으며, 8개씩의 인접 아미노산과 일 치하는 서열도 확인되지 않았다(Fig. 1). 이 결과는 발현단백 질 OsCK1이 이미 알려진 알레르겐과 교차반응성(allergiccross- reactivity)이 일어날 가능성이 희박함을 의미한다. 서열 상동성 비교의 목적은 새롭게 발현한 단백질의 구조가 기존의 알레르겐과 어느 정도 유사한지를 평가하는 것이며 80개 또는 그 이상의 아미노산 부분에서 35% 이상의 동일성이 인정되는 경우는 새롭게 발현한 단백질과 기존의 알레르겐의 사이의 IgE 교차 반응의 가능성을 고려해야한다(Kim & Kim, 2007). 이러한 서열 상동성 비교를 위해서는 적절한 알레르기 데이터 베이스를 사용하는 것이 중요한데 현재 인터넷상으로 이용할 수 있는 데이터베이스 중에는 AllergenOnline이 충분히 검증 된 데이터베이스로서 대표적으로 활용되고 있다(Goodman et al., 2008).

GM/non GM 벼 단백질 분포 비교

GM 벼와 non-GM 벼에서 추출한 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동한 후 gel을 Coomassie Brilant Blue로 염 색한 결과(Fig. 2), 단백질 밴드가 광범위하게 분포됨을 확인 하였고 특히 50-64kDa에서 밴드가 또렷하게 관찰되는 것을 알 수 있었으며 식물체(잎)의 단백질 분포 양상에서 GM과 non GM의 단백질 구성상의 커다란 차이는 발견되지 않았다.

OsCK1 단백질의 인공 위액에서의 소화성 평가

인공 위액 조건에서 OsCK1 단백질의 소화성을 측정한 결 과(Fig. 3), 15초 이내에 완전히 분해되는 것을 확인할 수 있 었다. 이 결과를 통해 OsCK1 단백질이 GM 작물과 함께 섭 취될 경우 위액 조건에서 수 초 내에 완전히 분해될 것으로 추측할 수 있으며 OsCK1 단백질의 알레르기 유발 가능성은 없을 것으로 판단된다. 국제식품생명공학위원회(International Food Biotechnology Council)와 국제생명과학위원회(International Life Science Institute)의 공동연구에서 유전자재조합에 의해 생산된 식품의 알레르기성을 평가함에 있어 단백질의 소화성 을 중요한 판단기준으로 추천하였다(Metcalfe et al., 1996). 이미 알려진 대부분의 알레르겐들은 인공 위액조건에서 펩신 에 의한 분해에 상당한 저항성이 있는 것으로 보고되고 있는 데 이러한 상관관계는 많은 증명되지 않은 알레르기를 유발하 는 단백질이 높은 안정성을 보이는 것을 의미한다(Astwood et al., 1996; Bannon et al., 2002; Fu et al., 2002). 식품 알 레르기원들은 식품가공 공정상에서 낮은 pH에서도 안정하기 때문에 in vitro상에서 알레르기원을 평가할 때 pepsin, HCl, trypsin, chymotrypsin과 같은 인공위액, 장액상태를 만들어 pH에 대한 영향, proteases에 대한 소화성 등을 함께 평가하며 (Becker, 1997; Besler et al., 2001; Burks et al., 1992; Taylor & Lehrer, 1996) 알레르겐을 적절히 분류하고 소화에 대한 안 정성을 알레르겐 분류에 따라 검토하는 것은 식품 알레르겐과 비 알레르겐을 구별하는 중요하고도 근거 있는 파라미터의 하 나가 될 수 있다(Jiang et al., 2007).

OsCK1 단백질의 열안정성

OsCK1 단백질의 열안정성을 검정한 결과(Fig. 4), OsCK1 단백질을 100°C에서 가열하였을 때 열처리에 따른 단백질 분 해 정도가 크지는 않지만, 시간이 경과할수록 band의 강도가 조금씩 약해지는 현상을 관찰할 수 있었으며 30분 이후부터는 약하게 분해되는 것을 확인하였다. 즉, OsCK1 단백질은 100°C 이상의 온도에서 안정적이지 않은 것으로 나타났다. 식 품 알레르겐은 대부분 분자량이 10,000에서 60,000 dalton의 범위에 있는 수용성 glycoprotein이며 알레르기를 나타내기 위 해서는 면역학적으로 활성화된 형태로 위장관에 도달하여야 하므로 이러한 단백질들은 비교적 열처리나 산처리, proteolysis 에 저항력을 갖고 있으며 실제로 땅콩, 새우, 우유, 어류와 같 은 많은 알레르기를 일으키는 음식은 열에 저항력을 갖고 있 는 것으로 보고되고 있다(Bierman et al., 1996). 단백질의 열 안정성이 알레르기 안전성 평가에서 빈번히 요구되고 있지만, 열처리 조건이 표준화되어 있지 않고 확실한 가설이나 평가 방법이 정립되어 있지 않기 때문에 열안정성과 알레르기성의 상관관계가 절대적이 아니라는 보고도 있다(Xu et al., 2009; Ofori-Anti et al., 2008).

발현 단백질의 당화 여부

GM 벼에서 생산된 정제된 OsCK1 단백질 시료에 대해 당 화분석을 실시한 결과, 양성 대조군으로 사용한 horseradish peroxidase는 염색에 의해 선명한 밴드가 검출된 반면, GM 벼에서 검출 가능한 신호는 관찰되지 않았다(Fig. 5). 즉 OsCK1 단백질의 당화는 일어나지 않음을 의미한다.

본 연구에서 얻어진 결과는 국내 개발 GM벼의 알레르기 평가로 대표적인 우리나라의 주식으로 가장 많이 소비하고 있 는 쌀에 대한 알레르기 연구에 중요한 결과라 생각된다. 쌀은 아시아 지역에서 주식으로 소비되고 서구에서도 건강식으로 점차 각광받는 대표적인 곡류인데(Yum et al., 2005), 역시 주 식으로 쌀을 사용하는 일본에서는 이런 쌀에 대한 알레르기에 관해 많은 연구가 있으며 쌀과 관련된 천식이나 심한 아토피 피부염 등의 알레르기가 수차례 보고 되었다(Usui et al., 2001; Yamakawa et al., 2001; Urisu et al., 1991; Ikezawa et al., 1999). 또한 이에 대응하여 다양한 방법으로 제조한 저 항원성 쌀이 시판되고 있는 상황이나 우리나라에서는 이에 관 한 연구가 거의 없는 상태이다.

식품 알레르기를 일으키는 주요 원인은 계란, 우유, 땅콩, 콩, 밀, 생선 등으로 알려져 있는데(Sampson et al., 1996; Taylor et al., 2004) 국내에서의 쌀 알레르기에 대한 임상 보고는 희 귀하여 식품 알레르기 환자에서 제한식을 시행하는 경우에도 쌀은 그대로 섭취하는 것이 일반적이며, 식품 알레르기 질환 에서 비교적 안전한 식품으로 알려져 있다. 특히 조리된 쌀미 음은 항원성이 거의 없는 것으로 알려져 있으며 다른 식품에 는 과민 반응이 없으면서 쌀에만 알레르기가 있는 경우도 매 우 드물어 국내에서는 아직 보고된 예가 없다(Yum et al., 2005).

이번 연구를 통해 GM벼 역시 알레르기 유발 가능성이 희 박한 것으로 나타났으나 만약 삽입 단백질이 알레르기 유발성 이 알려진 것들과 유사한 경우, in vivo나 알레르기 환자 혈청 의 특이적인 IgE와의 결합성을 확인하는 ELISA, Immunoblot, RAST 등의 in vitro 실험이나 동물 모델을 포함한 임상학적인 skinpricktest등을 통해 알레르기 유발성을 확인할 필요가 있다 (Kim & Kim, 2007).

GM 식품의 안전성은 시장에 유통되기 전에 검토되기 때문 에 일반적인 안전성에 대해서는 문제가 없지만, 장기적인 섭 취에 따른 위해성 여부를 판단하기 위해서는 지속적인 감시와 평가체계가 필요하다. 특히 GM 식품의 알레르기 위해 가능성 은 위·장액에서의 분해성, 다른 알레르겐과의 구조적인 상동성 및 과량 섭취에 따른 독성효과 등이 사전에 검토되지만, 새로 운 단백질을 포함하고 있는 GM 식품이 시장에 유통되기 시 작한 이래 장기적인 섭취에 따른 잠재적인 알레르기 위해 가 능성에 대해서는 구체적인 평가가 이루어진 바 없어 이에 대 한 검증 작업이 절실히 요구된다. 특히 단백질의 구조 및 기 능과 알레르기성의 상관관계를 보다 명확히 규명할 수 있는 기법, 보다 직접적으로 알레르기성을 평가할 수 있는 in vitro 모델과 동물 모델의 개발이 필요하다고 본다. 또한 철저한 사 전 평가체계 구축 이외에 시장 유통 후 모니터링 조사를 위한 방법 개발과 알레르기 문제 발생시 이를 확인 검증할 수 있는 체계 구축도 필요할 것으로 생각된다.

적 요

본 연구의 목적은 우리나라에서 개발된 병저항성 GM벼의 알레르기 유발성을 평가하고자 하였다. 벼 유래의 Choline kinase 1 유전자(OsCK1)를 과발현 하도록 형질전환한 벼를 이용하여 알레르기 유발인자와 상동성이 있는지 확인한 결과, 연속되는 80개 이상의 아미노산 절편에서 35% 이상의 상동성 을 보이는 서열은 없었으며 8개씩의 인접 아미노산과 일치하 는 서열도 확인되지 않았다. 또한 GM벼와 non-GM 벼 사이 의 단백질 분포가 일치하는 것을 확인하였으며, 인공 위액에 서 빠르게 분해됨을 확인하였다. 발현단백질의 당화 발생 여 부를 확인한 결과, OsCK1단백질에 대한 당화는 발생하지 않 는 것을 알 수 있었으며 열안정성 검사에서OsCK1 단백질을 100°C에서 가열하였을 때 30분 이후부터는 약하게 분해됨을 확인하였다. 본 연구의 결과를 통해 병저항성 GM벼는 알레르 기 유발과는 상관관계가 없음을 확인하였다.