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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agriculture Vol.27 No.2 pp.231-240
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2015.27.2.231

Viral Vector System for Production of Pharmaceutical Proteins

Sun-Hee Kim, Han-Chul Kang, Kyung-Hee Roh, Hyun Uk Kim, Kyeong-Ryeol Lee, Won-Yong Kim*, Jong-Hwa Park**, In-Sig Chung**, Jong-Bum Kim†
Department of Agricultural Biotechnology, National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Jeonju 560-500, Republic of Korea
*Medical School, Chung Ang University
**Department of Natural Sciences, Kyung Hee University
Corresponding author: (Phone) +82-10-3294-3294 jong9571@korea.kr
October 21, 2014 June 12, 2015 June 19, 2015

Abstract

Most of pharmaceutical proteins are usually produced by the animal, insect cell and yeast culture. The proteins must be produced in strictly controlled-facilities, which is one of major causes for increasing production cost. So, in spite of increasing demand on the proteins in worldwide, their generalization has been very restrictive. To decrease the production cost, many scientists have been interested in production of pharmaceutical proteins by using the plant system for a long time. The plant system must be alternative production means, for it is easily scalable, more production cost effective, and safer than animal system. For this purpose, several techniques have been developed: stable expression by transformation of nuclear and chloroplast genome and transient expression by viral vectors. Among them, the deconstructed viral vector system has made it possible to produce recombinant proteins massively, rapidly, and transiently. So, the plant viral expression systems might be a suitable platform for production of pharmaceutical proteins in plants. In this review, we will describe the plant viral vector systems and their application.

Viral vector , pharmaceutical protein , plant system , recombinant protein

의료용 단백질 생산을 위한 바이러스 운반체 시스템

김 순희, 강 한철, 노 경희, 김 현욱, 이 경렬, 김 원용*, 박 종화**, 정 인식**, 김 종범†
농촌진흥청 국립농업과학원 농업생명자원부
*중앙대학교 의과대학
**경희대학교 자연과학대학

초록

    Rural Development Administration
    PJ0095532014

    재조합단백질 생산 시스템으로서 식물의 이용은 지난 20 년 이상 활발하게 연구되었다. 식물은 단백질 생산 공장으로서 매력이 있는 시스템이다. 왜냐하면 생산물들을 효과적으로 대 량생산할 수 있고, 지속가능하며, 어떤 조건하에서도 생산비용 을 절감할 수 있기 때문이다(Hood et al., 1999, Giddings, 2001). 식물시스템은 포유동물 세포나 또는 형질전환 동물시스 템보다 인체 미생물 병원균에 대한 감염 가능성은 거의 없다. 여기에 덧붙여서 식물은 소포체가 있어서 포유동물세포와 유 사한 방출경로를 가지고 있으므로(Vitale and Pedrazzini, 2005) 번역후 수정을 통하여 당쇄를 가진 단백질로 재구성될 수 있다.

    식물에서 외래 단백질들을 발현시키기 위하여 일반적으로 이 용되는 방법이 세 가지가 있다. 즉, 1) 핵 형질전환, 2) 엽록체 형질전환, 3) 식물 바이러스 운반체를 이용한 일시적 형질전환 이다. 핵 형질전환은 주로 Agrobacterium tumefaciens 매개로 이루어지는데 목표로 하는 외래 유전자를 포함하는 발현 카세 트가 식물세포 핵으로 전달되어 무작위적 위치에 융합된다. 이 형질전환체는 다음 세대로 유전되며 영양번식으로 또는 종자 에 의하여 번식될 수 있다. 그러므로 단백질 생산을 위하여 쉽 게 규모화 할 수 있다. 그러나 대개의 경우 발현양이 너무 적 은 결점이 있고 화분 비산에 의한 환경위해성 문제가 제기되 기도 한다. 엽록체 형질전환은 발현양을 증대시키기 위하여 고 안되어 이용되고 있는 방법으로서 biolistic 방법(유전자총)으로 수행된다. 사실 하나의 엽록체는 세포 한 개당 수 십에서 수 백 개가 포함되어 있기 때문에 엽록체 DNA에 하나의 유전자 가 삽입되어 형질전환된 엽록체로 균질화 될 경우 수 십에서 수 백 개의 유전자 사본(gene copy)이 들어 있는 효과를 나타 낼 수 있다. 그리고 엽록체 형질전환체의 전환유전자는 모계유 전이 되므로 꽃가루 분산에 의한 잠재적 전환유전자의 비산 위험성을 감소시킬 수 있다. 그러나 세균세포와 비슷하게 엽 록체는 진핵세포의 당쇄화와 같은 해석후 수정을 수행할 수 없다. 결과적으로 이 기술은 당쇄화가 필수적인 단백질을 생 산하기 위해서는 적절치 않다(Bock, 2007). 식물 바이러스 운 반체를 이용한 일시적 형질전환은 바이러스 유전자의 복제를 이용하는 것이다. 이들 바이러스는 작고, 쉽게 조작될 수 있으 며, 감염과정은 상대적으로 단순하다. 위의 특성은 바이러스 운반체를 식물에서 외래유전자를 발현하기 위한 시스템으로 관심을 끌게 한다. 바이러스 운반체 시스템은 목표로 하는 유 전자가 바이러스 복제 요소 사이에 삽입되고, 식물 핵에서 염 색체의 복제와 상관없이 독립적으로 증폭되고, 이어서 식물 세 포질에서 단백질로 해석되며 필요에 따라서 당쇄화된 단백질 을 생산할 수도 있다. 대부분의 바이러스 운반체를 이용한 일 시적 발현은 담배와 같은 비식용 식물에 응용되고 있어서 의 약품으로서 이용되기 전에 정제과정이 더 필요하다. 그러나 바 이러스 운반체를 이용한 식물에서의 재조합단백질 생산은 온 실에서나 포장에서나 어디서든지 수행될 수 있기 때문에 실제 적으로 생산시설에 많은 투자나 배양배지를 요구하는 것이 아 니므로 배양액을 사용하는 것 보다 더 경제적으로 규모화할 수 있다. 본 총설에서는 의료용 단백질 생산을 위하여 이용되 는 식물 바이러스 운반체 시스템과 이를 이용한 다양한 단백 질 생산에 대한 정보를 제공할 것이다.

    생산주체로서의 식물의 특징

    동물 단백질을 대량생산하기 위해 의료산업계에서는 여러 가지 복잡한 단백질이나 펩타이드를 생산하기 위한 혼합 발현 계의 개발을 요구하고 있다. 생산주체에는 세균에서부터 효모, 곤충, 포유동물과 식물세포와 같은 진핵생물 모두가 포함된다.

    세균은 상대적으로 많은 양의 단백질을 생산할 수 있지만, 불용성 봉입체(Inclusion bodies)를 만드는 경우가 많으며, 또 한 번역 후 변형 공정에 한계가 있다. 반면에 진핵세포 발현 계는 서로 다른 번역 후 공정으로 인해 원래 의도했던 단백질 과 꼭 같지 않는 단백질을 만들 수도 있지만, 단백질에 당을 접합시킬 수 있고 번역 후 공정 과정을 수행할 수 있다. 식물 생산시스템은 현재 외래단백질을 합성하기 위하여 상업적으로 이용되고 있으며, 식물세포의 번역 후 변형은 동물세포에서 이 루어지는 것과 매우 유사하여 정확하게 복합 단백질 (Multimeric protein)을 생성할 수 있다. 식물유래 동물단백질 의 경우 당화(Glycosylation)되는 아미노산 잔기는 원래의 단 백질에서와 동일하게 일어난다. 그러나 식물세포의 분비경로 에 있는 N-linked glycan의 공정은 동물 발현계에서 생산된 것보다 다양한 형태의 당화를 보이지만, 당 단백질의 활성은 그대로 유지되는 경우가 많다.

    식물을 이용하여 재조합단백질을 대량생산하는데는 많은 장 점들이 있다. 즉, 비교적 적은 비용으로 대규모 생산이 가능하 고, 수확에서 공정까지 기존 시설을 이용할 수 있다. 분자농업 을 위한 초기 비용이 세포배양보다 훨씬 적게 들뿐만 아니라 공기 중의 탄소원과 태양에너지를 근원적인 에너지원으로 사 용하기 때문에 생산단가가 절대적으로 저렴하다. 식물체는 무 한정 존재하는 대기 중의 이산화탄소를 사용하여 대사 과정을 거쳐 단백질 및 복잡한 유기화합물을 무한대로 합성해 낼 수 있고, 전문배양 기술자도 필요로 하지 않는다. 또한 식물 내에 서 생산된 단백질은 인체에서와 매우 유사한 접힘(Folding) 형 태를 지닌다. 특히 식물 발현계는 미생물과 동물세포를 이용 하는 것보다 안전성에 있어서도 많은 장점이 있다. 동물세포 를 이용하여 생산된 항원단백질은 바이러스, 암 유발 DNA와 프리온 등을 걸러내야 하기 때문에 상당한 공정비용이 추가된 다. 사실 생산비용을 제외하고서도 백신단백질 생산과 관련된 비용의 85% 이상이 생산 단계보다 오히려 추출하고 공정하는 생산 이후의 과정에 소요된다. 그러나 식용백신의 경우 단백 질의 생산주체로서 식물을 이용할 경우 이들 과정을 거치지 않아도 된다. 따라서 동물세포를 이용하는 것의 0.1%의 비용 으로 백신 생산이 가능하다.

    식물 바이러스 운반체

    초기 식물바이러스 발현시스템은 Caulioviridae속의 이중가 닥 DNA 게놈을 갖는 유일한 식물바이러스인 cauliflower mosaic virus(CaMV)에 기초를 두고 있다. 그러나 제한된 packaging capacity와 필수적인 기능에 영향을 주지 않을 만큼 의 제거될 수 있는 바이러스 DNA의 제한된 양이 이들 초창 기 발현시스템의 응용성을 제한하였다. 다행히 분자생물학적 기술의 진보로 RNA template로부터 cDNA를 생성할 수 있게 되었고, 이로 인하여 자연계에서 식물바이러스의 가장 대표적 인 형태인 단일사슬 RNA 바이러스를 이용한 발현시스템 연 구로 연구의 폭을 넓힐 수 있었다. 또 다른 기술적 발전은 바 이러스 감염을 촉진하기 위하여 Agrobacterium tumefaciens를 이용하는 것이다(Grimsley et al., 1986; Turpen et al., 1993). 일반적으로 바이러스의 감염은 잎에 감염 바이러스 입 자를 물리적 접종에 의하여 개시될 수 있거나 또는 핵산의 transfection에 의하여 개시될 수 있다. Agroinfection이라고 알 려진 기술은 Agrobacterium tumefaciens를 이용하여 cDNA를 식물세포핵으로 직접적이고 효과적으로 targeting할 수 있게 한 다. 식물발현 카세트에 있어서 cDNA 구조는 감염, 기주세포 핵산 전사와 공정 후에 일어나는 핵산의 자동복제를 수반하게 된다. 더구나 agroinfection은 자연계에서 기계적으로 이동될 수 없는 바이러스의 이용을 가능하게 하였고, 감염과정을 개 시하기 위한 특별한 곤충 매개체를 대신 할 수 있었다. 이러 한 바이러스 발현시스템을 이용하여 많은 의료용 단백질 또는 백신들이 개발되고 있다(Table 1). 이들 바이러스 운반체는 일 반적으로 유전자 치환 운반체, 유전자 삽입 운반체, modular 또는 deconstructed 운반체 시스템과 peptide display 시스템으 로 분류된다(Lico et al., 2008).

    유전자 치환 운반체

    유전자 치환 운반체는 목표로 하고 있는 외래 유전자와 내 부 바이러스 염기서열을 맞교환하는 것을 기반으로 하는 운반 체이다. 식물에서 처음으로 성공한 외래유전자 발현은 CaMV 에 기초한 치환운반체를 이용하여 얻어졌다. 일반적으로 피막 단백질(coat protein, CP) 유전자는 외래유전자와 대체될 수 있으며 몇몇 예외적인 경우를 제외하고는 피막단백질은 세포 에서 세포로 또는 세포에서 식물체 전체로의 이동과 감염에 필수적이다. 그러나 예외적인 경우가 있는데 tomato bushy stunt virus(TBSV)를 이용하여 개발된 운반체의 경우 피막단백 질은 모든 담배 종에 대하여 바이러스 전신이동에 반드시 필 요한 것이 아니다(Scholthof et al., 1993). TMV 기반 치환 운반체는 피막단백질이 전신감염에 필요하며 chloramphenicol acetyl transferase(CAT)-CP 유전자 치환운반체는 접종된 잎의 병반에서만 지엽적으로 CAT 활성이 한정되어 나타났다 (Takamatsu et al., 1987). 최근에 개발된 또다른 TMV기반 치환 운반체(Musiychuk et al., 2007)는 CP 유전자가 온도안 전성을 갖는 분자인 Clostridium thermocellum 유래 beta-1,3- 1,4-glucanase(lichenase)에 목표 유전자가 융합되어 치환된 경 우 목표 단백질의 발현과 안전성이 증진되고 정제가 용이하게 되었다. lichenase는 고온 (65°C)에 저항성이 있으므로 lichenase에 목표 단백질을 융합할 경우 열처리에 의하여 추출 물에 함유된 식물단백질의 50%까지 침전시킴으로 목표단백질 의 정제를 용이하게 하였다. 즉 linchenase의 N- 또는 C-말단 에 융합되었거나 또는 효소의 중심부위에 삽입된 목표 단백질 은 고온처리에 인한 파괴로부터 보호되었다.

    유전자 삽입 운반체

    TMV와 potato virus X (PVX) 기반의 운반체

    유전자 삽입 운반체는 목표 단백질이 open reading frame (ORF)내에 삽입된 완전한 기능을 갖는 바이러스를 구성하며 세포에서 세포로 그리고 전신이동 및 감염을 할 수 있고 구형 또는 막대형 입자를 갖는다. 구형 입자를 갖는 바이러스들은 삽입된 핵산의 양에 덜 제한적이기 때문에 이용성이 보다 더 다양해질 수 있다. 그러나 chimeric 막대형 virion 기반 운반 체는 게놈 크기에 제한적이다. 즉 어떤 한계를 넘는 크기의 게놈을 갖는 chimeric 운반체는 virion 재결합을 유지할 수 없 다. 가장 널리 알려진 유전자 삽입운반체가 2종 있는데 TMV 와 potato virus X (PVX) 기반의 운반체이다. 이 2종의 바이 러스는 단일가닥의 RNA 게놈을 갖는다. 이 바이러스들은 subgenomic RNA의 외래 ORF를 발현하기 위하여 subgenomic 프로모터를 이용하고 나선형 virion symmetry를 갖게 되어서 막대모양의 입자를 형성하게 된다. Chimeric TMV 운반체는 이동단백질(MP)와 CP 유전자사이에 CAT 유전자가 삽입되어 제조되었다. 이 유전자의 발현은 CP유전자에 연결된 subgenomic 프로모터의 조절을 받는다. 이 운반체는 subgenomic RNA를 형성하기 위하여 이중복제 될 수 있으며 정확하게 바이러스 입자로 재조립되고 reporter 유전자는 활성을 보인다. 그러나 subgenomic 프로모터의 이중복제는 동종재조합(homologous recombination)으로 인하여 외래유전자가 소실될 수 있다. 이 문제는 Tobamovirus속의 다른 바이러스로부터 유래한 subgenomic 프로모터를 이용함으로써 해결되었다. 이중 복제된 subgenomic 프로모터들 간의 재조합의 문제와 해결책은 담배 (N. benthamiana)에 대하여 grapevine virus A (GVA) 기반 삽입운반체 시스템에서 보고되었다(Haviv et al., 2006). TMV 와 유사한 PVX 기반 운반체는 CP 유전자의 이중프로모터를 이용하여 제작되었는데 이 운반체는 안정적이어서 삽입된 유 전자 염기서열이 소실되지 않고 계속 유지되었다(Chapman et al., 1992). 그럼에도 불구하고 최근에는 목표유전자의 삽입되 는 크기가 PVX 발현 운반체의 안전성에 결정적으로 중요한 역할을 하며 목표유전자의 소실속도와 그 길이 사이에 정적인 상관관계가 있다고 보고되고 있다(Avensani et al., 2007).

    Cowpea Mosaic Virus (CPMV) 기반 운반체

    Cowpea Mosaic Virus(CPMV)는 Comoviridae속으로서 단 일가닥 positive RNA에 의하여 구성된 두 개의 게놈을 갖는 다. RNA-1은 복제에 관련된 단백질들을 암호화하고 있고, RNA-2는 이동과 구조단백질들에 대한 유전정보를 포함하고 있다. 이 시스템은 이용성이 매우 다양하다. 즉, 증폭을 유지 하기 위하여 RNA-1과 목적하는 유전자를 포함하는 RNA-2를 두 개의 분리된 cDNA로 wild-type 식물을 co-infiltrating 하 므로 이 두 게놈을 모두 일시적 발현에 이용될 수 있다. 또한 이것은 형질전환 식물과 virus-mediated 일시적 발현을 결합하 는데 이용될 수 있다. 이 경우 RNA-2는 먼저 식물에 형질전 환 되고 그리고 RNA-2와 외래 유전자의 활발한 복제에 필요 한 RNA-1은 agro-infiltration에 의하여 식물에 도입된다. 여기 서 RNA-2만으로는 감염성이 있는 클론을 생산할 수 없으므 로 환경오염에 대한 우려를 예방하는데 이용될 수 있다(Liu et al., 2005, Sainsbury et al., 2008). 결론적으로 만일 RNA-1 이 핵에 형질전환되어 형질전환 계통과 교배에 의하여 RNA- 1이 보충된다면 유도성 발현시스템을 제작하는 것도 가능하다 (Canizares et al., 2006).

    Modular 또는 deconstructed 운반체

    Modular 또는 deconstructed 운반체는 제2세대 바이러스 발 현 시스템으로서 다음과 같은 개념을 바탕으로 개발이 이루어 졌다. 1) 모든 바이러스 요소들은 발현운반체에 꼭 필요하거 나 도움이 되는 것은 아니다. 2) 바이러스들은 서로 다른 게 놈 요소로 해체될 수 있다. 감염과정에서 wild-type의 여러 개 의 게놈 바이러스처럼 여전히 함께 작동한다. 더구나 agroinfection은 여러 개의 서로 다른 요소들을 함께 운반할 수 있는 기술적 가능성을 제공한다. 그러므로 modular 시스템 에서는 바이러스 요소들이 분명한 부분으로 분리되어 binary 운반체로 삽입되어 Agrobacterium내에 포함되게 된다. 이 strain은 식물 잎으로 함께 섞여서 co-infiltration된다. 이 방법 은 복제되는 부분 즉 replicon이라 불리는 부분의 꼭 필요한 부분만을 최소한으로 포함하고 전환유전자의 수용 가능한 삽 입 크기를 크게 한다. 그리고 운반체 기능에 필요한 다른 바 이러스 요소들은 감염과정동안 in trans로 제공된다(Gleba et al, 2013).

    (1)TMV 기반의 운반체

    현재 가장 유명하고 넓게 이용되는 운반체는 Icon Genetics 사(Halle, Germany)가 개발한 TMV 기반 deconstructed 시스 템이다. 이 운반체는 TMV 게놈을 2개의 주요한 cDNA module로 나누어서 조작되었다. 5‘-module은 바이러스 RNAdependent RNA polymerase와 MP를 포함하고, 3’-module은 목표하는 유전자와 운반체의 충분한 복제와 증폭에 필수적인 바이러스의 3‘ untranslated region(UTR)을 수반한다. 이와 같 이 특별한 경우는 바이러스의 기능이 in trans로 보완되지만 실제적으로 2개의 module은 세 번째 Agrobacterium cell line 에 의하여 운반되는 site specific recombinase에 의하여 함께 재구성된다. 더구나 서로 다른 5’ module은 서로 다른 미소기 관을 targeting하는 signal을 수반하고 있어서 세포내 다른 구 획에 단백질들을 집적되게 함으로 발현수준을 극적으로 증진 시키도록 하였다. 또한 발현증진을 위하여 5’ module의 암호 화 염기서열에 여러 개의 intron을 가지고 있는 경우도 있다 (Marilonnet et al., 2004; 2005). 대개의 경우 발현수준은 상 당히 증진되며 생체중(fresh weight) 1 gram당 재조합 단백질 을 최고 5mg까지 생산할 수 있다. 이 시스템은 항체, 항체유 도체, 인터페론, 성장호르몬, 세균 및 바이러스 항원, 보조제 및 효소를 암호화하는 서로 다른 유전자를 이용하여 폭넓게 검정되었다(Gleba et al., 2005).

    (2)Bean yellow dwarf virus(BeYDV)기반의 운반체

    Geminivirus속의 BeYDV는 단일가닥의 환형 DNA 바이러 스로서 감염 세포의 핵 내에서 rolling circle 방법으로 복제되 기 때문에 게놈을 대량 증폭시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 BeYDV 기반 시스템은 MP와 CP 유전자를 없앴기 때문 에 결과적으로 목표 단백질의 발현은 접종부위에 한정된다. 이 기본 version은 두 개의 module을 포한한다. 첫 번째 module 은 BeYDV의 long intragenic region (LIR)과 short intragenic region (SIR) 사이에 목표 유전자를 삽입하는데 이 두 개의 intragenic region 사이의 intergenic region은 rolling circle 복 제를 유지하는데 필수적이다. 목표유전자의 발현은 강력한 식 물 특이 항상성 프로모터에 의하여 유도된다. 두 번째 module 은 Rep 단백질의 발현을 담당하는 것으로서 rolling circle 복 제를 여러 가지 관점에서 촉매한다. 이 시스템은 처음에는 담 배 세포 배양에서 발현운반체로서만 이용되었다(Mor et al., 2003) 그러나 agroinfection 기술 개발로 잎 전체에 응용하기 까지 확대되었다. 이 시스템 module의 특징은 replicon 증폭과 전환유전자 발현에 도움이 되는 서로 다른 바이러스 또는 바 이러스가 아닌 다른 생물체 origin을 이용하여 다양한 염기서 열의 공동발현을 유도할 수 있다는 것이다. 예를 든다면, posttranscriptional gene silencing (PTGS) 저해 단백질 유전자들 은 PTGS를 방해하기 위하여 동시 발현될 수 있으므로 목표 단백질의 집적을 증진시킬 수 있다.

    Display 바이러스 운반체

    Display 바이러스 운반체는 다른 여러 종류의 peptide들이 바이러스 CP와 융합되어 chimeric 바이러스 입자(CVPs) 표면 에 노출되도록 molecular scaffolding을 제공하기 위하여 폭넓 게 이용되어 왔다. 여러 종류의 식물바이러스의 피막단백질 유 전자는 virion 표면에 잘 노출되는 것으로 알려진 특정한 영역 에 외래 peptide의 암호화서열과 융합되고(Johnson et al., 1997; Porta and Lomonossof, 1998), 이 바이러스와 식물 기 주는 chimeric 융합단백질의 대량생산을 위한 발현시스템으로 이용된다. 사실 이와 같은 운반체는 바이러스의 조립과 이동 방법 및 구조 등에 대하여 특성이 잘 구명된 바이러스에 대해 서만 가능하다. 융합은 정상적인 조립과 바이러스 적합성과 조 화를 이루어야 하고 가능한 입체적 구조를 만드는데 장애가 되는 것과 바이러스의 이동을 방해하는 것을 피해야 한다. CVP에 대한 정확한 노출을 위한 peptide를 밝히는 것이 이 분야 연구에서 특히 관심 있는 분야이다(Bendahmane et al., 1999; Porta et al., 2003; Lico et al., 2006). 길이가 긴 peptided와 다루기가 까다로운 peptide의 조립문제를 극복하기 위하여 두 개의 방법이 개발되었다. 하나의 방법은 CP의 stop codon이 leaky fashion으로 작용하도록 3’-말단을 변형시키는 것이다. 이와 같은 경우 생산된 대부분의 CP는 융합되지 않게 되고, 반면에 일부는 표면에 노출된 peptide에 융합된다 (Hamamto et al., 1993; Sugiyama et al., 1995; Borovsky et al., 2006). 다른 하나의 방법은 구제역 바이러스(FMDV)의 2A를 이용하는 것이다. 즉 이 2A 염기서열이 epitope 암호화 서열과 CP 유전자의 5’말단 사이에 삽입되고, 단백질 생성과정 동안 ribosomal skip을 하게 된다(Donnelly et al., 2001; de Felipe et al., 2003). 그 결과 단백질산물의 일부분만 외래 peptide서열과 CP사이에 융합이 이루어진다. 이와 같은 방법 을 백신생산에 이용할 경우 백신 혼합제중의 항원단백질의 정 확한 양에 대하여 의문이 제기될 수 있다. 많은 식물바이러스 들이 서로 다른 종류의 peptide을 노출하기 위하여 이용되는 데, 이와 같은 목적을 위하여 가장 광범위하게 이용되는 바이 러스에는 CPMV, TMV, PVX 등이 있다. 이들 바이러스들에 대하여 원자수준에서 대칭성, 모형 및 구조에 대한 심도 있는 연구가 이루어져왔고 이것이 peptide 삽입을 위한 특정 위치 를 정확하게 결정하게 하고 또한 성공적으로 노출시킬 수 있 게 하였다.

    전 망

    식물을 이용한 의료용 단백질 생산은 여러 가지 측면에서 많은 장점을 가지고 있다. 특히 저렴한 비용으로 대량생산할 수 있다는 것과 2차 감염의 위험성을 배제할 수 있고, 특정한 시설이나 기술을 필요로 하지 않는다. 핵 형질전환의 경우 적 은 발현량과 화분비산에 의한 환경위해성문제, 엽록체 형질전 환의 경우 기능성이 있는 인체 의료용 단백질은 당단백질인데 당쇄를 추가하는 후공정과정이 없는 문제가 있다. 그러나 식 물 바이러스를 이용한 일시적 발현 형질전환은 대량생산과 당 쇄화 문제들을 해결할 수 있는 방법이 되지만 gene silencing 문제와 식물체 잎 또는 전초에서 생산된 단백질을 분리정제 해야 하는 문제가 있다. 지금까지 gene silencing 문제를 해결 하기 위하여 저해 단백질을 공동 발현시킴으로 많은 부분에서 극복하였으나 보다 더 효과적인 식물기주 시스템과 다양하고 효율적인 gene silencing 저해단백질 유전자 분리 및 기주식물 에 따른 최적화된 다양한 발현운반체 개발이 이루어질 전망이 다. 그리고 모든 식물유래 의료용 단백질을 실제 인체에 적용 하기 위하여 풀어야 할 숙제가 있는데 바로 분리정제 하는 문 제이다. 식물은 플라보노이드, 카로테노이드, 알칼로이드 등과 같은 2차 대사물질을 상당량 포함하고 있다. 식용백신으로 사 용할 경우는 완전정제까지는 요구되지 않을지라도 주사용 백 신이나 의료용 단백질을 생산 및 이용하고자 한다면 이 2차 대사물질들을 완전히 제거해야 하기 때문에 재배방법 개선에 의한 2차대사물질 함량을 최소화하고 간편하고 효율적인 방법 으로 정제할 수 있는 방법을 찾아야 할 것이다. 한편 현재 식 물유래 다양한 의료용 단백질들이 임상단계에 있는 것들이 많 이 있다(Table 2). 가까운 장래에 바이러스 운반체를 이용하여 식물로부터 다양한 의료용 단백질들이 대량생산됨으로써 가격 에 부담을 갖지 않고 일반화될 것으로 기대된다.

    적 요

    현재 인간이 일반적으로 이용하는 의료용 단백질은 대개 동 물세포 배양기술에 의하여 생산되고 있다. 그러나 제한된 특 정 시설에서 생산되기 때문에 생산 단가가 높아서 전세계의 수요가 증가함에도 불구하고 일반화하는 데는 한계가 있는 실 정이다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 오래전부터 식물시스 템을 이용하여 의료용 단백질을 생산하는 연구가 관심을 끌고 있다. 즉 쉽게 규모화할 수 있고 생산비용 효과도 경제적이고 동물세포보다 더 안전하게 의료용 단백질 생산할 수 있는 수 단이 될 수 있기 때문이다. 이를 위하여 식물에 안정적으로 유전자를 핵 게놈과 엽록체 게놈에 형질전환 시키는 기술과 바이러스 운반체를 이용하여 일시적 발현을 유도함으로 의료 용 단백질을 생산하는 기술이 개발되고 있다. 최근 해체 바이 러스 기반의 운반체 개발은 재조합 단백질을 빠르고 일시적 발현으로 대량생산을 가능하게 하고 있다. 따라서 이 바이러 스 발현시스템이 적절한 식물기반의 대량생산을 위한 플렛폼 을 제공하고 있다. 따라서 본 총설은 식물로부터 의료용 단백 질을 생산하는데 있어서 식물 바이러스발현 시스템 개발 및 이용에 대하여 기술하였다.

    Figure

    Table

    Plant viral vectors used for vaccine antigen, monoclonal antibody and therapeutic protein production (Yusibov et al., 2013)

    Abbreviations: AlMV, Alfalfa mosaic virus; BaMV, Bamboo mosaic virus; CMV, Cucumber mosaic virus; CP, capsid protein; CPMV, Cowpea mosaic virus; CRPV, Cutaneous rabbit papillomavirus; CTB, Cholera toxin B subunit; FMDV, Foot and mouth disease virus; HCV, Hepatitis C virus; HIV, Human immunodeficiency virus; HPV, Human papillomavirus; HRV, Human rhinovirus; HVR1, Hypervariable region 1; mAb, monoclonal antibody; N/A, not accessed; NDV, Newcastle disease virus; PPV, Plum pox potyvirus; PVX, Potato virus X; ROPV, Rabbit oral papillomavirus; RSV, Respiratory syncytial virus; scFv, single-chain Ig containing VH/VL domains; TBSV, Tomato bushy stunt virus; TMV, Tobacco mosaic virus; TNVA, Tobacco necrosis virus A; VLP, Virus-like particle; ZYMV, Zucchini yellow mosaic virus;

    Examples of plant-derived pharmaceutical proteins produced via agroinfiltration

    Abbreviations: HA, hemagglutinin; VLP, virus-like particle; HBcAg, hepatitis B core antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HIV, human immunodeficiency retrovirus; Pr55gag, major core protein Gag precursor; WNV, West Nile virus; PreM/M, premembrane and membrane protein; E, envelope protein; mAb, monoclonal antibody; NVCP, Norwalk virus capsid protein; DIII, domain III of envelope protein.

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