배추과(Brassicaceae)는 338속, 약 3700여종을 포함하는 식 물군으로 특히 배추속(Brassica)은 배추(B. rapa), 양배추(B. oleracea), 유채(B. napus) 등을 포함한다(Beilstein et al., 2006). 배추속(Brassica) 작물들은 채소, 유지작물, 그리고 사료 작물과 같은 중요한 경제적 가치 때문에 전세계적으로 널리 재 배되고 있으며, 항암물질로 알려진 글루코시놀레이트의 함량이 높은 것으로 알려지면서 기능성 채소 작물로서도 각광을 받고 있다(Zang et al., 2009). 최근에는 U’s triangle로 알려진 식물 종의 게놈간 연관성 및 배수성 연구를 위한 중요한 학문적 가 치 때문에 차세대 염기서열 분석기술(NGS)을 이용한 배추속 식물의 유전체 분석 연구가 활발하게 진행되고 있다(Wang et al., 2011). 이러한 유전체 정보는 식물 유전체간 비교 연구를 통해 종간 진화관계를 밝히는 정보를 제공할 뿐만 아니라 유 용 유전자 탐색 및 분자 표지 개발에 활용이 가능하다. 타가수 정작물로서 자가불화합성이 높은 배추속 작물의 비교 유전체 및 유전자 기능 분자 마커 개발 연구를 위해서는 형질이 고정 된 동형접합성 유전자원의 확보가 이루어져야 한다(Pink et al., 2008). 그러나 배추속 작물은 자가불화합성이 뚜렷하여 개화꽃 수분이 안되므로 미숙화분을 열개하여 성숙한 꽃의 화분을 붙 여주는 뇌수분을 해야 할 뿐 아니라, 최소한 6~7세대 Single Seed Descent (SSD)에 의해 고정시켜야 하므로 고정된 계통을 육성하는데 많은 노력과 시간이 소요된다. 이러한 문제점을 해 결하기 위해서 반수성 세포에서 식물체를 유도하여 염색체를 배가시키는 방법으로 단기간에 동형접합성 식물체를 얻는 반 수체 육종법이 지속적으로 시도되었다(Cao et al., 1994; Jo et al., 2012).

피자식물은 일반적으로 수정을 통하여 접합체를 형성한 후 세포분열 등의 과정을 거쳐 종자로 발달하여 이배성을 갖는 개 체를 형성하게 된다. 그러나 기내배양을 이용하여 난핵 또는 웅핵의 반수성 세포가 단독으로 세포분열을 하여 배를 형성하 게 할 수 있는데 이러한 식물체의 경우 정상 식물체와 비교하 여 반수의 염색체만 가지는 반수체(haploid)를 형성한다. 반수 체는 염색체 배가를 통해 동형 접합체(homozygote)를 빠른 시 일 내에 만들어 낼 수 있기 때문에 자가수분을 통한 육종 연 한을 크게 단축시킬 수 있다. 또한 반수체는 이배체(diploid) 식물에서 발현되지 않는 우량 열성형질의 표현형을 선발하기 에 매우 유리할 뿐만 아니라 배수성이 다른 종간 교잡에 활용 되는 등 많은 분야에서 사용되고 있다(Lhee et al., 1997). 반 수체를 유도하기 위해서는 일반적으로 웅성배우체인 약(anther) 또는 소포자(microspore)를 이용하거나 자성배우체 기관인 배 주(ovule)를 배양 재료로 이용한다(Harberd, 1969; Ferrier et al., 1995). Shimakura (1934)는 최초로 꽃가루의 기내 배양을 시도하였고 Guha & Maheshwari(1964)는 독말풀(Datura innoxia)의 약배양을 통해 반수체 유기에 성공하였다. 이후 많 은 식물체에서 약배양 및 배주 배양을 통한 반수체 유도가 활 발하게 진행되었고 벼, 담배 및 과수류인 사과에서도 반수체 배양 기술이 보고되었다(Kim & Raghavan, 1988; Touraev et al., 1996; Zhang et al., 1992). 배추속 작물의 경우 배추, 브로콜리 및 유채 등의 식물에서 반수체 유도에 성공하였으나 아직까지 품종에 따라서는 반수체 유도가 어렵거나 매우 낮은 비율로 유도되고 있는 실정이다(Lichter, 1982; Ferrie et al., 1995; Na et al., 2011).

본 논문에서는 경제적, 학문적으로 중요한 가치를 가진 배 추속 작물의 유전체 연구 및 분자육종 연구에 소재로써 활용 할 수 있는 반수체 식물의 유도 현황과 효과적인 기내 반수체 유도 방법에 대해 서술하고자 한다.

본 론

배주배양

배주배양은 수정되지 않은 배주를 자방으로부터 분리하여 반수체를 생산하는 방법으로 White (1932)에 의해 처음으로 시도된 이후 Maheshwari (1958)는 최초로 금어초(Antirrhium majus)와 양귀비(Papaver somniferum)의 배주 배양을 통하여 성숙 종자를 획득하는 데 성공하였다. 이를 시작으로 다양한 식물에서 배주배양을 통한 반수체 식물체가 생산되었고, 배추 속 식물에서는 Harberd (1969)와 Lhee et al. (1997)이 종속 간 잡종식물체를 생산하기 위하여 접합체의 배주를 채취한 후 어린 배를 기내 배양하여 유식물체를 획득하였다(Table 1). 배 주배양은 어린 배를 채취하는 배배양과 비교하여 어려운 배의 적출과정을 거치지 않고 배주를 이용하여 배지에 배양하는 방 법으로 종속간 잡종식물 및 기내수분을 통한 잡종식물의 생산 이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 배추속 식물에서는 배주 배양을 이용한 배추와 무의 속간 잡종(Lhee et al., 1997) 및 B. napus × B. juncea (Bajaj et al., 1986), B. oleracea × B. campestris (Matsuzawa, 1983)의 종간 잡종 등이 육성되었다. 이러한 종속간 잡종의 배주배양에는 배양 배지 내 호르몬 및 첨가물등 다양한 요인이 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 성공적인 배주배양을 위해서는 부계 및 모계 유전형의 교잡조 합이 배의 발아율에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Lu et al., 2001).

약배양

약배양은 화분으로 완전하게 발달하기 전의 약을 기내배양 하여 감수분열에 의한 웅성 반수체를 유도하는 방법으로 다양 한 식물에서 약배양을 통한 반수체 생산이 시도되고 있다 (Wheatley et al., 1986; Buter et al., 1993). 배추속 식물에 서는 Keller & Amstrong(1977, 1978, 1979, 1983)이 유채 및 배추에서 약배양을 통한 반수체 식물생산에 성공하였고 이 후 다양한 배추속 식물에서 약배양을 통한 반수체 식물의 유 도가 시도되었다(Table 1). 약배양에는 식물의 유전형, 생육환 경, 약 분리 시기 및 배양 배지의 조성 등 다양한 요인이 영 향을 미치는 것으로 알려져 있다(Phippen & Ockendon, 1990; Farnham, 1998). 특히 약을 분리하는 시기가 매우 중요 하며 일반적으로 핵의 사분자(tetrad)기 형성 후 제1화분립 분 열기까지가 약배양의 적기로 알려져 있다(Gresshoff & Doy, 1972). 식물에 따라서 약을 분리하는 시기를 판단하는 기준에 차이가 있기 때문에 현미경을 이용하거나 형태적인 특성을 기 준으로 판단할 수 있으며, 배추에서는 꽃잎이 수술의 1/2일 때 가 적기로 알려져 있다(Kameya & Hinata, 1970). 약배양은 소포자 배양법에 비해 배발생이 용이하다고 알려져 있으나 약 배양의 경우 화사 또는 약벽으로부터 식물체가 분화되거나 캘 러스가 형성될 가능성이 높아 순수한 반수체 식물의 획득이 낮은 단점을 가지고 있다(Kim et al., 1984).

소포자 배양

약배양이 성숙된 화분 또는 미성숙 화분을 배양하는 것과 달리 소포자 배양은 꽃가루가 성숙하여 분산되기 전 상태의 초기 소포자만을 배양하는 방법이다. 약 내의 소포자는 분화 발 달 과정을 거치면서 생식세포와 영양세포로 발달하는 과정을 통해 다양한 반수체가 형성될 수 있다(Joosen et al., 2007). 적 정 시기의 꽃봉오리를 채취하여 분쇄한 후 여과, 원심분리하 여 대량으로 소포자를 분리하여 배양하는 방법(Fig. 1)이 약배 양보다 용이하다고 알려지면서 최근에는 배추속 작물을 포함 한 많은 작물에서 소포자 배양을 통한 반수체 생산이 시도되 고 있다(Datta, 1987; Binarova et al., 1993). 배추속 식물에 서는 유채(Lichter, 1982)를 시작으로 소포자 배양을 통한 반 수체 식물의 생산이 보고되었다(Table 1). 이러한 식물의 소포 자 배양을 통한 배 형성에는 배양 배지의 조성이나 배양 상태, 유전형 그리고 소포자 배양의 시기 등 다양한 요인이 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Takahata et al., 1991; Lee et al., 2000).

식물의 유전형

식물의 소포자 배양을 통한 배 발생 효율은 모식물의 유전 형(genotype)에 따라 크게 달라지며, 유전형에 따른 소포자 배 발생 효율에 관해 다양한 배추속 작물에서 보고되고 있다 (Takahata et al., 1991; Wei et al., 2008; Dubas et al., 2013). 배추속 식물의 경우에서는 유채(B. napus), 배추(B. rapa) 및 양배추(B. oleracea)등에서 유전형에 따른 배 발생 효율의 차이에 관한 연구가 비교적 많이 이루어졌다(Ferrie et al., 1995; Phippen et al., 1990; Dubas et al., 2013). 양배 추에서는 에틸렌 생성이 소포자 배 발생에 영향을 미치며 품 종에 따라 에틸렌 생성에 차이가 난다고 알려져 있으나 구체 적으로 어떠한 유전적 요인이 배 발생 효율에 관여하는지는 밝혀지지 않았다(Biddington et al., 1991). 그러나 소포자 배 발생 효율이 낮은 품종의 경우에도 화뢰의 전처리 및 배양조 건 등을 달리함으로써 증가된 배 발생 효율이 관찰되었다(Seo et al., 2014). 따라서 식물의 소포자 배양은 유전적 요인과 함 께 외부적 요인의 상호작용에 의하여 영향을 받기 때문에 소 포자 배양에 적합한 품종의 선발과 함께 배양 배지 및 배양 환경과 같은 외부적 요인의 최적화가 함께 이루어져야 할 것 이다.

식물의 생육환경 및 화뢰 채취 시기

온도, 광도 및 생육상태 등을 포함하는 식물의 생육환경은 소포자 배양에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Dunwell et al., 1985; Takahata et al., 1996). 유채의 경우 25°C 정도의 생육 조건에서 자란 식물체의 경우 30°C의 고온에서 생육된 식물체보다 소포자 배 발생 효율이 높았다(Kim, 1992). 또한 추파형 유채에 비해 춘파형이 비교적 높은 소포자 배 발생률 을 나타내었다(Jang et al., 1997). 식물의 생육환경이 소포자 배 발생에 미치는 요인에 관해서는 아직까지 분명하게 밝혀지 지 않았으나 생육환경에 따른 식물의 생리적 변화로 인하여 불임 화분이 증가하거나 소포자가 세포학적인 변화를 일으켜 배 발생 효율에 영향을 미치는 것으로 추측되고 있다(Lo et al., 1992). 이와 함께, 소포자 배양을 위한 화뢰의 채취 시기 는 소포자 배발생 효율에 있어서 매우 중요한 요인으로 보고 되고 있다(Kim et al., 2012). 소포자 배양에 적합한 채취 시 기를 결정하기 위하여 대부분의 식물에서는 최적화된 화뢰의 크기를 선발하여 배양하는데 화뢰의 크기는 종에 따라 다양하 게 보고되었다(Phippen et al., 1990; Kim et al., 2013). B. carinata의 경우 화뢰의 크기가 2.5-3.5mm (Barro et al., 1999), B. campestris는 2.0 - 2.9mm (Baillie et al., 1992), 그리고 B. napus의 경우 3.0 - 3.5 mm (Kim et al., 2012)에서 가장 높 은 소포자 배 발생이 관찰되었다. 또한 유채의 소포자 배 발 생에 적합한 화분의 시기를 조사한 결과, 화분 내의 핵 발달 시기 중 1핵기 초기 및 3핵기 시기에는 배 발생이 이루어지지 않고 1핵기 후기에서 2핵기 초기 사이의 소포자를 포함하는 단계에서 배가 활발하게 발생함을 확인하였다(Fan et al., 1988; Kim et al., 2012).

이와 같이 식물에 따라 소포자 배양에 적합한 화뢰의 크기 는 다양하다고 알려져 있으나 대부분의 배추속 식물에서는 소 포자 분열이 활발하게 일어나는 2핵기의 소포자를 포함하는 단계에서 높은 배 발생이 관찰되었다(Barro et al., 1999; Wong et al., 1996). 따라서 최적화된 생육 환경에서 자란 모 식물체에 적합한 소포자 채취 시기를 조사하여 기내 배양을 실시하는 것이 효율적인 소포자 배 발생을 위하여 우선적으로 고려되어야 할 것이다.

화뢰의 전처리

식물의 소포자 배양에 있어서 가장 널리 사용되고 있는 방 법이 온도처리에 의한 소포자 배 발생의 유도이다(Keller et al., 1979; Na et al., 2011). 식물의 소포자 배양에서 온도 전 처리에 따른 반응은 식물에 따라 다르게 관찰되는데 밀과 같 은 단자엽 식물의 경우 저온처리가 효과적인 것으로 알려졌으 나 배추과 작물의 소포자 배양에서는 고온처리가 저온처리 보 다 훨씬 효과적인 것으로 알려져 있다(Marsolais et al., 1984; Keller et al., 1979). 브로콜리의 경우는 32.5°C에서 24시간 고온처리한 경우 높은 소포자 배발생이 관찰(Na et al., 2011) 되었고, B. carinata는 32°C에서 3일간 고온처리(Barro et al., 1999)가 가장 효과적임이 확인되었다. 또한 Seo et al.(2014) 에 의한 배추 아종별 소포자 배양에서 고온처리의 효과를 관 찰한 결과 고온처리는 소포자 배 발생에 매우 큰 영향을 미치 고 효과적인 고온처리의 기간은 아종에 따라 차이가 있음이 확인되었다. 또한 소포자 배 발생 효율이 낮은 아종일지라도 고온처리 기간을 조절함으로써 배 발생 효율이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 온도 전처리가 소포자 배 발생에 미 치는 영향에 대해서는 아직까지 밝혀진 바가 많지 않다. 배추 과 작물의 경우 브로콜리의 소포자 배 발생 과정에서 고온처 리에 의한 heat shock protein (HSP)의 형성이 관찰되었고, HSPs이 소포자의 분화 과정에서 배 발생을 촉진하는 역할을 하는 것으로 추정되었다(Fabijanski et al., 1991). 유채의 소포 자 배양에서는 고온처리가 ABA농도를 증가시켜 소포자 배 발 생에 영향을 미친다고 보고(Dubas et al., 2013) 하였으나 아 직까지 직접적인 상관관계는 밝혀지지 않았다. 따라서 식물의 소포자 분화에 미치는 고온처리의 영향을 밝히기 위한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이다.

배지 조성

배추속 식물의 소포자 배양에는 대부분 NLN 배지(Lichter, 1982)가 사용되고 있다(Ferrie et al., 1995; Keller et al., 1983). 에너지원으로 배지에 첨가하는 탄수화물로서 사용되는 당은 식물의 기내 배양시 삼투 조절제로 작용하는 것으로 알 려져 있으며 여러 식물체의 기내 배양에서 당의 종류 및 농도 를 변화시킴으로써 배양 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려 져 있다(Roulund et al., 1991). 배추속 식물의 경우에서는 식 물에 따라 낮게는 13%, 높게는 17% 농도의 sucrose를 첨가 하였을 때 높은 소포자 배 발생율이 관찰되었다(Prem et al., 2008; Lionneton et al., 2001).

소포자 배양시 사용되는 생장조절물질은 식물에 따라 요구 되는 종류 및 농도가 다르다. 일반적으로 세포의 신장 및 분 열을 유도하는 auxin계 호르몬과 세포의 분열을 촉진하는 cytokinin계 호르몬이 널리 사용되고 있다. 화본과 식물의 약 배양 등에서는 callus 유도로 인해 배지 내에 필수적으로 호르 몬의 첨가가 요구되나 배추속 식물의 소포자 배양에서는 호르 몬의 첨가가 필수적이지는 않다(Biddington et al., 1991; Feng et al., 1991; Kim et al., 1988). 반면에 유채(Kim et al., 2012)와 배추(Lee & Kim, 2000; Seo et al., 2014)에서 는 α-Naphthalene acetic acid (NAA)와 6-Benzyl amino purine (BAP)이 첨가된 배지를 사용하여 배 발생을 유도하였 다. 배추속 식물의 경우 내생 호르몬만으로도 충분히 배 발생 을 유도하는 경우도 있지만 배 발생 효율을 높이거나 소포자 배양이 어려운 품종의 경우 호르몬 첨가로 효과적인 배 발생 을 유도할 것으로 생각된다. 하지만 과다한 호르몬의 첨가는 소포자로부터 callus를 유도하는 경우가 있기 때문에 호르몬의 종류와 적정 농도를 고려할 필요성이 있다(Feng et al., 1991).

배추속 작물의 소포자 배양시 배지 내의 활성탄의 첨가에 따른 소포자 배 발생 효과에 대해서도 보고된 바 있다(Prem et al., 2008). 활성탄은 미세한 공극이 존재하여 내면적이 무 척 크기 때문에 가스 및 고체 화합물을 흡수시키는 역할을 하 는 물질로 알려져 있으며 기내 배양에 사용하였을 경우 세포 의 생장과 발달에 저해를 일으키는 물질 뿐만 아니라 과잉의 식물생장조절제를 흡착하는 효과가 있는 것으로 알려지면서 배추과 작물의 소포자 배양에서도 널리 사용되고 있다(Na et al., 2011; Jo et al., 2012). 이 밖에도 세포의 분열을 저지하 고 노화를 촉진하는 것으로 알려진 에틸렌 생성 억제제인 silver nitrate의 첨가도 배 발생에 효과가 있다고 보고된 바 있다(Biddington et al., 1991; Na et al., 2011).

적 요

배추속은 전세계적으로 재배되는 중요한 경제작물을 포함하 고 있으며, 종의 진화 및 배수성 연구를 위해 학문적으로 중 요한 가치를 가지고 있다. 그러나 대부분의 작물이 교잡육종 을 통해 종자를 생산하기 때문에 고정 계통을 육성하는 데 많 은 시간과 노력이 필요하다. 이러한 문제점을 해결하기 위하 여 인위적인 방법으로 반수체 식물체를 유도하여 형질이 고정 된 계통을 단시간에 육성함으로써 연구 및 육종 소재로 활용 할 수 있는 다양한 기내배양법이 시도되었다. 본 논문에서는 지금까지 배추속 작물에서 시도된 기내배양법의 연구현황을 살펴보고 반수체 생산에 영향을 미치는 요인들을 조사하여 효 율적인 반수체 생산 기술에 대한 정보를 제공하고자 하였다.