호박(Cucurbita spp.)은 1년생의 덩굴성 초본식물로 자웅동 주이고 단성화를 가지고 있으며, 박과채소 중에서도 가장 강건 하며 흡비력이 강하고 척박한 토양에서도 잘 자라는 것으로 알 려져 있다. Cucurbita spp.는 세계적으로 약 27종이 분포하고 있으며, C. moschata, C. maxima, C. pepo, C. mixta 및 C. ficifolia 5종이 재배종으로 알려져 있고, C. martinezii 등 10 여종이 야생종으로 분류되고 있다 (Huh et al., 2010). 이중 온대 지방에서는 C. moschata, C. maxima와 C. pepo가 많이 재배되고 있으며, 우리나라에서는 청·숙과 겸용인 동양종 호박 이 주로 노지에서 재배되어 왔는데, 최근에는 호박에 대한 수 요 증가에 따라 노지 및 시설의 재배면적과 생산량이 꾸준히 증가하고 있다(Cho et al., 2004). 고온다습지역에 적응하여 온 동양종호박(C. moschata)은 멕시코와 페루 유적지에서 종자가 발견되었으며, 멕시코와 남아메리카 및 미국남서부에서는 대륙 발견이전부터 재배되어왔으나, C. moschata의 야생조상은 아직 알려지지 않고 있다. 서양종호박(C. maxima)은 페루, 볼리비아, 칠레북부를 원산지로 고랭 건조지대에 적응하여 왔고, 페포계 호박(C. pepo)은 멕시코 북부와 북아메리카 서부가 원산지이다 (Huh et al., 2010). 세계적으로 소비되고 있는 호박은 과육, 잎, 씨 등으로 직접 이용되거나, 가공되어 쨈이나 식빵 등의 부 재료로 이용되고 있다(Kim et al., 2012; Lee and Kim, 2004; Shin et al., 2013). 또한 회복기의 환자, 산후 부종제거, 위장이 약한 사람에 좋은 식품으로 알려져 건강식으로 이용되 고 있으며, 비타민 A 의 전구물질로 알려진 β-carotene은 항암 효과와 면역기능, 항비만, 항산화활성 등의 약리기능을 갖는다 고 알려져 있어 기능성 식품으로 이용가치가 증가하고 있다 (Choi et al., 1998; Colditz et al., 1985; Do et al., 2012; Kim et al., 2005; Lee and Kim, 2004).

카로티노이드(carotenoids)는 식물의 잎, 뿌리, 꽃, 열매의 색 소체에 존재하는 노란색, 주황색, 붉은색 등을 나타내는 천연 색소로, 탄소와 수소로만 구성되는 carotene과 산소를 가지고 있는 xanthophyll로 구분된다(Oliver and Palou, 2000). 카로 티노이드는 이중결합을 가지고 있어 불포화 성질을 나타내며, trans-형과 cis-형의 기하이성질체가 600종 이상이 알려져 있다 (Khoo et al., 2011). 대부분의 카로티노이드는 식물체내에서 trans형 이성질체로 발견이 되는데, 음식의 조리 과정중 trans 형 이성질체 카로티노이드의 이성화 때문에 cis형 이성질체가 증가한다고 한다(Schieber and Carle, 2005). Lycopene은 전 립선암에 효과가 있고 lutein과 zeaxanthin은 심혈관계 질환 뿐 아니라 눈 건강에도 도움을 주는 것으로 알려져 있어 꾸준히 섭 취하면 암, 심혈관 질환과 백내장 등의 발병위험을 낮출 수 있 다(Brown et al., 1999; Hwang and Bowen, 2004; Sommerburg et al., 1998; Yang et al., 2006). 이러한 카로티노이드는 체내에서 합성되지 않기 때문에 식품으로 섭취를 해야한다 (Hwang et al., 2015).

본 연구는 한국, 멕시코, 인도 원산의 재래종 호박과 한국의 육성종 호박을 공시하여 카로티노이드 함량을 분석하고, 카로 티노이드 고함유 유전자원의 선발 및 고함유 호박의 품종 개 발을 위한 육성 재료로 활용하며, 유전연구를 위한 기초자료 로 활용하기 위하여 실시하였다.

재료 및 방법

시험재료

본 연구에 사용된 호박은 농촌진흥청 국립농업과학원 농업 유전자원센터에 보존중인 동양종 호박(Cucurbita moschata)을 대상으로 한국 원산자원 22점 (재래종 14점, 육성종 8점), 멕 시코 원산자원 48점, 인도원산 자원 10점 등 총 80 점을 분 양 받아 실험재료로 이용하였다(Table 1). 각각의 종자는 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)에서 1분간 표면살균하고 멸균수로 2회 세척 후 습실 처리된 filter paper를 깐 Petri-dish에 치상 하고 20°C 항온기에서 3일간 암배양하여 발아시켰다. 발아한 종자는 플러그 묘판(4X8)에 피트모스 배양토를 채운후에 파종 하여 비닐하우스에서 4주간 육묘하였다. 육묘된 묘는 2014년 4월 22일에 경기도 화성시에 위치한 비닐하우스에 정식하였고, 농촌진흥청 표준재배법에 따라 재배하였다. 생육중 잡초발생 을 억제하기 위하여 검은색 부직포를 멀칭하였다. 농업적 생 육특성은 농촌진흥청 유전자원 특성조사 및 관리요령에 따라 엽장, 엽폭, 과실 무게, 과실 길이, 과실 폭, 과실 당도 등을 조사하였다(Huh et al., 2010). 5월 중순부터 8월 중순까지 암 꽃이 착생하여 인공수분을 하였으며, 8월부터 10월 중순까지 과실을 수확하였다. 수확한 과실은 분석을 위해 과육을 잘라 동결건조 후 곱게 분쇄하였다. 건조된 분말은 color chart를 이용하여 노랑, 진노랑, 주황색, 진녹색, 황토색 등 5가지로 구 분하였다.

기기 및 시약

시료 분석을 위해 사용한 용매는 에탄올, 헥산, 메탄올 및 초순수는 Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, USA)을 사용하 였고, methyl tert-butyl ether (MTBE)는 JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. 수산화칼륨은 Junsei Chemical Co., Ltd. (Kyoto, Japan)을 사용하였다. Triethylamine, ascorbic acid 및 내부표준품으로 trans-8’-apo-β-carotenal (Sigma Aldrich; St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 호박 내 카로 티노이드 분석은 2998 photodiode array detector (PDA)가 장착된 Alliance e2695 HPLC system (Water Co., Milford, MA, USA)을 사용하였다.

시료 전처리

균질화된 시료 0.5 g을 50 ml Falcon-tube에 담고 에탄올에 0.2% ascorbic acid 가 첨가된 용액을 20 ml을 넣고 80°C 항 온수조에서 15분간 추출한 후 10분간 냉각하였다. 추출액에 80% 수산화칼륨 용액 5 ml을 넣고 항온수조에서 10분간 비누 화 반응 후 10분간 냉각하였다. 냉각 후 반응이 정지된 tube 에 초순수 5 ml, 핵산 5 ml과 내부표준물질(trans-8’-apo-β- carotenal, 25 ppm)을 1 ml 넣은 후 진동혼합 후 4°C에서 1,800 rpm, 10분간 원심분리하였다. 상층액 (핵산층)을 micropipette으로 취해 50 ml Falcon-tube에 옮겼다. 동일한 조건으 로 초순수 5 ml, 핵산 5 ml을 넣고 상층액을 취하는 과정을 2회 더 실시하였다(총 3회). 추출총액 핵산 15 ml을 질소가스 로 농축하였다. 메탄올 : methyl tert-butyl ether (MTBE) (1 : 1, v/v) 1 ml을 넣어 완전히 녹인 후 Syringe filter (PTFE, 0.45 μm)로 여과 후 분석하였다.

HPLC를 이용한 카로티노이드의 조성 및 함량 분석

분석 컬럼은 YMC carotenoid (250 × 4.6 mm, i.d., 5 μm) (YMC Inc., Wilmington, USA)를 사용하였다. 컬럼 오븐 온 도는 40°C로 설정하였으며, 시료 주입량은 10 μl, 검출파장은 210 - 600 nm (대표파장 450 nm)로 하였다. 이동상은 Kim et al. (2014)의 방법을 응용하여 전개하였다. 용매A (MeOH : MTBE : water : triethylamine = 81 : 15 : 4 : 0.1, v/v/v/v)와 용매B (MeOH : MTBE : water : triethylamine = 6 : 90 : 4 : 0.1, v/v/v/v)를 사용하였고, 유량은 1.0 ml/min로 하였다. 용매 구배조건은 용매 B를 0%로 시작하여 5분까지 유지시켰 고 35분까지 일정하게 50%로 증가시켰다. 45분까지 100%로 증가시켰고 5분 동안 유지하였다. 55분까지 다시 0%로 감소 시키고 60분까지 유지하였다. 개별 카로티노이드 성분의 면적 은 내부표준물질의 면적을 이용하여 상대적으로 정량(mg/g dry weight, DW)하였으며 각 개별 성분은 Kim et al. (2014)의 문 헌을 참고하여 동정하였다.

결과 및 고찰

호박의 기초 특성

호박 유전자원의 원산지별 농업적 특성은 Table 2와 같다. 엽장, 엽폭은 멕시코 재래종이 28.9, 35.4 cm로 가장 컸으며, 한 국 육성종이 17.8, 26.1 cm 로 가장 작았다. 과실의 무게는 인도 재래종 5.5 kg, 한국 재래종 4.5 kg으로 가장 무거웠고, 한국 육 성종이 0.5 kg으로 가장 가벼웠다. 과실의 길이와 폭은 한국 육 성종이 31.6, 32.0 cm으로 가장 컸으며, 한국 육성종이 7.8, 11.4 cm 로 가장 작았다. 과육의 당도는 한국 육성종이 11.5 °Bx 로 가장 높았고, 한국, 인도, 멕시코 재래종 순으로 나타났다.

과육색깔별 카로티노이드 함량변이

호박 유전자원의 과육으로부터 카로티노이드를 분석한 결과 총 9종(lutein, zeaxanthin, cryptoxanthin, 13-cis-α-carotene, 15-cis-β-carotene, 13-cis-β-carotene, all-trans-α-carotene, alltrans- β-carotene, 9-cis-β-carotene)이 분리되었다. 호박 유전자 원의 과육색에 따른 카로티노이드 함량분석 결과, 총 카로티 노이드 함량 범위는 진노랑(16.33-273.67), 노랑(26.28- 193.50 mg/100 g dw), 주황색(20.76-689.68), 진녹색(171.68- 359.51), 황토색(119.72-947.12)으로 유사한 과육색 내에서도 자원간의 변이가 크게 나타났다. 그러나 총 카로티노이드 함 량의 평균은 진노랑색 84.0, 노랑색 109.4, 주황색 175.1, 진 녹색 244.7, 황토색 286.1 mg/100 g dw으로 색깔별로 유의 성 있게 차이가 있었다(Table 3). 황토색에서의 총 카로티노이 드 함량은 진노랑에서의 카로티노이드 함량보다 3.4배나 높은 것으로 나타났다. 대부분의 카로티노이드 성분은 황토색에서 가장 높게 나왔고, Cryptoxanthin, all-trans-β-carotene, 9-cis- β-carotene은 진녹색에서 가장 많이 검출이 되었지만 황토색과 의 유의한 차이는 없었다(Table 3). 과육색에 따라 특이적으로 검출되는 성분은 없었으며, 과육색이 노랑, 진녹색을 가진 호 박에서는 13-cis-α-carotene 과 15-cis-β-carotene 은 검출되지 않았다(Table 3). 검출된 성분 중 xanthophyll류(lutein, zeaxanthin, crytoxanthin)와 carotene류 (13-cis-α-carotene, 15-cis-β- carotene, 13-cis-β-carotene, all-trans-α-carotene, all-trans-β- carotene, 9-cis-β-carotene)의 총 카로티노이드 함량 비율은 진 노랑 73.2 : 26.8, 노랑 75.5 : 24.5, 주황색 76.7 : 23.3, 진 녹색 67.2 : 32.8, 황토색 72.5 : 27.5 로 Xanthophyll류의 비율이 2배(진녹색)에서 3.3배(주황색) 높게 검출되었다(Fig. 1). 호박 과육 내에서 주요 카로티노이드는 xanthophyll류에 속하 는 lutein이 65.3% (진녹색) 에서 73.7% (노랑)로 가장 높은 비율을 차지 하였으며, all-trans-β-carotene 이 15.5% (주황색) 에서 27.2% (진녹색), all-trans-α-carotene 이 3.3% (진녹색) 에서 8.9% (진노랑) 의 순으로 높았다. Lutein 함량은 황토색 200.96 mg/100 g dry weight 으로 진노랑 59.44 mg/100 g dry weight 보다 3.4배 높게 나타났다(Table 3). 이와 같이 색 깔에 따른 카로티노이드 함량의 변이는 cis형 카로티노이드가 이중결합의 위치에 따라 최대흡수파장 330-350 nm를 갖기 때 문에 색소형성과 카로티노이드 생성 및 합성에 따라 cis-trans 이성질체 조성의 색깔이 달라지기 때문이다 (Schieber and Carle, 2005).

원산지별 카로티노이드 함량변이

호박 유전자원의 원산지별 카로티노이드를 분석한 결과 한국 육성종의 총 카로티노이드 함량이 254.12mg/100 g dry weight 로 가장 높게 나왔으며, 멕시코 원산지 자원이 195.95 mg, 인 도 원산지 자원이 108.27 mg 검출되었으며, 한국 재래종 자 원이 51.88 mg 으로 가장 함량이 낮았다(Table 4). Lutein 성분은 한국육성종에서 213.69 mg/100 g dry weight로 84.1% 를 차지 하여 가장 높게 검출되었으며, 한국 원산지 재래종이 27.51 mg 으로 53.0% 를 차지하여 가장 낮게 검출되었다. All-trans-β-carotene은 멕시코 원산 재래종이 37.63 mg/100 g dry weight (19.2%)으로 가장 높게 검출되었으며, 한국 육성종 이 10.67 mg, 4.2%로 가장 낮게 검출이 되었다. 한국, 멕시코, 인도 재래종 및 한국 육성종 모두 lutein이 가장 높은 비율로 검출되었으며, 다음은 멕시코, 인도 재래종은 all-trans-β- carotene이 한국 재래종은 all-trans-α-carotene 이 두번째로 많 이 검출되었다. 그러나, 한국 육성종은 zeaxanthin이 24.49 mg/ 100 g dry weight로 두번째로 많이 검출되었다. 동양종 호박에 서 주요 카로티노이드 성분은 β-carotene 이고 lutein 은 소량 존재하였는데, 이번 결과는 lutein이 가장 높은 비율로 존재하 여 상이한 반응을 보였다(Chung and Youn, 1998; Seo et al., 2005). 그러나, 총 카로티노이드 함량은 애호박의 내부섬 유상 부위에서 43.71 ± 1.46 mg/100 g 이 함유되어 본 연구결 과와 비슷한 결과를 나타내었다(Jang et al., 2001).

Xanthophyll류와 carotene류의 총 카로티노이드 함량 비율은 한국 재래종 28.17 : 23.71, 멕시코 재래종 142.66 : 53.29, 인도 재래종 70.65 : 37.62, 한국 육성종 241.53 : 12.59 (mg/100 g dry weight)로 xanthophyll류의 비율이 1.2배(한국 재래종)에서 19.2배(한국 육성종) 높게 검출되었다. 한국 재래 종의 경우 xanthophyll류가 54.3%를 차지 하였으나, 한국 육 성종은 95.0%나 차지 하였다. 이와 같이 다른 자원에 비해 한국 육성종에서 카로티노이드 성분이 높은 것은 공시된 재 료가 카로티노이드 성분의 함량을 높이기 위해 육종된 단호 박이 많이 포함되어 있어서 나타나는 결과일 것이라고 사료 된다.

유용 자원의 선발

카로티노이드 성분이 가장 높은 자원은 멕시코 원산자원인 K188417로 서양배 모양의 과실모양을 가지며, 과실줄기끝모 양이 평평하며, 꽃자리 부분모양은 둥글다. 과실의 색은 황 색이며, 과실의 2차색은 녹색으로 과면에 골이 있고, 과실에 혹은 없다. 과실의 무게는 2.2 Kg이며, 과실의 길이는 23 cm, 폭은 14 cm 이다. 과실의 당도는 10.8 °Bx 이다. K188417 자원의 lutein 성분은 743.25 mg/100 g dry weight, all-trans-β-carotene은 100.43 mg/100 g dry weight이었다 (Table 5).

적 요

카로티노이드는 항산화 및 항암효과를 가지는 비타민 A의 전구물질이다. 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보존하고 있 는 호박자원 80자원의 과육에서 카로티노이드를 분석을 하였 다. 유전자원은 한국, 멕시코, 인도의 원산지에 따라 호박 과 육에서 카로티노이드를 분석하였다. 고성능 액체 크로마토그 래피를 이용하여 총 9종의 카로티노이드 (크산토필류 3종과 카로틴류 6종)를 분리하였다. 특히 카로티노이드 중 lutein과 β-carotene 이 주로 분석이 되었다. 총 카로티노이드 함량 평 균은 한국 육성종이 213.69 mg, 멕시코 재래종이 139.07 mg, 인도 재래종이 69.13 mg, 그리고 한국 재래종 27.51 mg 순으로 나타났다. 총 80 자원중 K188417(멕시코원산) 자원이 카로티노이드 성분이 가장 많았다. 본 연구의 결과는 카로티 노이드 고함유 호박 품종 개발 뿐 아니라 기능성 식품 개발의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.