Fusarium fujikuroi에 의해 발생하는 벼 키다리병은 Ito와 Kimura (1828)에 의해서 처음 알려졌으며 Hori (1898)가 공식으로 보고하였다(Kim, 1981). 키다리병의 병징은 일반적으 로 웃자람의 형태로 나타나는데 Yamanaka et al. (1979)에 의 하면 웃자람뿐만 아니라 다섯 가지 병징으로 다양하게 나타난 다고 하였는데 이러한 증상은 균주에 따라 다르게 나타나기도 하며 같은 균주라도 병원균의 밀도가 높고 낮음에 기인하는 것 이라고 보고하였다(Sun et al., 1978). 병징은 보통 육묘기의 본엽 2 ~ 3엽기부터 나타나며, 이병 종자를 심으면 벼가 도장하 고, 심하면 고사하기도 한다(Tomaru, 1992). 또 줄기나 잎집에 하얗게 포자가 형성되고 이 포자가 벼꽃이 피는 시기에 바람 에 의해 주변의 건전한 포기의 벼꽃 속으로 들어가게 된다. 그 리고 벼 알이 여물면서 배, 배유까지 포자가 침입하여 균사나 포자 형태로 잠복하게 되면서 종자전염을 일으키는 1차 전염 원이 된다(Sung et al., 1978). Kim et al. (2008)은 키다리병 발병 비율별 수량 감소 정도 및 미질 변화를 구명하여 키다리 병 발생 비율이 증가함에 따라 등숙률과 정현 비율이 크게 감 소하였고 수량 감소는 50% 발생시 39.6% 감수한다고 하였다.

우리나라의 경우 1960년대에 일부 발생하여 문제시 되었으 나, prochloraz 등 효과가 우수한 침투이행성 종자 소독제가 개 발되면서 벼 키다리병은 크게 문제가 되지 않았다(박 등, 2003). 그러나 최근 기후변화에 따른 기온 상승 등에 의해 키 다리병 발생에 유리한 환경조건이 유지됨에 따라 그 피해정도 가 해마다 증가하고 있으며 2006년에는 전국적으로 28.8%의 필지에서 발생한 것으로 보고되었다(Han, 2007).

키다리병의 효과적인 방제를 위해서는 기작이 다른 약제를 혼용하는 방법이 보고되어 있는데 종합적인 효과검증 결과 prochloraz와 함께 포자 발아 억제력이 좋은 fludioxonil을 혼 용하여 사용할 경우 방제가는 물론 입모율도 높아 벼키다리병 방제에 효과적이면서 식물체에 안정적인 방제효과를 보고하였 다(Park et al., 2009).

최근에는 이들 소독 방법도 약제저항성균의 출현이 우려되 고 있고 특히 prochloraz에 대해 저항성을 획득한 벼 키다리 병균이 국내 벼 포장에서 전반적으로 발견되고 있어 문제시 되고 있다. 국내에서 분리한 키다리병원균 118균주의 살균제 저항성에 대해 조사한 결과 prochloraz에 17개, tebuconazole 에 19개, benomyl에 43개가 저항성을 보였으며 2중저항성을 보인 균주도 있다고 하였다(Lee, 2010).

한편 Kim (1981)이 벼 키다리병 발생 생태에 대해 보고하 였으며 Park et al. (2002)이 국내 주요 품종별 벼 키다리병 발병 차이를 분류하여 화영벼, 동진벼, 호안벼, 농호벼, 남평벼 등은 비교적 강한 품종으로, 그루벼, 소비벼, 오대벼, 주남벼, 상주벼 등은 약한 품종으로 분류하였지만 현재까지 벼키다리 병균에 완전 저항성인 벼 품종이 제대로 육종되어 있지 못하 고, 포장에서 병원성 변이가 심하기 때문에 저항성 체계가 매 우 취약한 실정이다(Sunder and Satyavir, 1998).

따라서 본 연구에서는 벼키다리병 발생정도가 다른 호품벼 와 남평벼의 발병 특성, 생리적 반응 차이를 조사하였으며 특 이적 대사 생리기작을 밝히기 위하여 항산화효소 및 지베렐린 반응 대사를 중심으로 생리·생화학적 연구 및 Real-time PCR 을 통한 유전자발현양상을 분석 하였다.

재료 및 방법

접종조건 및 종자소독 방법에 따른 품종간 발병 특성

키다리병 감염 및 발병에 대한 품종별 생리적 차이를 구명 하기 위하여 소독 및 접종조건, 종자건전도 등에 대한 키다리 병 발병 양상 변화를 시험하였다. 시험품종은 벼키다리병 내 성 품종인 남평벼와 감수성 품종인 호품벼을 사용하였으며 각 각의 벼 종자를 60°C에 10분간 온탕소독 및 prochloraz 유제 (2000배액) 용액에 30°C에서 48시간 침지한 후 살균수로 몇 차례 씻어내어 유효성분을 제거한 후 사용하였다. 소독 종자 는 최아직전 각 처리 조건별(병원균 포자 농도, 노출시간, 종 자소독 방법 및 시간, 종자건전도 등)로 익산 지역에서 수집한 키다리병원균 현탁액에 Hemocytometer를 이용하여 1.0 × 10³, 1.0 × 10⁶ (spores/ml) 농도로 조절한 후 침지, 접종하였다. 발 병률은 감염후 25일째에 식물체 도장 정도를 기준으로 각각 조사하였다.

감염후 경과시간에 따른 품종간 고사율 검정

키다리병 감염후 경과시간에 따른 품종간 고사 정도를 검정하 기 위해 2주간 기내 배양한 키다리병균을 1.0 × 10⁶ (spores/ml) 농도로 30°C조건에서 48시간 접종한 후 20, 25, 30, 35, 40 일에 각각에 대한 고사 정도를 조사하였다. 조사 방법은 잎의 1/2이상이 dry, wilt, blight 된 것을 대상으로 고사율을 %로 조사하였다.

단백질 및 전분 함량 측정

단백질(Total protein)은 남평벼와 호품벼에 키다리병균을 1.0 × 10⁶ (spores/ml)농도, 30°C조건에서 24시간 접종한 후 0, 3, 6일째 액체질소에 급냉시킨 후 40 mesh로 각각의 시료를 분쇄한 후 bradford법에 의거한 Total protein assay kit, Micro (Sigma aldrich)를 이용해 측정하였다(Bradford et al., 1976).

Starch는 시료 0.5 g을 건조하여 증류수 2 ml를 첨가하여 끓 여준 뒤 9.3N HClO₄ 2ml에서 15분간 교반한 후 증류수 6ml 를 첨가하여 원심분리 하였다. 원심분리 후 남은 잔여물에 4.6N HClO₄ 2 ml과 증류수 8 ml을 첨가하여 다시 한번 원심분리 한 후 이렇게 추출된 용액을 0.2% anthrone을 이용하여 발색 시킨 후 630 nm의 파장에서 비색 정량하였다. 탄수화물의 standard는 0, 50, 100, 250, 500 ppm의 glucose를 사용하였 으며 starch 함량 계산에 이용하였다.

α-amylase, 항산화 효소 활성 분석

α-amylase 활성 측정은 Gulielminetti et al. (1995)과 Bernfeld et al. (1955)의 방법을 참고하여 분광광도계로 540 nm에서 흡 광도를 측정하여 다음과 같이 분석하였다.

Units / mgprotein = mg of maltose / ml of enzyme used mgprotein / mlenzyme

단백질 정량은 Bradford의 method (1979)에 따라 BSA (bovine serum albumin)를 이용해 측정하였다.

SOD 활성측정은 최종 부피 3 ml에 최종 농도 13 mM methionine, 75 uM nitroblue tetrazolium (NBT), 0.1 mM EDTA가 되도록 섞은 후 25°C로 온도평형 시키고 0, 20, 40, 60 ul의 상등액과 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8)를 넣어 안정화시킨 후 riboflvin 2uM을 넣고 섞은 다음 형광박스 안에서 15분간 광 반응 시킨 후 NBT 산화 반응물 의 양을 560 nm에서 측정하였다.

Catalase activity (CAT)은 Aebi (1974)의 method에 따라 240 nm에서 H2O2 (extinction coefficient 39.4 mMcm-1)의 분해 변화를 측정하였다. Catalase 활성 반응 용액은 시료 단 백질 추출용액에 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.0)를 혼합해 주었다. 이 반응은 10mM H₂O₂를 첨가함으로서 반응을 시작하도록 하였다. Catalase의 활성은 25°C에서 100 초 동안 10 mM H₂O₂로부터 peroxide oxygen이 절반으로 유 리되는 효소의 양으로 나타내었다.

Units / mgprotein = Δ A 240 / min × 1000 × total volume 43 . 6 × enzymevolume

유전자발현 조사

남평벼와 호품벼 종자를 prochloraz 유제에 30°C, 48시간 소독한 다음 멸균수로 5회 정도 씻어내고 각각 육묘상자에 파 종하여 식물생육배양기에서 30일간 생육시켰다. 이렇게 생육 시킨 벼의 잎에서 RNA 추출하여 Real-time PCR (ABi, 7300)에서 항산화 효소 및 지베렐린 반응 유전자들의 specific primer를 이용하여 감염전·후의 발현정도를 조사하였다.

Antioxidant enzyme에 특이적인 primer (Table 1)와 Gibberellin related genes에 특이적인 primer는 Table 2와 같다.

통계분석

모든 성적의 분석은 SPSS 통계 소프트웨어(v12.0)를 이용하 였고 유의성 검정은 5% 유의수준에서 T-검정 및 Duncan-검정 을 이용하였다.

결과 및 고찰

접종조건 및 종자소독 방법에 따른 품종간 발병 특성

접종조건 및 소독조건에 따른 품종간 키다리병 발병률은 표 3에서와 같이 품종에 관계없이 병원균 포자의 농도, 노출시간 에 비례하여 증가하며 특히 감수성 품종인 호품벼는 그 증가 속도가 더욱 커짐을 알 수 있었다. 온탕침법에 의한 소독법은 약제 소독법에 비해 그 효과는 다소 떨어지지만 친환경 농법 등에 적용할 수 있을 것으로 생각되며 특히 남평, 새누리벼와 같은 내성 품종을 선택하는 것이 키다리병 예방에 큰 도움이 될 것으로 생각된다. 약제 소독 효과 역시 두 품종간 차이가 뚜렷하였는데 특히 감수성 품종인 호품벼는 48시간의 약제 소 독조건에서도 완전방제가 이루어지지 않아 감수성 품종 소독 시에는 어느 한가지 소독법보다는 온탕침범과 2가지 이상의 혼용 약제소독 등을 복합적으로 사용하는 것이 필수적인 것으 로 생각된다.

접종후 경과시간에 따른 키다리병 발생률은 호품벼가 접종 후 5일째부터 발병률이 급속히 증가하는 반면 남평벼는 접종 후 15일째부터 발생하며 그 증가 속도 또한 현저히 떨어짐을 알 수 있었다.

종자 건전도에 따른 발병 양상은 표4에서와 같이 모든 처리 에서 염수선한 종자의 키다리병 발병률이 모두 낮았으며 소독 효과 또한 높음을 알 수 있었다. 이처럼 종자 건전도에 따라 키다리병 감염률 및 방제가에 차이가 나는 현상은 개화 및 출 수시기에 감염된 종자가 등숙과정중 병해충 피해, 등숙불량 등 여러 피해에 의해 불건전 종자로 발달했을 가능성과 불건전 종자의 체내 생리적 불균형으로 인해 병원균 침투 및 감염률 이 높아지기 때문인 것으로 가정할 수 있다. 향후 종자 건전 도와 병 감염률에 대한 관계는 추후 연구가 필요할 것으로 보 인다. 또한 불건전 종자의 키다리병 감염률이 높은 점, 각 품 종별로 영을 제거한 후 각각 접종한 결과 두 품종 모두 키다 리병 감염정도가 다소 높아진 점을 미루어볼 때 키다리병 내 성 기작에 품종간 유전적 특성 외에도 병원균의 1차적 물리적 장벽인 영의 기능이 중요한 역할을 함을 시사하며 키다리병 방제를 위한 종자소독 효과를 높이기 위해서는 염수선에 의한 불건전 종자 선별이 필수적임을 나타낸다. Fig .1

접종후 경과시간에 따른 품종간 고사율 검정

키다리병 접종후 경과시간에 따른 품종간 고사율 정도는 Table 2에서와 같이 키다리병 병징은 보통 파종후 15일부터 발현하기 시작하여 45일까지 거의 전 못자리 기간 동안 병증 이 나타났으며 일단 병증이 나타나면 30 ~ 40일 후에는 거의 고사하는 것으로 나타난다. 다만 내성 품종인 남평벼는 감수 성 품종인 호품벼보다 병증 발현 시기가 대략 10일 가량 늦었 으며, 발현 후에도 고사전 생존기간이 2배 가랑 연장되는 것 을 알 수 있었다. 반면 감수성품종인 호품벼는 시간이 경과함 에 따라 고사율이 급격하게 증가하였고 엽색(SPAD)값은 반대 로 현저하게 빨리 감소하였다. Fig .2, 3, Table 3, 4

단백질 및 전분 함량 측정

키다리병 접종후 시일이 경과할수록 두 품종 모두 체내 단 백질 함량이 건전주인 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였는 데 초기 단백질 함량은 남평벼 7.3%, 호품벼 7.5% 이었으나, 키다리병 접종후 6일째에는 각각 5.3%와 4.7%로 감소하는 것 을 알 수 있었다. 또한 체내 전분 함량은 남평벼는 접종 후에 도 대조구와 감소 경향이 유사하게 진행되는 반면 호품벼는 접종후 3일째부터 급속히 전분함량이 감소하였다. 전분 분해 효소인 α-amylase의 활성은 감염 유무와 관계없이 전체적으로 호품벼가 남평보다 높은 경향을 보였으며 키다리병 접종후 시 간이 경과하면서 대조구와의 활성 차이가 호품이 남평보다 더 커지는 양상을 보였다. 호품벼의 전분소모 정도가 큰 것은 이 러한 α-amylase 활성이 더 높기 때문인 것으로 예상된다. 이 러한 결과는 감염에 의한 내성벼의 체내 양분소모 정도가 감 수성 품종에 비해 현저히 낮다는 것을 의미하며 이는 곧 완전 고사시기가 감수성 품종에 비해 두 배 가량 연장되는 효과로 이어지게 된다.

α-amylase, 항산화 효소 활성 분석

발아기 유묘는 종자의 전분을 소모해 에너지원으로 사용하 는데 이는 α-amylase 활성이 증가해 전분을 분해하기 때문이 라고 한다(Perata et al., 1992).

전분 분해효소인 α-amylase의 활성은 감염 유무와 관계없이 전체적으로 호품벼가 남평보다 높은 경향을 보였으며 키다리 병 접종후 시간이 경과하면서 대조구와의 활성 차이가 호품이 남평보다 더 커지는 양상을 보였다. 특히 접종후 3일째부터 활 성이 높아지는 것은 위의 전분 감소 경향과 일치하는 양상이 었고 이는 키다리병균에서 분비하는 지베렐린에 의한 반응이 호품에서 더 민감하게 작용한다는 것을 반증한다.

초기 SOD 활성은 남평벼 12.4 units/mg protein, 호품벼 14.6 units/mg protein 이었으나 접종후 3일째에는 각각 17.9, 15.5 units/mg protein로 남평벼의 증가폭이 다소 큰 양상을 보였다. CAT 활성 또한 접종후 3일째에 호품벼가 12.6에서 16.1units/mg protein로 증가하는 반면 남평벼는 11.3에서 18.5 units/mg protein로 그 증가폭이 상대적으로 커져 키다리병에 대한 품종간 항산화효소 활성에 차이가 있음을 알 수 있다.

접종후 6일째에는 남평벼의 경우 효소 활성이 비슷해지거나 3일째에 비해 오히려 더 줄어드는 양상도 보이는데 이는 일반 적으로 다양한 스트레스 하에서 항산화 효소 활성은 증가하지 만(Gupta, Alscher et al., 1991; Sheng, Karnosky et al., 1997; Pa가, Sul et al., 1998), 스트레스가 장기간 지속되거나 과다한 스트레스가 가해지면 활성은 감소하게 된다는 기존 보 고와 일치한다(Kim and Lee, 1992). 그러나 호품벼는 6일째에도 활성이 남평벼에 비해 비교적 높게 유지되는 양상을 보였다. Fig .4

유전자발현 조사

키다리병균은 식물체에 감염 후 자체 지베렐린을 분비함으 로써 식물체의 초장 신장 반응 등 여러 생리적 장해 반응을 유도하기 때문에 식물의 지베렐린 신호 관련 유전자들에 대해 발현 양을 분석한 결과 Fig. 6에서와 같이 GA response genes의 경우 호품벼에서 초장신장에 관여하는 GA positive gene인 Gα (D1), GID2의 발현이 높은 반면 GA deactivating gene인 EUI의 발현이 남평보다 낮은 것으로 나타나 키다리병 주요 분비물질인 지베렐린에 대한 품종간 반응정도 차이가 존 재함을 추론케 한다. 다만 이러한 결과를 통해 지베렐린에 의 한 품종간 반응 정도가 내성 기작과 어떠한 관계가 있는지에 대해서는 추후 지속적인 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 키다리병 감염 조건에서 SOD group 항산화효소 유전자 발현 은 대체적으로 두 품종 모두 감소하는 경향을 보이는데 MnSOD인 경우에는 남평벼에서 감염후 control에 비해 약간 의 증가를 보였다. 또한 키다리병 감염조건에서 SOD를 제외 한 CAT, POD, APX 유전자들은 남평벼가 호품벼에 비해 모 두 2 ~ 3배 이상의 강한 발현증가를 보였다. 이는 키다리병 내 성벼인 남평벼의 높은 항산화 효소 활성 및 발현 정도가 키다 리병에 대한 중요한 내성 기작으로 작용하고 있음을 추측할 수 있다. Fig .5

적 요

키다리병 내성벼의 생리·생화학적 특성 연구를 알아보기 위 해 남평벼와 호품벼를 비교하여 실시한 실험결과는 다음과 같다.