조직형 플라스미노겐 활성화인자[tissue-type plasminogen activator (t-PA)]는 스트레스와 유전적인 원인에 의해 혈관 벽에 생성되는 섬유소(fibrin) 단백질을 분해하는 효소로, 혈관 내에서 플라스미노겐(plasminogen)을 활성 형태의 플라스민 (plasmin)으로 전환시키는 기능을 가지고 있다. t-PA 단백질의 플라스미노겐을 활성화 시키는 기능은 세린 프로테아제 도메 인에 있으며, 플라스미노겐의 Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²결합을 절단하여 활 성화 형태인 플라스민로 전환한다(Bachmann, 1994). 혈액에 존재하는 t-PA는 억제제인 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)과 결합된 형태로 존재하고 있다(Mimuro., 1991). 이런 PAI-1과 복합체를 형성한 t-PA는 혈액내에서 반감기가 더 짧아지는 것으로 알려져 있다(Wing et al., 1991).

재조합 t-PA 단백질은 Bowes melanoma 세포주(Rijken et al., 1981), Chinese hamster ovary (CHO) 세포주, 대장균 (Manosroi et al., 2001; Kim et al., 2005), 염소젖(Ebert et al., 1991) 및 생쥐젖(Pittius et al., 1998) 등에서 생산하는 기 술이 개발되었다. CHO 세포에서 생산된 t-PA가 바이오의약품 으로 사용되고 있다(Tate et al., 1987). 최근에 담배와 알팔파 잎에서 t-PA를 생산하기 위한 연구도 보고되었다(Hahn et al., 2009; Sim et al., 2009).

식물시스템을 의료용 단백질 생산 공장으로 활용하는 기술 은 1994년 이후로 치료용과 진단용 항체, 바이오 의약품, 기 능성 단백질 및 산업용 효소 등 100여개의 단백질들을 대상 으로 발현연구 및 특성분석이 진행되었고 그 중 20개 이상의 단백질이 전임상 또는 임상 단계에 진입 중이다(Paul and Ma, 2011). 또한 12개의 진단 및 시약용 관련 제품들이 시판 중에 있으며(Jian et al., 2015) 앞으로 보다 많은 단백질과 펩 타이드 의약품이 임상 실험을 마치고 시장에 진입할 것으로 예 상되고 있다.

본 연구 결과에서는 벼의 아미노산 코돈 이용에 최적화된 합성 t-PA 유전자와 6개의 히스티딘(histidine) tag을 카르복실 말단에 붙여 정제를 용이하게 만든 t-PAHis₆ 유전자를 벼 GluB1 프로모터를 이용하여 벼 종자에서 전사가 이뤄지고 섬 유소 용해 활성이 있는 재조합 t-PA 단백질이 발현됨을 증명 하였다. 또한 벼 염색체에 합성 t-PA 유전자와 t-PAHis₆ 유전 자가 삽입된 것을 확인하였으며 발현된 재조합 t-PA 단백질의 섬유소 분해능, 플라스미노겐 활성화인자 억제제에 대한 활성 억제, 벼 종자 내에 발현양 측정 등 생화학적 특성을 구명하 였다. 본 연구는 벼 종자에서 혈전용해제를 생산하는 기술로 식물체 잎과 뿌리에서 생산하는 방법보다 더 높은 발현양을 확인하였으며, 동물세포에서 생산되는 혈전용해제에 비하여 저 렴하게 혈전용해제를 대량생산할 수 있는 기술을 개발하였다.

재료 및 방법

코돈 최적화된 t-PA 및 t-PAHis6유전자 발현용 벡터 제작

벼 유래의 글루테린 B1 단백질(GenBank accession no. X54314)의 신호서열과 연결되어 있는 합성 st-PA 유전자 (1,656bp)와 t-PAHis₆유전자(1,674 bp)를 글루테린 B1 프로모터 (Wu et al., 2000) 및 Pin II(potato protease inhibitor II) 터 미네이터를 포함하는 식물 발현 벡터 pMJ21(Jang et al., 2003)에 클로닝하기 위해서 다음과 같이 발현용 벡터를 제작 하였다.

합성 t-PA (st-PA) 유전자는 Entelechon회사(독일)에 의뢰하 여 합성하였고(한범수 등), 제한 효소 BamH I과 Hind III로 절단 후, 탈인산화 된 pSK-GluB1에 삽입하였다. 그런 후, 식 물 형질전환용 벡터 pMJ21 (Jang et al., 2003)에 삽입하기 위해서 Xho I과 Not I로 절단 후, 탈인산화 된 상기 pMJ21 벡터에 연결하여 형질전환용 pMJ21GluB1-st-PA 벡터를 제작 하였다. 또한 pMJ21GluB1-t-PA벡터를 주형으로 OsglutelinF2 프라이머(5´-CCGCTCGAGTTTTTGAGGAATTTTAGAAGTT GAAC-3´)와 OsHTPAHIS6R2 프라이머(5´-ATAAGAATGCGG CCGCTCACACGTGGTGA-TGGTGATGATGCGGTCGCAT GTTGTCACGAATCC-3´)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 95°C 5분, 1회; 94°C 30초, 60°C 30초, 72°C 2분, 30회; 72°C 7분, 1회로 하여 t-PAHis₆ 유전자를 증 폭하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 DNA 절편 크기를 확인 하였고 t-PAHis₆ 유전자를 포함하는 DNA를 정제를 하였다. 정제된 DNA는 Xho I과 Not I으로 절단 후, pMJ21벡터에 연결하여 pMJ21GluB1-t-PAHis₆ 벼 형 질전환용 벡터를 제작하였다.

아그로박테리아 형질전환 및 증식

pMJ21GluB1-st-PA와 pMJ21GluB1-t-PAHis₆벡터를 아그로 박테리아 LBA4404(pSB1) (Hiei et al., 1994)에 도입하기 위 해서 triparental mating 방법(Glevin et al., 1994)을 사용하였 다. 형질전환된 아그로박테리아는 2일간 AB 배지[AB 완충용 액(60 g/L K₂HPO₄, 20 g/L NaH₂PO₄), AB salts(20 g/L NH₄Cl, 6 g/L MgSO₄·7H₂O, 3g/L KCl. 0.2g/L CaCl₂, 0.05 g/L FeSO₄· 7H₂O), 5 g/L glucose, 15mg/ml tetracycline, 50mg/ml spectinomycine, 50mg/ml kanamycine]에서 배양하여 이를 AAM 배지[1X N6 macro elements, 1x N6 micro elements, 1x AA amino acids (877mg/L glutamine, 228mg/L arginine, 75mg/L glycine, 26 6mg/L aspartic acid), 1x MS vitamines, 500mg/L casamino acids, 36 g/L glucose, 68.5 g/L sucrose, 100 μM/L acetosyringone]로 흡광도 600 nm에서 1.5 값으로 재현탁시켜 벼 캘러스 형질전환에 사용 하였다.

벼 형질전환

St-PA 유전자와 t-PAHis₆유전자를 벼 종자에서 발현시키고자 위에서 제조한 아그로박테리아 LBA4404 (Glevin et al., 1994)를 Hiei 등의 방법에 따라 벼 캘러스에 형질전환하였다 (Hiei et al., 1994). 소독한 완숙종자의 현미 벼를 2N6 배지 에 파종하여 암조건하에서 4주간 무균 배양 하여 embryogenic 캘러스를 유도하여 형질전환에 이용하였다. 그런 후, 아그로박 테리아를 상기 캘러스에 20분간 감염하였고 암조건으로 상온 에서 3일간 2N6 배지에서 공동 배양하였다. 다량의 아그로박 테리아를 제거하기 위해서 증류수로 3번 세척 후, 250 mg/L 세파탁심(cefotaxime)과 6 mg/L ppt(L-phosphinotricin)를 함유 하는 2N6배지(Maxim-Bio, 미국)에서 3주간 암배양하였다. 건 강한 캘러스를 위의 동일한 배지에서 2주간 암조건에서 계대 배양하였다. 저항성을 가진 캘러스를 MSR 배지[(4.4 g/L MS salt, 30 g/L sucurose, 2mg/L kinetin, 1mg/L NAA, 2.5 g phytagel, 250 mg/L cefotaxime, 6 mg/L ppt)]에서 한 달간 명 배양하여 재분화를 유도 하였다. 재분화가 유도될 때 까지 14 일 간격으로 캘러스를 동일 배지에 계대하였다. 줄기가 나온 식물을 MS배지에서 뿌리를 유도하였고, 뿌리가 나온 후 1주 일 지나 배양실에서 순화 후 온실에서 증식하였다. 형질전환 벼를 판별하기 위해서 6 mg/L ppt가 포함된 배지에서 계속 계 대하여 형질전환된 벼를 선발 하였다.

PCR과 서던 블랏 분석

각각의 형질전환된 벼 염색체 내에 st-PA와 t-PAHis₆유전자 의 존재 여부와 삽입된 유전자의 갯수를 알아보기 위해 PCR 과 서던블랏 분석을 실행 하였다. PCR 방법으로 st-PA와 t-PAHis₆유전자를 증폭하기 위하여, st-PA의 경우는 정방향 프라 이머로 각각 PCRsOSF1(5´-TCTTACCAGGTGATC-TGC AGGA-3´)과 역방향 프라이머로 PCRsOS R1(5´-TCAAGGT CGCATG-TTGTCCCTG-3´)을 사용하였다. t-PAHis₆의 경우는 정방향 프라이머로 t-PAF1(5´-TCTTACCAAGTGATCTGCAG AG-3´)과 역방향 프라이머로 t-PAR1(5´-TCACGGTCGCATG TTGTCACG-3´)을 사용하였다. 반응 조건은 95°C에서 5분간 전처리 후, 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 2분간 30회 반복한 다음 72°C에서 7분간 연장(extension)하였다. 증 폭된 PCR 산물은 아가로스 젤 전기영동 장치를 이용하여 분 석하였다.

벼 형질전환체 염색체 내에 삽입된 st-PA와 t-PAHis₆ 유전자 수를 측정하기 위해서 벼의 잎에서 분리한 각각의 10μg의 genomic DNA을 제한효소 BamH I (10U /μg)으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동 하였다. 그런 후, 젤을 1.5M NaCl, 0.5N NaOH 용액 내에서 45분간 부드럽게 교반하여 DNA를 변성시켰고 멸균수로 3회 세척 후, 1M Tris (pH 7.4), 1.5M NaCl 용액에 넣어 부드럽게 30분간 교반하였고, 새로운 용액으로 교체하여 15분 동안 추가로 교반하였다. Capillary transfer 방법으로 나일론 막(Hybond^TM-N⁺, GE Healthcare) 에 DNA를 전이시킨 후, 막을 5분 동안 6 × SSC 용액에 넣어 막 상에 남아있는 젤을 제거하였고, 3MM 종이를 이용 하여 30분 동안 건조하였다. 막 상의 DNA는 80°C에서 2시 간 동안 가온하여 고정시켰고, ³²P가 표지된 st-PA 또는 t-PA 프로브로 65°C에서 결합 반응을 수행하였다. 2x SSC, 0.5% SDS 용액(5분), 2x SSC, 0.1% SDS 용액(15분), 0.1x SSC, 0.5% SDS 용액(37°C와 65°C, 각각 1시간) 및 0.1x SSC 용 액으로 막을 배양과 세척한 후 X-ray 필름과 이미지 분석 스 크린을 이용하여 –70°C에서 24시간 동안 보관하였고, X-ray 필름 상의 밴드는 오토레디오그라피(autoradiography)를 이용 하여 검출하였다.

RT-PCR

형질전환된 벼 종자 내에서 st-PA와 t-PAHis₆유전자들의 전 사가 이뤄지는지 확인하기 위하여 참고문헌에 따라 RT-PCR 을 실시하였다(Kim et al., 2009). 역전사 효소를 이용하여 cDNA 합성하였으며, PCR 조건은 위에서 사용된 두 프라이머 를 이용하여 동일한 방법으로 실시하였다. 증폭된 PCR 산물 은 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였다. 대조군으로 화영 벼를 사용하였고 전사 반응의 유무을 확인하기 위하여 베타 액틴(beta-actin) 유전자를 대조군으로 사용하였다.

섬유소 플레이트법(fibrin-plate method)

재조합 t-PA와 t-PAHis₆ 효소의 섬유소(fibrin) 분해 활성을 확인하기 위해서 섬유소 플레이트법을 이용하여 재조합 효소 들의 섬유소 분해능을 측정하였다. 0.8%의 피브리노겐 (fibrinogen) 용액 40 ml과 5U의 트롬빈을 혼합한 후, 플레이 트에 붓고 30분간 상온에 방치하여 인공 섬유소를 합성하였다 (Astrup and Mullertz, 1952). 그런 후, 형질전환된 벼 가루를 PBS-0.5% Tween 20으로 추출한 용액 1 μg을 점적한 후, 습 도가 높은 37°C 배양기에서 하룻밤 방치하여 섬유소 분해능 을 측정하였다.

재조합 t-PA와 t-PAHis₆ 효소의 플라스미노겐 활성인자 억제 제(PAI-1)와 혼합 후, 섬유소 분해활성 억제 효과를 측정하였 다. PAI-1(1 μg)과 추출물 5 μg을 섞은 후, 상온에서 20분간 방치 후, 섬유소 플레이트법을 이용하여 억제 효과를 측정하 였다.

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

각각의 형질전환체로부터 추출된 추출물에서 섬유소 분해활 성을 가장 높은 갖게 나타낸 30개의 벼를 대상으로 재조합 플 라스미노겐 활성화 인자의 항원력 검증과 발현양을 측정하고 자 ELISA를 실시하였다. Soluble t-PA ELISA 키트(Cal- Biochem사)를 이용하여 형질전환체 내에 재조합 플라스미노 겐 활성화인자 양을 다음과 같이 측정하였다. PBS-0.5% Tween 20 추출 시료 1 μg/100 μl와 상온에서 1시간 반응 후, PBS-1% Tween 20으로 3회 세척 후, HRP가 붙어 있는 이차 항체를 사 용하여 상온에서 2시간 반응 후, 다시 PBS-1% Tween 20으로 3회 세척 하였으며, 100 μl의 TMB (tetramethyl-benzidine)를 처리하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. t-PA 표준품의 흡 광도 곡선을 이용하여 형질전환 벼 종자 추출물 내 재조합 t- PA양을 산출하였다.

웨스턴 블랏 분석

형질전환된 벼 종자내의 재조합 단백질의 분자량을 측정하 고자 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 형질전환된 벼 종자 가 루 100mg에 분해 완충용액(50mM Tris-Cl, pH 8.0, 100mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100) 0.5ml을 넣고 4°C 에서 60분간 방치 후, 분쇄기를 이용하여 현탁액을 조제하였 다. 그런 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 분리하여 50 μg의 단백질을 웨스턴 블랏에 사용하였다. 1차 항 체로는 t-PA에 대한 다클로날(polyclonal) 항체(Abcam, 미국) 를 사용하여 교반장치위에서 하룻밤 동안 4°C에서 방치하였 고, PBS-0.2% Tween 20 용액으로 5회 세척한 다음, HRP(horseradish peroxidase)가 붙어 있는 이차 항체(Pierce, 미국)와 상온에서 2시간 배양 후, 5회 세척하였으며 마지막으 로 ECL 용액을 이용하여 X-ray 필름에 감광시켜 분자량을 확인하였다.

결과 및 고찰

벼 종자 내 t-PA 유전자 발현용 벡터 제작 및 벼 형질전 환체 선발

벼 종자에서 st-PA와 t-PAHis₆ 유전자를 효율적으로 발현하 기 위해 벼의 아미노산 코돈 사용에 맞게 최적화를 수행하였 고, st-PA 유전자(1,656 bp)와 t-PAHis₆ 유전자(1,674 bp)에 벼 유래의 글루테린 B1 단백질(1,315 bp)의 신호서열을 결합시켜 GluB1 포로모터, 글루테린 B1 단백질의 신호서열, st-PA 유전 자 또는 t-PAHis₆ 유전자 및 Pin II 터미네이터로구성된 식물 발현벡터(pMJ21)를 제작 하였다(Fig. 1). 제작된 st-PA 유전자 와 t-PAHis₆ 유전자는 벼 GluB1 프로모터에 의해서 전사가 유 도되고, Pin II 터미네이터에 의해서 t-PA의 mRNA가 안정화 되도록 하였다(Fig. 1). 제작한 pMJ21GluB1-st-PA와 pMJ2 1GluB1-t-PAHis₆ 벡터를 벼 캘러스에 전이하게 하기 위하여 A. tumefaciens LBA4404 (pSB1)에 형질전환하였고, pMJ21 GluB1-st-PA와 pMJ21GluB1-t-PAHis₆ 벡터를 함유 아그로박 테리아 LBA4404 (pSB1)를 PCR로 확인 후, 벼 형질전환을 실행하였다. 식물조직배양을 통해 얻은 잠정적인 벼 형질전환 체는 6 mg/L ppt(MB cell, 미국)가 들어 있는 배지에서 생존 하였으며(data not shown), 섬유소 분해능 검정 후, 최종적으 로 30개체의 벼 형질전환체를 선발하여 생화학·분자생물학적 특성 연구를 진행하였다.

벼 형질전환체 염색체 내 t-PA 유전자 삽입 및 전사 확인

st-PA와 t-PAHis₆ 유전자의 벼 형질전환체 염색체 내에 삽입 유무, 삽입수 및 전사여부를 분석하기 위해서 선발한 벼 형질 전환체의 잎에서 genomic DNA를 분리하고 벼 종자에서 전체 RNA를 정제하여 PCR, 서던 블랏 및 RT-PCR 분석을 수행하 였다. 양성 대조군으로 사용한 벡터(pMJ21GluB1-st-PA와 pMJ21GluB1-t-PAHis₆)에서 t-PA와 t-PAHis₆ 유전자에 상응하 는 1.6 kb 크기의 PCR band를 확인할 수 있었고(Fig. 2(A), lane 2), 벼 형질전환체들의 genomic DNA를 주형으로 한 PCR 결과에서도 st-PA와 t-PAHis₆ 유전자에 해당하는 동일한 크기의 band를 각각 확인할 수 있었다(Fig. 2(A), lanes 4 ~ 11). 음성 대조군으로 화영벼의 genomic DNA를 주형으로 사 용하여 PCR을 수행한 결과, st-PA 유전자 및 t-PAHis₆에 상응 하는 band는 검출 되지 않았다(Fig. 2(A), lane 3).

형질전환된 벼 염색체내에 삽입된 st-PA 및 t-PAHis₆ 유전자 의 삽입수를 측정하기 위해서 서던 블랏을 실시한 결과, st-PA 유전자가 1 ~ 6개 삽입되어 있음을 확인 하였고(Fig. 2(B), lanes 2 ~ 5), t-PAHis₆ 유전자는 1 ~ 3개가 삽입되어 있음을 확 인 할 수 있었다(Fig. 2(B), lanes 2 ~ 5). 그러나 음성 대 조군으로 사용된 화영벼에서는 어떤 밴드도 검출되지 않았 다(Fig. 2(B), lane 1).

형질전환된 벼 종자에서 정제된 전체 RNA에서 st-PA 및 t- PAHis6 유전자의 전사여부를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, 벼 형질전환체 에서 만 st-PA 및 t-PAHis₆ 유전자 전사 물에 해당하는 1.6 kb의 band가 검출 되었다(Fig. 3, lanes 3 and 4). 베타 액틴(beta-actin) 유전자를 대조군으로 사용한 경 우는 화영벼 및 형질전환에서 0.5kb의 band가 검출 되었다 (Fig. 3, lanes 2 ~ 4). 이를 통해 벼 형질전환체 내에 st-PA 및 t-PAHis₆ 유전자가 벼 염색체 내에 삽입되어 있고 삽입된 유전자의 전사가 정상적으로 일어나고 있음을 확인하였다. 이 러한 결과는 담배에서 t-PA 유전자가 칼리플라워 모자이크 바 이러스의 35S 프로모터에 의해 발현을 유조하였을 때도 정상 적인 전사가 이뤄지고 있는 결과와 유사하였다(Kim et al., 2009).

섬유소 용해 활성 확인

섬유소 플레이트법을 이용하여 st-PA 또는 t-PAHis₆ 효소를 발현하는 벼 종자 추출액의 섬유소 용해 활성을 측정하였다. 단백질 추출과정을 통해 획득한 수용성 단백질을 섬유소 플레 이트에 점적한 결과, st-PA 또는 t-PAHis₆ 단백질을 발현하는 벼 형질전환체의 종자 추출물들에서 섬유소 용해 활성이 평균 0.36 cm² lysis zone (st-PA)과 0.89 cm² lysis zone (tPAHis₆) 로 관찰 되었다(Fig. 4(A)). 각각의 st-PA 또는 t-PAHis₆ 유전 자로 형질전환된 벼에서 최고의 높은 섬유소 용해도 값은 1.8 cm² lysis zone (t-PAHis₆) 및 1.56 cm² lysis zone (st-PA) 로 분석 되었다. 음성 대조군으로 사용된 화영벼의 종자 추출 물에서는 섬유소 분해 활성을 나타내지 않았다(Fig. 4(A), wt). 벼 코돈 이용에 맞게 최적화된 st-PA 유전자가 t-PAHis₆에 비 해 평균 섬유소 분해 활성이 높을 것으로 기대하였으나 2.5배 약한 것이 관찰된 이유로는 벼 코돈 사용 최적화가 되지 않았 거나, 실험에 사용한 형질전환체의 숫자가 작아 정확한 분석 이 이뤄지지 않은 결과 및 발현된 단백질의 세포내 이동 및 저장 공간이 다른 결과로(Haq et al., 1995; Kim et al., 2003) 유추되며, 더 많은 형질전환체를 확보하여 추가적인 분 석이 필요할 것으로 생각된다.

플라스미노겐 액티베이터 억제제(PAI-1)의 벼 추출물 내의 재조합 st-PA와 t-PAHis₆ 효소의 섬유소 분해활성 억제 효과 를 측정한 결과, PAI-1과 재조합 st-PA와 t-PAHis₆ 효소가 함유된 벼 추출물에서는 t-PA 효소 활성이 완전히 저해되었 고(Fig. 4(B), lanes 5 and 6), 음성 대조군인 화영벼 종자 추출물에서는 섬유소 분해 활성이 검출되지 않았다(Fig. 4(B), lanes 1 and 4). 그러나 PAI-1를 첨가하지 않은 재조합 st-PA 와 t-PAHis₆ 효소가 함유된 벼 추출물에서는 섬유소 분해 활성 이 관찰되었다(Fig. 4(B), lanes 2 and 3). 이러한 결과는 st- PA와 t-PAHis₆ 유전자가 벼 종자에서 활성이 있는 형태로 발현 되고 인체 내 t-PA 효소 억제제인 PAI-1에 대한 동등한 결합 구조를 나타내고 있음을 유추할 수 있다. 이것은 벼에서 정제 된 재조합 t-PA가 향후 치료제로써 사용될 때, PAI-1에 의한 생체 내 조절이 이뤄질 수 있음을 가정 할 수 있다.

벼 형질전환체 종자 내 재조합 t-PA 단백질의 함량 결정

벼 종자 추출물에 함유된 재조합 t-PA 단백질의 함량을 측정 하기 위해서 ELISA를 실행하였다. t-PA 단백질의 발현양을 결 정하기 위해 유전자별로 선발된 각각의 30개체의 벼 형질전환 체 종자에서 단백질을 추출하여 ELISA를 수행한 결과, 전체 수 용성 단백질(total soluble protein, TSP) 중 634 ~ 2,916 ng/mg (st-PA)과 925 ~ 2,640 ng/mg (t-PAHis₆)의 범위에서 t-PA 단백 질이 발현됨을 측정할 수 있었다. 벼 형질전환체의 t-PA 단백질 평균 발현양은 2,113 ng/mg (st-PA)과 1,805 ng/mg (t-PAHis₆)으 로 측정되었으며 가장 높은 발현양은 st-PA로 형질전환된 벼 종자에서 2,916 ng/mg로 측정되었다. 반면에 음성대조군으로 사용된 화영벼 종자에서는 재조합 t-PA 단백질이 검출 되지 않았다(Fig. 5(A)). 본 연구에서 사용한 st-PA 또는 t-PAHis₆ 유전자를 GluB1 프로모터에 의해 벼 종자 내에 발현한 결과, st-PA의 최대 발현양은 담배에서 t-PA 유전자를 칼리플라워 모 자이크 바이러스의 35S 프로모터에 의해 발현시켰을 때의 보 다 30배 높게 나타났다(Kim et al., 2009). 이러한 결과는 종 자 내에 발현된 재조합 t-PA 단백질이 종자가 성숙됨에 따라 수분 없는 환경에 놓이게 되고 발현된 재조합 단백질 분해진 다(Stevens et al., 2000; Outchkourov et al., 2003)가 느려 져 총 단백질 함량이 증가 되는 것으로 생각된다. 벼 종자 내 에 st-PA 또는 t-PAHis₆ 유전자를 발현한 본 연구결과는 식물시 스템을 이용한 재조합 단백질 발현연구 문헌에 보고된 결과 (전체 수용성 단백질 중 0.002 ~ 7%와 유사한 결과를 보였다 (Schillberg et al., 2003).

벼 종자 내에 발현된 재조합 t-PA 단백질의 분자량 확인

형질전환된 벼 종자 추출물 내에 함유된 t-PA와 t-PAHis₆ 단백질의 분자량을 측정하기 위해 수용성 단백질을 가지고 웨 스턴블랏 분석을 실행하였다. 대조군으로 사용된 화영벼 종자 추출물에서는 t-PA 단백질에 상응하는 어떤 band도 관찰할 수 없었던(Fig. 5(B) lane 2) 반면에 선발된 벼 형질전환체의 종 자의 수용성 단백질에서는 동물세포에서 생산된 68 kDa의 t- PA의 분자량(Fig. 5(B) lane 1)과 같은 band를 확인할 수 있 었다(Fig. 5(B) lanes 3 ~ 4). 이러한 결과는 한 등의 보고와 유사하였다(Hahn et al., 2009).

적 요

본 연구에서는 뇌졸중과 심근경색 등의 치료제로 널리 사 용되어지고 있는 혈전용해제 t-PA를 벼 종자에서 생산하기 위해 t-PA 유전자를 벼의 코돈 이용 최적화에 맞게 합성하였 고 벼 종자 추출물에서 정제를 용이하게 하기 위하여 His₆ tag을 붙인 벡터를 제작하여 벼 종자 내에서 혈전용해제 t- PA를 생산 하였다. 또한 벼 염색체 내에 t-PA 유전자 삽입, 전사확인, 인공혈전 용해 활성과 분자량의 등의 생화학적 특 성을 구명하였다.