1980년대 이후에 생명공학기술을 이용하여 교배가 어렵거 나 장기간이 소요되는 기존 전통 육종의 한계를 극복하고자 다 양한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구 개발 산물 중 유전자 총(particle bombardment)을 이용해 제초제(glyphosate) 저항성 유전자(modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, epsps)를 도입한 제초제 저항성 콩은 1996년 북미지역을 시작 으로 아르헨티나, 브라질 등 여러 나라에서 재배되고 있다 (McCabe et al. 1988). 유전자변형(Genetically Modified, GM) 콩은 전 세계 9,070만 ha의 면적에서 재배되고 있으며, 전 세 계 콩 재배면적(11,100만 ha)의 82%를 차지하고 있다(James, 2014). 국내에서도 콩 형질전환 연구가 진행되어 형질전환 콩 을 개발했다는 보고는 있으나 아직까지 실용화 단계까지는 도 달하지 못하고 있다(Kim et al. 2003).
현재 국내에서는 유전자변형 작물이 재배되고 있지 않지만, GM 작물에 대한 연구 개발은 계속되고 있다. GM 작물은 농 약 사용 절감에 의한 환경 보존 및 온실가스 배출 절감에 따 른 기후 변화 대응 효과(Brookes & Barfoot, 2006), 생산비 절감에 의한 생산성 증가(Owen, 2000) 등의 이점이 있지만, 유전자 전이에 따른 도입 유전자의 이동과 잡초화 가능성 (Ellstrand, 1992), 생태계 교란(Conner et al., 2003) 및 독성 및 알레르기 물질 생산(Konig et al., 2004) 등의 우려도 있 다. 우리나라에서 2008년 시행된 유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법(LMO법)은 안전성 확보를 위한 사전 위해 방지를 규정하고 있어 상용화를 위해서는 GM 작물이 인체와 환경에 미칠 수 있는 요인들에 대한 면밀한 안전성 평가가 필 요하며, 이 중에서도, 특히 도입 유전자에 의한 농업환경 생물 종에 대한 영향 평가 항목이 GM작물의 안전성 심사서에 요 구되고 있다(Oh et al., 2014; Moon et al., 2013).
우리나라에서 GM작물의 농업환경 생물종에 대한 영향 평 가는 국내 개발된 GM벼에 대해서 연구가 주로 진행되고 있 다. 특히 농경지 주변 수로 및 하천의 유입에 의한 수서 생물 종에 대한 영향을 분석하기 위하여 해충저항성 Bt벼와 비타민 A 강화벼, 병저항성 GM벼가 물벼룩(Daphnia magna)에 미치 는 영향을 분석되었다(Oh et al., 2011; Oh et al., 2012a; Oh et al., 2014a). 또한, 병저항성 GM벼, 비타민 A 강화벼, 레스베라트롤 생합성 GM벼가 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus) 와 잉어(Cyprinus carpio) 등의 어류에 미치는 영향을 분석한 결과들도 보고되었다(Oh et al., 2013; Oh et al., 2014b; Moon et al., 2013). 육상 생물종에 대한 영향 평가로는 해충 저항성 Bt벼와 비타민 A 강화벼의 급이에 의한 벼물바구미 (Lissorhoptrus oryzophilus)의 살충제 감수성에 미치는 영향이 보고되었으며(Oh et al., 2012b; Oh et al., 2012c), 레스베라 트롤 생합성 GM벼와 모품종간의 벼멸구(Nilaparvata lugens) 생존률에 미치는 영향 등이 조사되었다(Moon et al., 2013). 아직까지 GM콩에 대한 농업환경 생물종의 영향 평가가 수행 되지 않았다.
콩에 풍부한 토코페롤은 대부분 감마-토코페롤이며 비타민 E 활성이 가장 높은 알파-토코페롤 함량은 낮은 편이다. 최근 대사공학의 발달로 식물체내 토코페롤 합성과 이용에 관한 기 작들이 자세히 밝혀져 γ-TMT (γ-tocopherol methyltransferase) 효소가 감마-토코페롤을 알파-토코페롤로 전환시키는 것으로 알려졌으며(Shintani & DellaPenna 1998), 들깨 유래 γ-TMT 유전자가 종자에서 발현되도록 제작된 운반체를 아그로박테리 움을 이용해 자엽절에 형질전환하여 모품종에 비해 알파-토코 페롤 함량을 증가시킨 비타민 E 강화콩을 개발하였다(Lee et al. 2011a; Lee et al. 2011b).
본 연구에서는 비타민 E 강화콩의 γ-TMT 유전자의 도입 검정과 제초제 저항성 유전자인 PAT 유전자의 단백질 발현량 을 확인한 후, 모품종인 Willams 82와 함께 비타민 E 강화콩 의 농업환경 생물종에 대한 독성 시험을 위해서 환경생물 독 성시험 기준과 방법 (농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 명시 된 환경생태독성시험 생물로서 수생생물인 물벼룩에 대한 비 타민 E 강화콩의 영향을 분석하였다. 본 시험을 통해 획득한 결과는 국내 개발 GM 콩의 안전성 평가를 위한 심사 자료뿐 만 아니라, GM 콩의 농업환경 생물종에 대한 위해성 평가 지 침 마련을 위한 기초 자료로 활용할 계획이다.
재료 및 방법
시료 제조
비타민 E 강화콩(1208-3-30)과 비형질전환 모품종인 Willams 82 콩을 2013년 LMO 격리 포장(경기도 수원시 서둔동)에서 재배하고 잎과 줄기 부위를 수확하여(성숙기) 동결건조한 후 (FD8518, 일신랩, 한국) 분쇄기를 이용하여(HMF-3100S, 한일 전기, 한국) 분쇄하였다. 분쇄된 비타민 E 강화콩과 Willams 82의 시료는 600 μm의 표준망체(청계산업, 한국)를 이용하여 선별 한 후, 급성독성을 평가하기 위해 물벼룩의 사육용수에 현탁하기 전까지 −70°C에 보관하였다. 시험 물질(비타민 E 강 화콩, Willams 82)을 수질오염공정시험기준(ES 04751.1)의 물 벼룩을 이용한 급성독성시험법(2010)에 따라 조제된 물벼룩 배 양액에 현탁시켜 사용하였다.
Genomic DNA 추출 및 도입유전자 Polymerase chain reaction (PCR) 분석.
비타민 E 강화콩(1208-3-30)과 비형질전환 모품종인 Willams 82을 각 1 g 씩 액체질소를 처리하며 막자사발을 이 용하여 분말화한 후 DNeasy plant kit (Qiagen, CA, USA) 를 사용하여 비타민 E 강화콩과 Willams 82의 genomic DNA를 분리 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 Spectrophotometer NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Tech., Inc, Wilmington, USA)을 이용하여 정량하였으며, 260/280 nm 값이 1.8 ~ 2.0 사이인 genomic DNA의 시료만을 PCR 분석용 주 형 DNA로 사용하였다. 식물 형질전환용 운반체의 유전정보 를 바탕으로 γ-TMT, PAT, Actin 유전자 검정용 프라이머를 제 작하였다(Table 1). 비타민 E 강화콩의 도입유전자 PCR 분석 을 위하여 10X PCR buffer 4 μl, dNTP(10mM) 1 μl, 프라 이머 각 20 μM, f-Taq DNA polymerase 1 unit(Solgent, 한 국), 주형 genomic DNA 200 ng을 각각 첨가한 후, 증류수 를 이용하여 최종 부피를 40 μl로 하였다. PCR 반응은 PTC- 100 Thermal cycler (MJ Research, USA)를 이용하여 1 cycle (94°C, 5분), 30 cycle(94°C에서 30초, 56°C에서 30초, 72°C에 서 30초), 1 cycle(72°C, 5분) 과정을 순차적으로 실시하였다. 증폭된 PCR산물은 1% agarose gel에서 전기영동한 후 UV조 사로 확인하였으며, Gel Extraction kit (Qiagen, CA, USA) 를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEM T-easy vector (Promega Madison, USA)를 이용하여 클로닝한 후, 염기서열을 확인하였다.
환경 방출 조건에 따른 비타민 E 강화콩의 목적 단백질 함량 분석
경작에 의한 비의도적 환경 방출 조건에 따른 비타민 E 강 화콩(1208-3-30)의 목적 단백질인 PAT 단백질 함량 변화를 조 사하기 위하여 2013년 11월 4일에 수원 LMO 격리포장에 비 타민 E 강화콩(1208-3-30)의 잎과 줄기 등을 10 cm 길이로 절단한 후, 100 g씩 그물망(메쉬 규격 1 mm)에 보관하여 토양 매립(표층에서 15 cm 매립), 노지(표층) 노출, 수로 노출(집수 정, 침수)의 환경 조건에 방출하였다. 환경 방출 기간 중 0. 4, 8, 12, 16, 20주 간격으로 비타민 E 강화콩의 PAT 단백질 이 미검출되는 기간까지 분석을 수행하였으며, 비타민 E 강화 콩의 PAT 단백질 함량 측정은 ELISA를 이용하여 분석하였다.
비타민 E 강화콩의 PAT 단백질 분석
비타민 E 강화콩(1208-3-30)에 도입된 Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 유전자의 발현 확인을 위하여 Immunostrip 검정(lateral strip test)을 실시하였다. 비타민 E 강 화콩(1208-3-30)의 시료를 추출액과 함께 분쇄하여 단백질을 추출한 후, Trait LL Test Strip(Strategic Diagnostics Inc, Newark, DE)을 이용하여 PAT 유전자의 발현을 확인하였다. PAT 단백질의 농도를 정량하기 위하여 비타민 E 강화콩(1208- 3-30)과 Willams 82의 시료들을 마쇄한 후 PBST (Phosphate buffered saline [PBS], 0.05% Tween-20)용액을 처리하여 균 질화한 후, 저온처리 (얼음에서 5분) 및 원심분리(5,000 g, 5 분)를 통해 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질의 ELISA분 석은 PAT/bar ELISA kits (EnviroLogix LibertyLink, Portland, USA)를 이용하여 실시하였다. 비타민 E 강화콩(1208-3-30)과 Willams 82의 시료는 상온에서 2시간 반응한 후 ELISA reader (Multiskan EX, Thermo Scientific)를 이용하여 450 nm 파장 에서 흡광도를 측정하였다.
급성독성 평가를 위한 물벼룩 배양 조건
물벼룩(Daphnia magna)은 500 ~ 1000 Lux 광조건 16시간, 암조건 8시간, 수온 20±2°C의 환경으로 사육하였으며, 물벼룩 의 먹이로 Chlorella vulgaris (ATCC, Manassas, USA)를 1회 공급하였다. 물벼룩의 배양액의 알칼리도는 110 ~ 120 mg CaCO3/L, 경도는 160 ~ 180 mg CaCO3/L, pH는 7.6 ~ 8.0, 용존산소는 3.0 mg/L 이상 유지되도록 하여 사용하기 전 24시 간 폭기시켰다. 수질의 경도는 한국산업규격 KSI3206의 Inductively coupled plasma emission spectroscopy에 의해, 알칼리도는 Standard method(21th edition, APHA, AWWA, WEF, USA)의 염산적정법에 의해 측정하였으며, 검사 결과 급 성 독성 평가 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
물벼룩 급성독성 시험의 비타민 E 강화콩과 Willams 82 처리 조건
비타민 E 강화콩(1208-3-30)과 Willams 82의 시료를 사용 한 유효농도 설정 예비시험결과, 48시간 EC50(median effective concentration)값이 1000.00 ~ 10,497.60 mg/L 범위 내에 있을 것으로 추정되어 1000, 1,800, 3240, 5830, 10500 및 20000mg/L 의 농도에서 시험을 수행하였다. 시험용액은 조제된 시험물질 을 0.100, 0.180, 0.324, 0.583, 1.050 및 2.000 g씩 정확히 정량하여 100 mL의 배양액에 각 반복구당 처리하여 시험용액 으로 사용하였으며, 음성 대조구로 시험용수인 배양액을 사용 하였다. 시험에는 생후 24시간이내의 비슷한 크기의 어린 물 벼룩을 사용하였으며, 시험 개체수는 각 처리별로 10마리씩 3 반복으로 하였다. 노출환경의 수온 조건은 20 ± 2°C를 유지하 였다.
물벼룩 급성독성 평가를 위한 조사항목
비타민 E 강화콩(1208-3-30) 또는 Willams 82 처리구의 물 벼룩에 대한 급성독성여부를 평가하기 위하여 24시간 경과 후, 유영저해개체 수, 특이증상 및 일반중독증상 등을 분석하였다. 유영저해를 확인하기 위해서 시험 용기를 천천히 움직이고 15 초 후에 후복부 및 촉각 등은 움직이나 유영하지 못하는 것을 유영저해 물벼룩으로 간주하였다. 시험기간 중 시료 처리 직 후와 종료 시에 각 처리구의 수온, pH 및 DO(Dissolved oxygen)를 조사하였다. 수온과 pH는 HANNA사의 pH meter 를 사용하였고, DO는 ISTEK사의 DO-300L DO meter를 사 용하여 측정하였다. EC50(median effective concentration)산출 은 시험물질 처리 후 48시간의 유효성분에 대한 반수영향농도 (EC50) 및 95% 신뢰한계를 시험물질의 노출 정도와 영향 가 능성의 상관관계를 실험식을 이용하여 분석하는 통계 방법인 probit 분석법에 의해 산출하였다.
결과 및 고찰
비타민 E 강화콩의 분자생물학적 분석
농업적, 환경적, 경제적 및 사회적인 이익으로 유전자변형 (GM) 작물이 점점 더 많은 국가에서 재배되고 있다. 국내에 서도 주요 작물을 대상으로 기능성 GM작물이 개발되고 있으 며, 들깨 유래의 γ-TMT (γ-tocopherol methyltransferase)를 도 입하여 알파 토코페롤 함량을 증가시킨 비타민 E 강화콩이 개 발되었다(Lee et al., 2011a; Lee et al., 2011b). 들깨 유래의 γ-TMT (γ-tocopherol methyltransferase) 효소와 Streptomyces hygroscopicus 유래의 제초제저항성 유전자 PAT가 도입된 비 타민 E 강화콩(1208-3-30)과 비형질전환 모품종인 Willams 82 콩을 수원 GM격리포장에서 재배한 후 농업환경 지표종인 비표적 생물체 물벼룩에 대한 독성평가를 실시하였다.
비표적 생물체 독성 평가 시료로 사용된 비타민 E 강화콩 으로부터 γ-TMT와 PAT 유전자의 삽입을 확인하기 위하여 PCR 분석용 프라이머를 제작하였다. 음성 대조군으로 내재유 전자 검출 프라이머는 Actin 유전자의 염기 서열로부터 제작 하였다(Table 1). PCR 분석 결과, γ-TMT 유전자는 비타민 E 강화콩에서만 300 bp의 밴드가 검출되었고, 비형질전환체인 Willams 82에서는 검출되지 않았다. PAT 유전자에 대한 PCR 분석 결과에서도 비타민 E 강화콩에서만 466 bp 크기의 밴드 가 검출되었고, 비형질전환체인 Willams 82에서는 검출되지 않았다. 반면에 내재유전자인 Actin은 비형질전환체인 Willams 82와 비타민 E 강화콩 모두에서 560 bp 밴드가 검출되었다. PCR 분석 결과 물벼룩 급성 독성 평가 실험에 이용된 비타민 E 강화콩(1208-3-30)에 γ-TMT와 PAT 유전자가 도입되었고, 안정적으로 유지되고 있음을 확인하였다(Fig. 1).
비타민 E 강화콩에서 PAT 단백질의 발현 유무를 확인하기 위하여 항체를 이용한 lateral flow strip test (LFST)분석을 수행하였다. 분석에 사용된 비타민 E 강화콩과 Willams 82의 시료에 대하여, PAT 단백질 확인용 항체가 표지되어 있는 immunostrip을 이용하여 PAT 단백질 발현 유무를 분석한 결 과, 비타민 E 강화콩에서만 특이적으로 단백질이 발현되었으 며, 대조구인 Willams 82에서는 발현되지 않았다(Fig. 2). 또한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이 용하여 비타민 E 강화콩에서의 PAT 단백질 발현량을 분석 한 결과, 43.16 ± 1.20 μg/g 수준의 PAT 단백질이 특이적으 로 발현되었으며 Willams 82에서는 발현되지 않음을 확인하 였다(Table 2).
비타민 E 강화콩의 노출 조건과 시기별 목적 단백질 함량 분석
비타민 E 강화콩(1208-3-30)의 경작에 의한 비의도적 환경 방출 유형(토양 매립, 노지, 수로)과 환경 방출 시기별(0, 4, 8, 12, 16, 20주)로 PAT 단백질 함량을 ELISA로 분석한 결과, 환경 방출 유형별에서는 토양 매립 유형에서 0주차의 PAT 발현량이 36.93 ± 1.63 μg/g, 4주차 17.36 ± 0.76 μg/g, 8주차 10.44 ± 0.74 μg/g, 12주차 9.62 ± 1.05 μg/g, 16주차 2.53 ± 0.65 μg/g 그리고 20주차에서 0 μg/g으로 조사되었다. 노지 유형에서는 4주차 29.66±1.84μg/g, 8주차 18.22 ± 1.24 μg/g, 12주차 8.30±0.62 μg/g, 16주차 2.56±0.19 μg/g 였으며, 20주 차에서 0 μg/g으로 나타났다. 수로 방출에서는 4주차 13.81 ± 0.78 μg/g, 8주 3.81 ± 0.58 μg/g, 12주 1.68 ± 0.09 μg/g, 16주 에는 0 μg/g으로 조사되었다(Table 3). 환경 방출 유형별로 수 로, 매립, 노지 순으로 PAT 단백질 함량이 시간에 따라 더 빨 리 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 수로 방출 조건 이 유수에 의한 물리적인 작용과 미생물에 의한 유기물의 분 해 속도가 다소 증가하여 토양 매립과 노지 보다는 PAT 단백 질 함량이 급격하게 감소하기 때문으로 추측된다.
물벼룩 급성독성 시험 용수의 수질 분석
본 시험에 사용된 시험용수에 대한 시험기간 중 수질 분석 은 시험물질 처리 직전(0 시간)과 시험 종료시(48시간)에 pH 와 수온을 조사하였다. pH는 처리 시작시Willams 82 처리구 는 평균 6.98(6.78 ~ 7.33), 비타민 E 강화콩 처리구는 평균 6.98(6.80 ~ 7.32)로 측정되었다. 48시간 후에는 Willams 82는 평균 6.28(5.57 ~ 6.69), 비타민 E 강화콩은 평균 6.33 (5.61 ~ 7.05)으로 측정되었다. 반면에 음성대조구(0 mg/L)의 처 리 시작시에는 평균 7.31과 48시간 후에는 7.05로 각각 측정 되었다. 음성 대조구 대비 Willams 82와 비타민 E 강화콩 처 리구의 pH의 차이는 유기물 시료인 Willams 82와 비타민 E 강화콩이 물벼룩의 호흡 등 생리 작용과 유기물 분해 등에 의 해 pH에 영향을 주었을 것으로 추정된다(Table 4). 각 처리농 도에 따른 Willams 82와 비타민 E 강화콩 간 물벼룩의 시험 용수 pH에 대한 t-test 분석 결과 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서 48시간후에는 각각 p값이 0.06, 0.06, 0.07, 0.14, 0.35, 0.23 이었다. 따라서 모든 처리 농도에서 GM 콩 대비 non-GM 콩 품종간의 시험용수 pH에 는 유의적인 차이가 없는 것으로 조사되었다(p>0.05). 실험 개 시후 48시간에 수온은 Willams 82 처리구에서는 평균 20.6 ± 0.2°C (20.3 ~ 21.0°C)이었고, 비타민 E 강화콩 처리구에 서는 평균 20.5 ± 0.2°C (20.0 ~ 21.1°C)로 측정되었다(Table 5). 각 시험농도에서 GM 콩 대비 non-GM 콩 품종간 물벼룩의 사육 온도에 대한 t-test 검정결과 1,000, 1,800, 3,240, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구의 48시간 후에는 각각 p값이 1, 0.51, 0.46, 0.13, 1, 0.76이었으며, 모든 처리농도에서 GM 콩 대비 non-GM 콩 간 사육 온도에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(p>0.05).
시험용수의 DO는 예비 시험의 측정결과를 바탕으로 물벼룩 의 생육 환경에 준하여 포화용존산소량의 60% 이하로 내려가 는 것을 방지하기 위하여 24시간 간격으로 30분간 산소를 공 급하였다. 시험기간 중 Willams 82와 비타민 E 강화콩의 처 리 농도간 DO는 유의적인 차이가 없었다.
비타민 E 강화콩과 Willams 82의 처리농도에 따른 물벼 룩의 유영 저해 분석
물벼룩은 무기 및 유기 독성물질에 민감하게 반응하므로, 물 벼룩의 환경 독성 평가를 위해서는 실험 물질 독성의 정도에 따라 24시간과 48시간 후의 유영 저해 정도를 분석한다(Kim et al., 2010). 비타민 E 강화콩 또는 Willams 82에 대한 물 벼룩(D. magna) 급성독성시험을 위해 48시간 동안 비타민 E 강화콩과 Willams 82의 각 처리 농도별로 각 10마리의 물벼 룩을 3반복으로 처리한 후 생사수를 조사하였다.
Willams 82를 1,000 ~ 20,000 mg/L로 처리한 시험에서 처리 후, 24시간 경과시 1,000 또는 1,800 mg/L 처리구에서는 유영 저해 개체가 없었으나, 3,240, 5,830, 및 10,500 mg/L 처리구 에서 24시간 경과시 각각의 농도에서 13.3, 60, 93.3 %의 유 영저해 개체가 관찰되었으며, 20,000 mg/L 처리구에서는 100%가 유영 저해 개체로 관찰되었다(Table 6). 48시간 경과 시 1,000, 1,800, 및 3,240 mg/L 처리구에서는 23.3, 16.6, 53.3%의 유영 저해 개체가 각각 관찰되었고, 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서는 48시간 후에 100%가 유영 저 해 개체로 관찰되었다. 각 처리구에서 3반복 간의 유영 저해 개체수의 유의적인 편차가 없었으나, 24시간의 3,240 mg/L 처 리구와 48시간의 1,800 mg/L 처리구에서는 각 반복 처리간의 편차가 보였다. 비타민 E 강화콩을 1,000 ~ 20,000 mg/L로 처 리한 시험에서 처리 후 24시간 경과시 1,000, 1,800, 3,240 mg/L 처리구에서는 유영 저해 개체가 없었으나, 5,830 mg/L 처리구에서 36.6%의 유영 저해 개체가 관찰되었 으며, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서는 100%가 유영 저 해 개체로 관찰되었다. 48시간 경과시 1,000, 1,800, 3,240mg/L 처리구에서는 20. 26.6, 46.6%의 유영저해가 관찰되었다. 48시 간 경과시에 5,830, 10,500 및 20,000 mg/L 처리구에서는 100%가 유영 저해 개체로 관찰되었다. 처리 기간 중 음성대 조군(0 mg/L)에서는 일반 중독 증상 및 특이증상은 관찰되지 않았다(Table 6). 각 시험농도에서 GM 콩 대비 non-GM 콩 품종간 물벼룩의 유영 저해 개체수에 대한 t-test 검정결과, 3,240, 5,830, 및 10,500 mg/L 처리구에서 24시간 후에는 각 각 p값이 0.20, 0.06, 0.37으로 분석되었으며, 48시간 처리후 의 p값은 1,000, 1,800, 및 3,240 mg/L 처리구에서 각각 0.37, 0.34, 0.23이었다. 24시간과 48시간 후의 모든 처리농도 에서 Willams 82와 비타민 E 강화콩 간의 평균 유영 저해 개체 수에는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(p>0.05).
비타민 E 강화콩과 Willams 82의 급이에 의한 물벼룩의 급성 독성
비타민 E 강화콩과 모품종인 Willams 82의 물벼룩 (Daphnia magna)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과, 48시 간-EC50은 Willams 82는 2408.535 mg/L(95% 신뢰한계 : 1017.223 ~ 4626.616 mg/L), 비타민 E 강화콩은 2416.207 mg/ L(95% 신뢰한계 : 1219.736 ~ 4152.232 mg/L)로 95% 신뢰한 계 구간에서 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(Table 7). 이는 γ-TMT가 도입된 비타민 E 강화콩이 모품종인 Willams 82에 비해 물벼룩의 급성 독성에 영향을 미치지는 않은 것으 로 보였으며, γ-TMT 유전자가 형질전환된 비타민 E 강화콩이 모품종인 Willams 82와 비교해 환경 지표생물종인 물벼룩에 미치는 영향 평가 결과 상대적 동등성을 보였으며, γ-TMT 유 전자와 PAT 유전자가 생성한 단백질들이 물벼룩에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.
GM 작물의 개발과 실용화 증가에 따른 환경위해성 평가 항 목 가운데 농업 환경 생물종에 대한 영향 평가 기준 확립과 이에 대한 안전성 입증의 필요성이 증대되고 있다. 국내에서 개발된 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 저항성을 가진 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 물벼룩 급성 독성 평가 시에 48시간-EC50 값이 4,429.13 mg/L (95% 신뢰한계는 3,908.13 ~ 5,020.36 mg/L)로 보고되었고(Oh et al., 2011), β-카로틴을 생 합성하는 비타민 A 강화벼의 물벼룩 급성 독성 평가에서 48시간-EC50 값은 3,311.40 mg/L (95% 신뢰한계 : 2,901.39 ~ 3,779.23 mg/L)로 보고하였다(Oh et al., 2012a). 그리고, 벼도 열과 벼흰잎마름병에 저항성을 나타내는 병저항성 GM벼의 물 벼룩 급성 독성 평가 시에 48시간-EC50 값이 3,147.18 mg/L (95% 신뢰한계는 1,194.47 ~ 6,916.50 mg/L)로 보고되었다(Oh et al., 2014a).
본 실험에서 비타민 E 강화콩의 물벼룩(Daphnia magna)에 대한 급성 독성 결과, 48시간-EC50은 2,416.20 mg/L (95% 신 뢰한계 : 1,219.73 ~ 4,152.23 mg/L)이었다. 이는 기존의 GM벼 에 대한 물벼룩의 48시간-EC50 값에 비해서 다소 높은 독성을 보이지만, Lee 등이 농약 및 중금속에 대한 물벼룩의 LC50와 EC50 값이 상당히 광범위하게 형성되어 물벼룩의 영향 평가 실 험 시 실험 장소 및 실험 방법 등의 차이가 있다는 보고(Lee et al., 2007)와 같이 시료와 사육 환경의 변수 등을 고려하여 독성 차이를 비교해야 할 것으로 사료된다.
Li 등은 이화명나방(Chilo suppressalis)과 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis) 에 저항성이 있는 Bt벼(Huahui 1)와 비형질전환 벼(모품종)의 포장 재배시에 논에서 서식하는 물 벼룩과 애기짚신벌레(Paramecium caudatum)의 생존과 번식률 을 평가한 결과 Bt벼(Minghui 63)가 비형질전환벼에 비해 증 가하며, 포장의 수서 생물상의 종 다양성과 개체수가 증가하 는 것으로 보고하였다(Li et al., 2014). 그러나, Thomas 등이 유럽조명충나방(Ostrinia nubilalis, European corn borer)에 저 항성을 가진 Cry1Ab 유전자가 발현하는 Bt 옥수수(MON810) 의 물벼룩 영향 평가에서 MON810과 비형질전환 옥수수(모품 종)의 시료 처리이후 5일차 내에서의 생존률의 차이는 보이지 는 않았으나, 42일간 장기간 영향 평가에서는 세대의 성숙기, 생활사, 산란수 등에 따라 차이가 있음을 보고하였다(Thomas et al., 2010). 본 실험에서도 환경생물 독성 시험기준과 방법( 농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 준한 실험 방법으로 48시간 급성 독성 평가를 수행하였으나, 비타민 E 강화콩의 비의도적 인 환경 방출에 의한 수환경(수로)에서의 PAT 단백질이 16주 (112일) 가량 지속되는 것으로 볼때 물벼룩의 평균 수명인 56 일을 기준으로 최소 2세대 이상에 대한 비타민 E 강화콩의 장기 영향 평가를 수행하여 비교 분석할 필요성 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 국내에서 개발된 비타민 E 강화콩의 농업환 경 생물종에 대한 영향 평가를 처음으로 시도하였으며, 그 결 과 비형질전환 Willams 82와 γ-TMT 유전자가 형질 전환된 비타민 E 강화콩이 경작지 주변 수로, 하천 등의 담수 생태계 에 방출되었을 때 환경 및 생물학적인 영향에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 앞으로 GM 작물의 환경 영향에 대한 보다 많은 정보를 얻기 위해서는 이러한 급성 독성 관련 동등성뿐 만 아니라 비타민 E 강화콩을 포함한 GM 작물에 대한 환경 위해성 평가요소 중 농업환경 생물종에 대해 세대 간의 생식 적인 변이와 유전적인 변화 등에 대한 장기 영향 평가 기술을 개발하고, 이를 바탕으로 관련 지침을 제공하는 등의 연구 개 발 노력이 필요할 것이다.
적 요
본 연구는 γ-TMT (γ-tocopherol methyltransferase) 유전자 와 제초제저항성 PAT 유전자가 도입된 비타민 E 강화콩의 도 입 유전자의 발현 분석과 수서 환경의 농업 환경 생물종인 물 벼룩에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행되었다. 비타민 E 강화콩에 γ-TMT와 PAT 유전자의 도입은 PCR로 확인하였고, PAT 단백질 발현량은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 확인하였으며, 비타민 E 강화콩에서 43.16±1.20 μg/g 이었다. 비의도적인 환경 방출 조건인 수로에서 비타민 E 강 화콩의 PAT 단백질은 16주까지 지속적으로 검출되었다. 비타 민 E 강화콩과 Willams 82의 물벼룩(Daphnia magna)에 대 한 급성 독성 시험 결과, 48시간-EC50는 Willams 82의 경우 2408.535 mg/L (95% 신뢰한계 : 1017.223 ~ 4626.616 mg/L) 였고, 비타민 E 강화콩은 2416.207 mg/L (95% 신뢰한계 : 1219.736 ~ 4152.232 mg/L)이었다. 따라서, 비타민 E 강화콩 또는 모품종인 Willams 82가 농업환경 생물종인 물벼룩에 미 치는 영향에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 향후, GM 작물 의 농업환경 영향 평가를 위해서는 지표 생물종의 발굴, 이를 이용한 장기 영향 평가 기술 개발, 관련 지침 개발 등을 위한 연구 개발 노력이 필요하다.
