리보스위치는 원하는 시점에 원하는 만큼의 유전자 발현 을 일으킬 수 있다는 점에서 새로운 가능성을 제시하고 있다. 리보스위치는 생합성 유전자 군 가운데 속도조절 단계에 속하 는 중요 유전자들에 골고루 분포되는 경우가 많기 때문이다. 대사물질을 검출하는 핵산 리보스위치의 경우 항체 개발에 비 하여 유전조작이 매우 간단하고 손쉬운 장점을 가지고 있다. 이러한 특징을 이용하면 대사물질에 결합하는 핵산을 이용하 여 특이적인 유전자 발현조절이 가능하다. 실례로 지금까지 개 발된 항생제 가운데 roseoflavin이나 pyrithiamine은 flavin mononucleotide(FMN) 또는 thiamine pyrophosphate(TPP) 리 보스위치에 결합하여 항생제 기능을 나타내고 있으므로 차세 대 항생제로서 이용이 가능하다(Blount et al., 2015).

최근 여러 미생물에서 발견된 리보스위치(riboswitch)는 유전 자 발현 항상성을 조절하는 미생물 전반의 중요한 조절기작으 로 알려지고 있다(Blount et al., 2015; Kazanov et al., 2007). 일종의 cis-acting element인 이 핵산서열은 특정 대사물 질에 강하게 결합할 수 있는데, 지금까지 여러 세균에서 발견 된 리보스위치는 18개 대사물질과 2개의 양이온에 결합하는 것 들이다. 흥미로운 점은 최근에는 여러 식물에서도 리보스위치 가 발견되었기 때문에 리보스위치가 진화적으로 종간에 연관 성이 높음을 암시하고 있다(Yadav et al., 2015).

2000년대 초반부터 본격화된 메타게놈 연구는 주로 library screening을 통한 신규 효소 유전자를 찾는 방향으로 많이 진 행되었다. 이후 차세대 염기서열 결정법(next-generation sequencing, NGS) 기법이 오믹스(omics)에 광범위하게 응용되 면서, 메타게놈 유전체에 대하여도 NGS 방법이 도입되어 연 구 기반이 구축되었다(Weinberg et al., 2010).

본 연구결과는 토착 생물체의 메타게놈으로 부터 리보스위 치 서열을 갖는 신규한 유전자를 발굴하고자 천일염 토양으로 부터 메타게놈의 NGS 서열 분석을 실시하였으며, TPP 결합 위치가 보존된 염기서열을 확보하여 대장균내에서 리보스위치 의 기능을 검정하였다. 본 연구 결과는 리보스위치의 조절 기 능 연구에 활용 가능하고 유전자의 발현 조절에 활용함으로써 유용한 단백질 발현을 원하는 때에 생산할 수 있는 기술로 의 미가 있다.

재료 및 방법

메타게놈의 DNA 분리와 유전체 서열 정보 수집

리보스위치 검색용 메타게놈의 DNA 분리와 메타게놈의 분 석을 위해 염전 지역(충남 태안)의 천일염 생산을 위한 최종 증발지에 있는 고염도의 토양을 채취 하였다. 토양 5 g을 PowerMax Soil DNA isolation kit(MOBIO, CA, USA)을 사용하여 사용방법에 따라 DNA를 정제하였다. DNA의 정제 효율을 증가시키기 위해, 인산 완충용액에 녹인 10 mg의 라이 소자임(lysozyme)을 첨가하고 37°C에서 50분간 진탕 배양 하 였다. 10 kb 이상의 고분자 DNA만을 선별적으로 분리 하기 위해서 2% polyvinylpyrrolidone을 포함한 젤을 사용하여 CHEF(Clamped Heterogeneous Electric Field, BioRad, USA) 를 16시간(6 V/cm, Ramping time; 2초 → 20초, 120°C, 0.5 x TBE, 14°C) 동안 전기영동 하였다. 이후, ethidium bromide로 젤을 염색한 뒤, 약 15~45 kb 크기의 DNA band 를 절취하여 0.5 x TBE 완충용액로 평행화된 반투막(10 kDa cutoff, Spectraphore)에 넣고 60 V에서 2시간 전기영동하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 함유하는 용액에 에탄올 을 첨가한 후, 원심분리하여 농축된 DNA를 얻었다. NGS(next generation sequencing)를 통한 천일염 메타게놈의 생명정보를 얻기 위하여 분리된 DNA의 정량·정성분석 후 메 타게놈 library를 구축하였다. 메타게놈의 염기서열은 454 GS FLX Titanium (Roche)을 이용하여 수집하였다.

리보스위치 TPP-box 중심 서열(seed sequence) 분석 및 선별

Kazanov 등에 의해 리보스위치의 중심서열이 알려졌다 (Kazanov et al., 2007; Weinberg et al., 2010). 이를 바탕으 로 비타민 B1의 리보스위치(TPP-box) 중심서열을 문헌 검색 을 통하여 100~200 bp 크기의 TPP-box motif를 가진 91개 중심서열을 확보하였다.

천일염 생산 지역에서 얻은 메타게놈의 염기서열에 대하여 local BLAST 데이타베이스를 제작하였다. 그 다음 이 데이터 베이스를 subject로 하여 리보스위치 중심서열을 FASTA 형태 로 하여 query를 순차적으로 BlastN 프로그램으로 일치 시켜 나갔다. BlastN의 cut-off e-value는 0.03 이하의 경우 유효하 다고 판단하였다. BlastN 알고리즘으로 non-redundant(nr) 데 이터베이스를 검색하고 결과가 나타나지 않을 경우, Gap-Blast 나 Psi-Blast를 이용하여 검색을 하였다. 공용 데이타베이스는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Rfam(http://rfam.sanger. ac.uk/), RibEx(http://132.248.32.45/cgi-bin/ribex.cgi), GeneBee (http://www.genebee.msu.su/services/rna2_reduced.html), NCBI COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/), ViennaRNA Web (http://rna.tbi.univie.ac.at/)을 활용하였다.

리보스위치 기능 검증을 위한 벡터 제작

상기 방식의 Rfam 데이터베이스와의 in silico 분석으로 보 존 서열로 검출된 D8PYI 510 bp 중에서 400 bp(111~510 bp) 부위를 유전자 합성과정을 통하여 확보하였다(IDT Co). 이 합성된 유전자에서 핵심 TPP T-box 부위를 기준으로 100 bp씩 별도의 길이로 확장하여 TPP T-box core 부위를 포 함한 100~400 bp 정도의 작은 fragment를 PCR 반응[95°C, 4min → (95°C, 1 min → 60°C, 20 sec → 72°C, 1 min) x 30 → 72°C, 5 min → 16°C, overnight)] 으로 증폭하고, 이 증폭 산물은 pGFP보다 적은 빛에서도 높은 형광을 나타내는 pGFPuv(Clontech USA) 벡터의 5’-MCS에 In-Fusion HD cloning kit(Clontech, USA)를 사용하여 클로닝 하였다.

D8PYI의 리보스위치로서의 기능을 생물검증으로 확인하기 위하여 pGFPuv 벡터를 재조합한 바이오센서를 구성하였다. D8PYI유래 100~400 bp 절편들은 각각 pLac 프로모터 아래 ribosome-binding site(RBS)가 없는 상태로 접합하고, 이들 절 편 다음에 위치한 GFP 리포터 유전자의 윗쪽에는 readingframe에 맞추어 새로이 RBS를 도입하였다(Fig. 2). TPP에 결 합하지 않은 경우에는 GFP 단백질 발현이 정상적으로 이루어 지다가 TPP에 결합할 경우 GFP 발현이 억제되어 형광반응이 감소하게 벡터를 구성하였다.

리보스위치 생물 기능검정

D8PYI 바이오센서 벡터는 Escherichia coli TOP10 균에 형질전환 하였다. 형질전환체는 TPP가 0~3 mM로 포함된 LB 액체 배지에서 균을 하룻밤 배양하여 이를 seed culture로 사용하였다. 충분히 성장한 균을 LB-ampicillin 배지에 약 100배 희석하여 초기 OD₆₀₀에서 0.05로 맞춘 뒤 1.5 시간 동 안 추가로 발현을 유도하였다. 바이오센서가 포함된 균을 희 석한 배지는 37°C에서 교반 하여 키우면서 20분 단위로 1.0 mL 시료를 채취하여 OD₆₀₀을 측정하고 세포를 수집하였다. HN 완충용액(10 mM HEPES, pH 8.0, 50 mM NaCl)로 세 포를 세척하고 다시 현탁하여 plate reader(PerkinElmer)를 통 해 485 nm/535 nm에서 발현되는 GFP 총량을 측정하였다. 이 값을 각 시료의 단위 OD₆₀₀로 나누어 세포 평균당 발현한 GFP 양을 서로 비교하였다. 이후 균을 동일량 LB 고체 배지 에 도말하여 ImageQuant LAS-4000(GE Healthcare Co.)로 GFP의 발현을 검출하였다.

결과 및 고찰

천일염 토양 미생물 메타게놈 염기서열 확보

지금까지 미생물을 중심으로 18개 주요 기능성 물질 결합 리보스위치가 발견되어 있지만, 그 가운데 식물을 포함하여 가 장 폭넓은 종에서 발견되는 것은 비타민 B1 리보스위치(TPPriboswitch) 1종류만 보고되어 있다 (Bocobza et al., 2007; Yadav et al., 2015). 하지만, 기존의 연구에서 환경 메타게놈 의 염기서열을 스캔한 결과, 이들 메타게놈에서도 비타민 B1 리보스위치 서열이 존재할 가능성이 보고되었다(Kazanov et al., 2007).

이러한 가능성을 확인하기 위하여 국내 고유 메타게놈을 선 택하여 이로부터 비타민 B1 리보스위치를 선발하고자 하였다. 신규 리보스위치 서열을 찾기 위하여 천일염 토양에서 분리한 미생물 메타게놈 DNA를 454-GS FLX 기종을 이용하여 염기 서열 정보를 대량 수집하였다. 천일염 토양으로부터 총 44,740 개의 read 갯수를 확보 하였으며, 16,730,645 bp의 총 염기서 열 정보량을 확보하였다. 또한 염기서열 길이를 결정하는 효 소 반응 정도를 나타내는 Base/Read 비율 값은 374 bp 였다. 전체 read에 대해 1.6%인 708개가 assembly되었다. Assembly된 read를 가지고 344개의 contig를 만들었으며, 가 장 긴 contig 크기는 1,404 bp 였다. 이는 98.4%의 NGS 염 기서열은 평균 약 374 bp정도의 개별 서열로 존재하고 어떤 De Novo assembly에도 이용되지 못하였다는 것을 보여준다. 이는 평균 약 2~3개 read가 assembly 된 것을 의미한다 (Table 1).

비타민 B1 리보스위치 선별

2003년 세균에서 라이신 생합성 유전자 RNA에 아미노산이 직접 결합하는 것이 관찰된 이후(Sudarsan et al., 2003), 대 사물질에 대한 특이결합에 관련된 중요 리보스위치 서열 motif 는 세균, 고세균, 곰팡이에서 매우 잘 보존 되어 있고, 폭 넓 게 분포 되어 있음이 알려져 있다(Sudarsan et al., 2005). 본 연구에서는 기존에 알려진 이들 motif 서열을 사용하여 메타 게놈에서 새로운 리보스위치 염기서열을 검출하고자 하였다.

이를 위해, 확보한 천일염 토양 메타게놈 유래 344개 contig를 가지고 리보스위치 motif의 검색을 수행하였다. 메타 게놈에 존재하는 비타민 B1 리보스위치는 일차원적 염기서열 유사성 검사(BLAST homolgy 검색), 이차원적 RNA 2차 구 조 비교의 두 단계를 순차적으로 수행하여 선발하였다. BLAST homology 검색을 위하여 천일염 토양 메타게놈 염기 서열에 대하여 local BLAST 데이타베이스를 제작하였고 이로 부터 알려진 비타민 B1에 존재하는 TPP-box를 검색하였다. 그 결과, 비타민 B1에 해당하는 TPP-box에 해당하는 contig 는 총 14개가 검출되었다. 이 가운데 TPP-box 부위와 유사한 것으로 가장 많이 검출된 메타게놈의 contig는 D8PYI로 총 9 번에 걸쳐서 seed 들과 유사성을 보였다. Match 된 부위는 24~30 bp이었으며, E-value도 3e-007에서 9e-004로 염기서열 상 기존에 알려진 리보스위치 motif들과 높은 통계적인 유의 성을 보였다(Table 2).

선발된 비타민 B1 리보스위치의 구조적 특성 분석

리보스위치는 poly-cistron의 5'-UTR 부위에 약 500nt 크기 로 존재하며, 저분자 기능성 대사산물에 직접 결합하는 부위 의 크기는 100nt 이하로 실제 대사물질은 DNA 염기서열에 결합하는 것이라기보다는 DNA에서 전사(transcription)된 RNA 의 2차 구조에 결합하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 리보 스위치는 DNA 염기서열과 더불어 RNA 2차 구조에서도 특 이적인 압타머(aptamer) element 형태를 보이고 있다(Nudler, 2006).

Blast로 검출된 TPP-box candidate 5개 D8PYI, C32EW, EUQFG, C4R1D, C9S2K를 사용하여 이 contig에서 알려진 리보스위치 압타머 element들이 존재하는지 RibEx 데이터베 이스를 통하여 DNA 서열이 RNA 서열로 바뀌었을 때에도 리보스위치의 특성을 가지는지 검색하였다. 그 결과, D8PYI에 서 비타민 B1 리보스위치에 보편적으로 알려진 THI-element 부위를 확인할 수 있었다(E-value=5.0e-13). 반면 다른 4개 contig에서는 해당 리보스위치의 압타머 element가 검색되지 않았다(Table 2).

TPP-box seed sequence들이 가지고 있는 1차 염기서열의 구조적인 유사성과 더불어 메타게놈에서 검출된 TPP-box candidate 5개 D8PYI, C32EW, EUQFG, C4R1D, C9S2K에 대하여 2차 RNA 구조를 비교하여 보았다. 2차 구조를 만들 때의 minimum free energy를 가진 pattern을 서로 비교하였 다. D8PYI contig 336~365 bp 부위 위치한 THI-element를 전후하여 RNA 2차 염기서열의 구조적인 특징과 압타머의 구 조적 특징을 비교하기 위하여 가상의 RNA 2차 구조를 검색 하였다. 그 결과, D8PYI contig는 염기서열 상 TPP-box의 압타머 구조와 유사한 RNA 2차 구조를 형성하였다(Fig. 1). 반면, 나머지 4개 리보스위치 candidate에서는 THI-element 주위에 전형적인 TPP-box의 압타머 구조의 특징을 나타내지 않았다(data not shown).

리보스위치 D8PYI의 기능 검정용 벡터 구축

리보스위치는 in vitro 시스템에서도 대사물질과의 결합을 만 들 수 있을 뿐만 아니라, in vivo 상태에서도 대사물질과의 특 이적인 결합을 유도 할 수 있다. 즉, 식물에 대한 최초의 리 보스위치 응용으로 담배 엽록체에서 합성 리보스위치를 발현 하면 단백질 발현이 조절됨이 확인되었다(Verhounig, 2010). 여러 병원균들의 유전체 서열에서 다수의 drug-target이 될 수 있는 리보스위치가 존재하기 때문에, 항생제 저항성 인체 병 원균들에 대한 차세대 항생제를 개발하기 위하여 리보스위치 를 drug-target으로 할 수 있음을 보고하였다(Penchovsky and Stoilova, 2013). 그 외에 theophylline-binding adaptor를 합성 리보스위치로 이용하여 대장균에서의 리보스위치 작동을 확인 한 보고도 있다(Jo and Shin, 2009). 이런 기존 연구를 바탕 으로 하여 새로 메타게놈에서 선발한 리보스위치의 기능을 대 장균을 이용하여 in vivo 상태에서 확인 해 보았다.

D8PYI의 염기서열 상 리보스위치의 기능을 실제로 확인하 기 위하여, 먼저 비타민 B1 리보스위치의 candidate로 검출된 부위를 중심으로 하여 약 100 bp 길이의 단편을 사용하여 기 능 검정용 바이오센서 벡터를 구성하였다. 메타게놈에서 de novo assembly 된 contig D8PYI 염기서열 정보에서 TPPbox와 유사성을 보인 111~510 bp 부위를 DNA로 유전자 합 성하였다. 이 합성 유전자를 사용하여 타깃부위를 PCR로 각 106 bp, 204 bp, 300 bp와 396 bp 증폭하였다(Table 3).

증폭한 PCR 산물은 green fluorescent protein(GFP)를 marker를 가진 벡터에 directional 클로닝 하였다. 반면, 이렇게 구성된 벡터는 리보좀 결합위치(Ribosome-binding site, RBS) 가 D8PYI upstream에 존재하여 리보좀이 RBS에 먼저 결합 할 경우, TPP에의 결합에 대한 동역학적 속도(kinetics)가 감 소할 가능성이 있었다. 그러므로 구성된 바이오센서에서 GFP 의 발현이 이루어지기 전에 TPP가 D8PYI 리보스위치에 결합 하여 RBS 서열을 masking 함으로서 생길 수 있는 leaking 현상을 극복하기 위하여 D8PYI 리보스위치를 RBS upstream 에 위치시키도록 재설계하였다. 이를 위해 pGFPuv 벡터에 있 는 Lac promoter의 RBS을 제거하고 GFP reporter gene의 위치를 변형시키기 위해, 설계한 모식도에 따라 제한효소에 맞 추어 각각의 증폭산물을 클로닝 함으로서 변형된 벡터를 완성 하였다. 이 변형된 pGFPuv 벡터에 새로운 downstream RBS 을 갖는 D8PYI을 ligation하여 DH5α에 형질 전환한 후, 클 로닝 여부를 확인하였다. 클로닝이 완료된 벡터는 E. coli TOP10 (Invitrogen)에 형질전환 시켰다. 이 균은 E. coli DH5α와 달리 유전형질이 thi+ 이므로, TPP를 제한 영양소로 이용하면 변화된 GFP 발현을 검출할 수 있다(Fig. 2).

리보스위치 D8PYI의 기능 확인

바이오센서에 클로닝한 절편의 염기서열을 확인한 후, 바이 오센서 벡터들이 세포 내에서 리보스위치로서 활성을 가지는 지 검증하였다. 이를 위해, 형질전환된 TOP10 균을 리보스위 치의 결합 물질인 TPP가 포함된 LB 고체 배지에서 배양하면 서 바이오센서 벡터에 있는 GFP의 발현을 검출하여 리보스위 치의 기능을 검정하였다.

음성 대조군으로 GFP 유전자가 없는 pUC118 벡터만 형질 전환된 균과 리보스위치가 없는 pGFPuv 벡터만 형질전환된 균의 경우에는 TPP의 존재와는 무관하게 GFP를 발현하거나 (양성 대조군) 또는 전혀 발현하지 않았다(음성 대조군). 반면, D8PYI의 단편을 삽입한 경우에는 TPP가 존재하면 전반적으 로 GFP의 발현이 감소하였다. 이는 선발한 D8PYI 절편이 대 장균에서 mRNA로 전사된 이후, TPP에 결합하는 특성을 가 진 것을 보여주고 있다(data not shown).

발현 감소의 정도는 삽입한 리보스위치 후보의 크기와는 큰 연관 관계를 보이지 않았다. 또한 전반적으로 낮은 수준의 GFP 발현이 TPP가 존재하는 배지에서 나타났다. 이는 클로닝 한 리보스위치 candidate에서 약간의 leaking 현상이 발생한다 는 것을 의미하고, 전사된 mRNA 가운데 TPP와 결합하지 않 는 것이 존재할 가능성을 보여주고 있다. 비교군에 비하여 D8PYI의 절편이 삽입된 TOP10균에서 TPP가 존재하는 배지 에서 전반적으로 더 낮은 fluorescence를 나타내는 것을 확인 할 수 있었는데, 이는 TPP에 의해 transcription된 mRNA에서 RBS가 영향을 받아 GFP의 발현이 저해 되고 있음을 보여주 는 것이다.

또한, 바이오센서를 통해 단위시간별 세포 당 GFP의 발현 양을 정량적으로 모니터하기 위해, 액체 상태에서 배지에 포 함된 TPP에 대한 GFP 발현을 확인하였다. 바이오센서가 포 함된 균을 희석한 후, 37°C에서 진탕배양 하면서 20분 단위로 시료를 채취하여 배지성분을 제거한 균에서 발현되는 GFP 총 량을 측정하였다. 이 값을 각 시료의 단위 OD₆₀₀로 나누어 세 포 평균당 발현한 GFP 양을 서로 비교하였다. TPP가 없는 배지에서 induction한 TOP10균에 비해 TPP의 농도가 높아질 수록, 170분 이후에서의 기울기 값과 특히 exponential phase 에서의 세포 당 GFP의 발현양이 다소 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 TPP에 의해 전사된 D8PYI의 mRNA가 Stem-Loop structure를 형성하여 RBS을 masking함에 따라, D8PYI-GFP mRNA중의 일부가 번역 과정에서 영향을 받고 있다는 것을 보여준다(Fig. 3).

위와 같이 고체 배지가 아닌 액체 배지에서 살펴본 결과, 고체 배지에서의 경우와 동일하게 D8PYI 리보스위치가 삽입 된 경우에는 GFP 발현이 단위세포 당 감소하였지만, 일정부 분은 계속적으로 기저 수준으로 발현된다는 것을 발견하였다. 이 경우, GFP 발현 감소 상태는 전체 세포들이 stationary 단 계에 도달하여도 감소된 상태로 남았다. 이상의 결과는 D8PYI 가 TPP에 반응하는 리보스위치임을 보여주지만, 바이오센서에 서는 transcription 이후 단백질 합성 단계에서 TPP 결합 부위 를 건너뛰고서 translation이 이루어진다는 점을 암시하였다.

리보스위치 D8PYI의 활용

일종의 cis-acting element 인 비타민 B1 TPP 리보스위치 는 특히 종간 연관성이 높다고 알려져 있는데, 세균에서 고등 생물로 수평적 유전물질 전달(horizontal gene transfer) 되었거 나, 세균과 고등생물의 공통 조상에서부터 유래되었다고 추정 되고 있다(Yadav et al., 2015). 진화적으로도 리보스위치가 유 전자 조절에 중요한 역할을 수행해 왔음을 알 수 있다. 그 증 거로 여러 copy의 리보스위치가 하나의 유전체 안에 존재하여 세균의 경우 전체 유전자 중 3% 이상이 리보스위치의 조절을 받는 등 보편적인 유전자 조절 메커니즘으로 인정되었다 (D'Arrigo et al., 2016). 따라서 리보스위치는 유전자 발현 조 절에 유용한 소재라고 할 수 있다. 현재 국내에서는 리보스위 치의 압타머 실용화 연구가 많이 진행되고 있다(Cho et al., 2011; Kim et al., 2011; Kwon and Kim, 2006; Park et al., 2011). 본 연구결과는 D8PYI의 heterologous expression 을 통한 대사물질의 feedback 억제하여 비타민 B1 산물을 증 진하는 연구로 추후 확장할 수 있다.

적 요

본 연구에서는 리보스위치 서열 확보와 기능검정을 위하여 천일염 생산을 위한 최종 증발지에 있는 고염도의 토양을 채 취 하여 메타게놈의 염기서열을 수집하였다. 비타민 B1의 리 보스위치(TPP-box) 중심서열을 문헌 검색을 통하여 TPP-box motif를 가진 91개 중심서열을 확보하였으며 D8PYI의 리보스 위치로서의 기능을 생물검증으로 확인하기 위하여 pGFPuv 벡 터를 재조합한 바이오센서를 구성하였다. D8PYI유래 절편들 은 각각 pLac 프로모터 아래 위치한 GFP 리포터 유전자의 발현되는 총량을 측정하여 리보스위치 서열의 기능을 구명하 였다. 이러한 연구는 국내·외 모두 기초 정보가 될 수 있는 리보스위치의 조절 메커니즘이나 식물에서의 탐색이 매우 제 한적으로 이루어져 있고, 환경에 존재하는 막대한 미탐색 미 생물 메타게놈에 대한 리보스위치 탐색과 기능연구 등에 활용 될 수 있을 것으로 기대한다.