포도나무 탄저병(Colletotrichum spp.)은 6월 초부터 7월 중순까지 강우에 의해 월동한 전염원으로부터 일반 감염이 많 아지며, 성숙기에 강우량이 많으면 2차 감염으로 인하여 심하 게 발병하게 된다. 병징은 주로 과실에서 출현하나 포도나무의 화수나 잎에서 발병하는 경우도 있으며, 과실의 경우 어린 과 실에서 발병하면 작고 검은 병반의 상태로 나타난다. 성숙기의 과실에서는 잠복기간은 3~4일 정도로 부패형 병반이 발생하며 병반이 확대되면 과피에 주름이 생기고 미이라과실이 된다 (Daykin & Miholland, 1984; Lee, 1987).

Arx(1957)는 탄저병의 병원균으로 Glomerella cingulate(불완 전세대: Colletotrichum gloeosporioides)를 보고하였으며, 국내 에서도 C. gloeosporioides와 C. acutatum에 의해서 포도나무 탄저병이 발생된다고 보고되어 있다(Hong et al., 2008; Jang, 2011). 포도나무 탄저병의 방제방법으로는 비가림시설 설치, 봉 지 씌우기(Nam et al., 1996; Moon et al., 2008)를 통하여 병원균의 전파 방지 방법과 약제 살포 방법(Kim et al., 2001) 등이 있으나 대부분의 포도 재배 농가에서는 농약살포에 의한 화학적 방제에 의존하여 농약의 사용이 문제되고 있다(Cha et al., 2000).

화학 비료와 농약의 사용량에 크게 의존하는 농업은 생산량 의 증가를 가져오지만, 과다사용으로 인한 농약 잔류, 토양의 황폐화, 생태계의 파괴 등과 같은 문제를 야기하였다. 이러한 문제들을 해결하기 위해 생태계에 해가 적고, 안정적으로 병 해충을 방제할 수 있는 생물농약의 개발에 관한 연구가 진행 되고 있다. 동물과 식물, 미생물, 특정 미네랄 등으로부터 생 물농약으로 700종류 이상의 사용 가능한 활성 성분이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 식물에서 항균 또는 제충, 제초와 같은 효과를 가지는 성분은 주로 식물의 2차 대사산물로 대 부분 페놀류, 알칼로이드 계통, essential oils, terpenoids, phytoalexin, allelochemicals 등이 해당한다(Hajek, 2003; Cho & Shin, 2004; Kim, 2005). 식물의 2차 대사산물을 이용하여 제충효과(Lim et al., 2007; Park et al., 2008; Lee et al., 2009; Hwang et al., 2009; Yun et al., 2012; Choi et al., 2013)와 제초효과(Kim & Kim, 2005; Kim & Lee, 2007; Lim et al., 2007; Kim & Jang, 2009; Yun et al., 2012; Kim et al., 2014), 식물성 병원균에 대한 항균활성 검정(Doh, 1997; Ryu et al., 2001; Kim et al., 2001; Cho & Shin, 2004; Kim & Kim, 2005; Park et al., 2005; Choi et al., 2006; Kim & Lee, 2007; Kwon et al., 2010; Yoon et al., 2011; Song et al., 2012; Islam et al., 2014)에 관련된 연구 들이 보고되어 있다.

포도는 크게 미국종, 유럽종, 교잡종으로 구분되며 미국종 포도는 유럽종 포도에 비해 환경 적응성이 강하고 내병성 특 성이 있어서 여름철 강우가 많은우리나라에 재배하기 적합하 여 국내에서는 주로 미국종인 ‘캠벨얼리’와 교잡종 4배체인 ‘ 거봉’ 품종이 재배되고 있다. 미국계 포도의 과실의 품질은 유 럽종에 비해 다소 미흡하여 최근에는 ‘톰슨씨들레스’, ‘샤인마 스캇’ 등의 유럽종 포도에 대한 수요와 재배가 증가하고 있으 나, 내병성이 약하여 포도 탄저병을 비롯한 병해의 발생이 증 가할 것으로 여겨지며 탄저병을 비롯한 병해 발생을 억제할 수 있는 효과적인 방제 시스템의 개발이 요구된다.

따라서, 본 연구에서는 국내에서 자생하는 약용식물 중에서 항균활성 등의 효과가 있는 것으로 보고된 개똥쑥(Kim et al., 2001), 맨드라미(Kim, 2012), 질경이(Jeon et al., 1998) 등 7 종의 식물체로부터 포도나무 탄저병균(Colletotrichum spp.)에 대하여 항균활성을 나타내는 약용식물을 탐색하고 유럽종 포 도나무 식물체에 처리하여 탄저병 방제를 위한 천연물농약 소 재 개발의 가능성을 검토하고자 하였다.

재료 및 방법

식물 재료

경상북도 경산시 영남대학교 생명응용과학대학 부속농장 온 실에서 개똥쑥(Artemisia annua L.), 맨드라미(Celosia cristata L.), 질경이(Plantago major var. japonica M.), 여주(Momordica charntia L.), 상사화(Lycoris squamigera MAX.), 초석잠 (Stachys sieboldii Miq.)을 2015년 봄부터 재배하여 시기별로 채취하여 사용하였으며, 시험에 사용된 종자는 2015년 4월에 대구시 약령시의 약제상으로부터 구입하였다. 복숭아나무 (Prunus persica L.) 수지는 경산시 점촌동에 위치한 복숭아 과원에서 채집하여 건조한 뒤 분말로 제조하여 사용하였다.

식물체 추출 준비

Table 1에서와 같이 공시한 식물을 잎, 줄기, 꽃, 열매, 종자 등의 부위별로 구분하여 채취하였다. 잎과 줄기는 최 상의 생장기에, 꽃은 개화기에, 열매와 종자는 성숙기에 채 취하여 물로 세척하고 상온에서 건조시킨 다음 분쇄기로 분 쇄하였다. 분쇄된 식물체를 에탄올과 에틸아세테이트를 이 용하여 상온에서 진탕하여 추출하고, 추출액을 회전감압농 축(Tokyo Rikakikai Co., Ltd)를 이용하여 농축 한 후 4°C에 보관하여 사용하였다. 조추출액을 에탄올 또는 에틸 아세테이트, 물에 희석하여 검정에 사용하였다. 복숭아나무 수지는 Gupta et al.(2010)의 추출방법에 따라 건조시킨 후 분쇄한 수지를 시료를 기준으로 10배량의 여러 용매(아세 톤, 에탄올, 에틸아세테이트, 톨루엔)로 교반기를 이용하여 24시간 동안 추출하고 농축하여 10배의 액이 되도록 조정 하여 4°C에 보관하여 사용하였다.

병원균

포도나무 탄저병균인 식물병원성 균주인 Colletotricum acutatum 569와 C. gloeosporioides 614를 국립농업과학원으 로부터 분양 받아 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 에 배양하여 4°C에 보관하면서 사용하였다.

약용식물 추출물의 포도나무 탄저병균에 대한 항균활성 검사

약용식물 추출물의 항균활성을 조사하기 위해서 Souza et al. (2005)의 실험방법을 적용하였다. 감자한천배지(PDA)에서 5일 간 균을 배양한 다음 균총을 잘라서 액체배지(potato dextrose broth, PDB)에서 5일간 배양하고 균질기를 이용해서 마쇄한 다음 감자한천배지와 혼합하여 petri dish에 붓고 굳혔다. 식물 체의 에틸아세테이트와 에탄올 추출물을 식물체 시료를 기준 으로 2 mg/mL의 농도로 조절하여 멸균된 디스크(Whatman No.1 φ8 mm)에 50 μl를 처리하고 멸균벤치에서 건조시켰다. 건조된 디스크를 배지에 치상한 후 암상태의 인큐베이터(28°C) 에서 5일간 정치배양하였다. 무처리 대조구로는 용매를 동량 으로 처리한 후 건조시킨 디스크를 치상하였다. 항균활성 측 정은 24시간 간격으로 관측하고 나타나는 억제환을 측정하였 다. 각각 3반복으로 진행하였다.

약용식물 추출물의 포도나무 탄저병 발생 억제 검정

약용식물 추출물의 포도나무 탄저병 발생 억제를 검정하기 위해서 ‘Thompson seedless’와 ‘Blanc seedless’ 품종의 포도 나무 잎을 이용하였다. 접종에 사용하기 위해서 C. acutatum 과 C. gloeosporioides를 PDA에서 16시간의 광조건과 8시간 의 암조건으로 조절하여 형광등을 교호로 조사하면서 28°C에 서 5일간 배양하여 포자형성을 유도하여 멸균수로 모으고 균 사를 제거한 다음 혈구계측기를 이용하여 10⁶ spores/mL로 농 도를 조절하였다. 선별한 식물체의 에틸아세테이트와 에탄올 추출물의 농축액(1 g/ml)을 배지상에서의 균체 생장을 억제하 는 농도인 500배로 희석하여 포도나무 잎에 처리하고 24시간 동안 상온에 건조시킨 후에 병원균을 접종하였다. 포도나무 잎 에서 상처와 무상처 조건으로 구분하여 진행하였다. 피펫을 사 용하여 포자현탁액을 30 μl씩 점적하여 접종하고, 다른 처리구 로서는 균사체 배지(φ5 mm)를 접종하였다. 접종 후 플라스틱 용기에 담아 28°C 항온기에서 5일간 배양한 후 발생한 병반 의 크기를 측정하였다.

통계분석

실험처리는 3반복으로 수행하였으며, 처리구는 완전임의 배치법으로 배치하여 각 실험의 결과에 대하여 평균치와 표 준오차를 구하고 SAS(Statistical Analysis System, V.6.12, USA) 프로그램을 이용하여 Duncan’s multiple range test 법에 의해 평균값간의 차이를 검정하였으며 유의수준은 5% 로 하였다.

결과 및 고찰

약용식물 추출물의 포도나무 탄저병균에 대한 항균활성

개똥쑥 지상부, 맨드라미 꽃, 여주의 미성숙과, 초석잠의 뿌 리, 상사화의 꽃, 질경이 꽃과 종자, 복숭아 나무의 수지 추출 물을 이용하여 C. acutatum에 대한 항진균활성을 조사하였다 (Table 1과 Fig. 1). 개똥쑥의 지상부 추출물에서는 직경 11 mm의 생장 억제존이 관측되었으며, 맨드라미 꽃 추출물에 서는 10 mm, 질경이 꽃에서는 15 mm의 생장억제존이 형성되 어 항균활성을 나타내었다. 복숭아나무 수지의 에탄올 추출물 에서는 16.7 mm, 톨루엔과 에틸아세테이트 추출물에서는 9mm의 생장 억제존이 나타났으며 각각 72시간 동안 항균활 성을 유지하는 것을 확인하였다. 다른 추출물에서는 항균활성 이 관측되지 않았다. C. acutatum에 대해 항균활성을 나타내 는 식물추출물은 C. gloeosporioides에 대한 항균활성은 나타 나지 않았다.

추출물에 의한 탄저병 발생 억제 효과

C. acutatum에 대해 항균활성을 나타내는 식물체 추출물을 포도나무 잎에 처리한 후 잎에서의 탄저병 발병에 대한 억제 효과를 조사하였다. 선별한 식물추출물을 500배 희석하여 ‘Thompson seedless’ 와 ‘Blanc seedless’ 포도나무잎에 분무 한 다음 실온에 두었다가 접종하여 5일 후에 병반의 발생 및 크기를 측정하였다.

포도나무 잎에 추출물을 처리한 후 C. acutatum를 접종했을 때 두 품종의 병반의 형성과 병반크기를 확인하고(Fig. 2), 각 처리구의 방제가를 조사하였다(Table 2). ‘Thompson seedless’ 포도품종에서 상처 접종을 통해 포자 현탁액을 접종한 결과, 개똥쑥, 맨드라미 꽃, 맨드라미 잎의 추출물 처리구에서 78% 가 억제되었고, 질경이 꽃 추출물 처리에서는 71%가 억제되 었다. 포자 현탁액을 접종한 ‘Blanc seedless’ 포도 품종에서는 개똥쑥 추출물 처리구에서 61.5%의 방제효과를 나타내었으 나, 균체를 접종한 경우에는 억제효과가 나타나지 않았다. 맨 드라미 꽃과 맨드라미 잎 추출물 처리에 의해 58.3%, 질경이 꽃 추출물 처리에서는 19.2%의 억제효과가 나타났다. 복숭아 나무 수지 추출물의 처리구에서는 포자 현탁액을 접종한 경우 에는 방제효과가 나타나지 않았으나, 균체 접종에서는 55%의 억제효과가 나타났다.

식물체의 추출물을 처리한 후 C. gloeosporioides를 접종한 포도나무 잎에서 탄저병 발생 억제효과를 조사하였다(Fig. 3과 Table 3). 상처를 가한 후 균체를 접종한 포도나무 잎에서는 모든 식물체 추출물이 병발생을 억제하였다. ‘Thompson seedless’ 포도 품종에서는 복숭아나무 수지 추출물과 맨드라 미 잎 추출물을 처리한 포도나무 잎에서 각각 64.8%와 55.6%의 억제 효과가 나타났으며, ‘Blanc seedless’ 포도 품종 에서는 맨드라미 꽃과 맨드라미 잎 추출물을 처리한 잎에서 각각 60.8%와 76.5%의 억제를 확인하였다.

포자현탁액을 접종한 ‘Thompson seedless’ 포도나무 잎에서 는 개똥쑥, 복숭아 수지 추출물을 처리하여도 병발생 억제 효 과가 나타나지 않았으나, 맨드라미 잎, 맨드라미 꽃, 질경이 꽃 추출물을 처리하면 각각 25%, 18.8%, 18.8%의 억제효과를 나타내었다.

포자현탁액을 접종한 ‘Blanc seedless’ 포도나무 잎에서는 모든 식물체 추출물이 억제효과를 나타내었으며, 개똥쑥과 맨 드라미 꽃의 추출물을 처리하면 61.5%, 질경이 꽃 추출물 처 리에서는 57.7%, 복숭아 나무 수지 추출물 처리에서는 27%, 맨드라미 잎 추출물 처리에서는 23.1%의 억제효과를 나타내 었다.

국내에서는 포도나무 탄저병 방제를 위해 방제 적기 판정을 위한 예찰에 관한 연구(Park et al., 1992; Yun & Park, 1990)와 약제 방제 등에 대한 연구가 보고되어 있다(Kim, 1996; Kim et al., 2001; Suh et al., 1982). 그러나, 포도나무 탄저 병을 방제하고자 살균제를 살포하는 화학적 방제는 농약의 다 량 살포로 인해 환경오염, 인축독성 등의 부작용 뿐만 아니라 약제 내성인 균의 출현을 야기하여 방제에 더 큰 어려움을 겪 고 있는 실정이다(Fukaya, 2002; Fukaya et al., 1998; Sonoda & Pelosi, 1988). 따라서 이러한 문제를 극복할 방안으로 친환 경 제제의 개발을 위한 식물체 추출물을 개발하고자 하는 연 구가 진행되고 있다.

식물체 추출물을 이용하여 고추에 발생하는 탄저병에 항균 활성과 관련한 연구 결과가 보고되어 있으나(Choi et al., 2006; Lim et al., 2007; Ko et al., 2009; Song et al., 2012), 포도나무에서 발생하는 탄저병에 대해서는 연구는 거 의 없는 상황이다. 본 연구에서는 약용식물의 추출물을 이용 하여 포도나무 탄저병균에 대하여 배지상에서의 항균활성을 조사한 결과, 공시한 식물체의 추출물 중에서 개똥쑥, 맨드라 미, 질경이 꽃, 복숭아 나무 수지 에탄올 추출물이 C. acutaum에 대해 항균활성을 나타내었다(Table 1). 식물체 추출 물을 처리한 포도나무 잎에서 탄저병 발생 또는 병반 발달을 억제하였다(Table 2와 3). 또한, 포도 품종에 따라 접종한 병 원균에 따른 병발생의 차이가 있었는데 이는 균주와 식물체간 의 친화성 차이에 의한 것으로 여겨지며(Song et al., 2012), 병원균을 접종하기 전에 처리한 각각의 식물추출물들에 대한 각 균주의 감수성에 의한 영향으로도 판단된다.

또한, 배지상에서는 C. gloeosporioides 병원균의 균사생장을 억제하는 효과가 없는 것으로 나타난 맨드라미잎, 질경이꽃, 개똥쑥, 맨드라미잎의 추출물이 포자 현탁액을 접종한 포도나 무잎에서 병반의 발생을 억제하였다. 이는 처리한 추출물이 병 원균의 포자발아와 균사 생장을 직접적으로 억제하지는 않지 만 기존의 연구 보고(Ahn et al., 2014; Islam et al., 2014a; 2014b)의 와 같이 식물체의 유기용매 추출물이 포도나무잎에 서 병원균에 대한 방어반응을 유도함으로써 나타난 효과로 사 료되며 이에 대한 추후 연구가 필요할 것으로 여겨진다.

본 연구에서 사용된 개똥쑥은 식물병원균인 Aspergillus nidulans, Fusarium oxysporum, Alternaria mali등에 항균활성 이 있는 것으로 보고되어있다(Kim et al., 2001). 또한, 맨드 라미는 식품 유해균에 대한 항균효과(Kim, 2012)와 식물 병원 성 바이러스인Pepper mild mottle virus(PMMoV)을 발생을 억제하는 것으로 보고되어 있으나(Jung, 2006), 식물병원성 세 균이나 진균에 대한 항균활성 연구는 거의 없는 상태이다. 질 경이는 식품 유해균에 대한 항균활성이 있는 것으로 보고되어 있으나(Lee et al., 1998), 질경이 꽃, 복숭아 나무의 수지의 진균에 대한 항균활성에 관한 연구는 많지 않은 상태이며, 특 히, 식물병원균에 대한 항균활성과 관련한 연구보고는 없는 상 태이다. 본 실험을 통하여 개똥쑥과 맨드라미, 복숭아 나무의 수지와 질경이 꽃이 포도나무 탄저병에 대하여 항균활성을 나 타내는 결과를 얻었다. 따라서, 각 추출물의 항균활성을 나타 내는 활성 물질을 탐색하고 순화하는 추가적인 연구가 필요하 며, 포장에서의 효과 검정 등의 시험을 통하여 천연물 농약의 소재로서 개발이 가능할 것으로 사료된다.

적 요

항산화활성 또는 항균활성을 나타내는 7종의 약용식물을 이 용하여 포도나무 탄저병에 대한 항균활성을 조사하였다.

C. gloeosporioides의 균체를 접종한 ‘Blanc seedless’ 포도 나무 잎에서는 26-64.8%, ‘Thompson seedless’ 잎에서는 25.5-76.5%의 억제를 확인하였으며, C. gloeosporioides의 포자 현탁액 접종한 ‘Blanc seedless’에서 23.1-61.5%, ‘Thompson seedless’에서 18.8-25%의 억제 효과를 확인하였다.

본 연구에서는 공시 약용식물 추출물이 포도나무 탄저병균 에 항균활성을 나타내며 추출물은 탄저병 방제를 위한 친환경 방제를 위한 약제 개발에 활용될 수 있을 것이다.