서 언

농약은 농작물의 재배 및 저장 중에 발생하는 잡초, 균, 곤 충, 응애, 선충, 바이러스 및 기타 병충해들을 방제하기 위해 사용되어 왔으며 노동력 절감 및 농업생산성·품질을 향상시키 는데 큰 기여를 해왔다. 국내 농약 총사용량은 2015년을 기준 으로 약 19,482톤이고, 헥타르 당 사용량은 약 11.6 kg으로 추 산되고 있다1)

농약들 중 주로 해충구제의 목적으로 시판되고 있는 유기인 계는 현재 유통되고 있는 농약들 중에서 가장 많이 사용되고 있고, 강한 살충력과 적용해충 범위가 넓다는 장점이 있다 (Kushwaha et al., 2016).

하지만 유기인계 살충제는 곤충에 대해 매우 높은 독성을 나 타내고, 주된 작용기작은 시냅스의 신경전달물질인 아세틸콜린 (acetylcholine)을 활성화 시키는 아세틸콜린 에스테라아제 (acetylcholine esterase)의 기능을 억제하여 곤충의 신경전달 (neurotransmitter) 과정을 막아 신경계의 마비를 유도하는 것으 로 알려져 있다(Karpouzas and Walker, 2000; Karpouzas and Singh, 2006). 그 결과, 곤충과 유사한 신경전달 시스템을 가지고 있는 다른 고등동물들에게도 살충제는 다른 농약에 비 하여 심각한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 일반 적으로 지속성이 적어 잔류의 위험은 적지만 사람과 가축에 대 한 맹독성 약제가 많으며 오히려 한꺼번에 많은 양이 사용되 어 환경에 축적되는 단점이 있다(Pan et al., 2016). 따라서 유기인계 농약 및 화합물들의 막대한 사용량으로 인해 지하수 및 토양침투 문제가 점점 더 심각해지고 있는 실정이고, 전 세계적으로 매년 약 3백만 명이 유기인계 농약에 중독되고 있 으며 그 중 20만 명이 사망한다(Eddleston & Phillips, 2004; Gunnell & Eddlestion, 2003).

지금까지의 유기인계 농약 및 화합물들의 처리는 소각 (incineration)하는 것이 주된 방식이며, 이외에 매립과 해양에 투기하는 방식으로 처리하고 있어 심각한 환경문제를 야기하 고 있다. 최근에는 다량의 유해물질에 노출된 환경에서 이를 분해하면서 성장하는 식물, 미생물 또는 유전자들을 이용한 생 물적환경정화(Bioremediation) 연구가 세계적으로 주목을 받고 있으며, 실제 성공적인 적용사례가 발표 되었다(Karpouzas et al., 2000; Karpouzas et al., 2005; Megharaj et al., 2003; Racke & Coats, 1988; Serdar et al., 1982; Sethunathan & Yoshida, 1973).

본 연구에서는 유기인계 농약인 에토프로포스의 분해능이 우수한 신규 미생물을 선발하기 위해 과량의 에토프로포스를 첨가한 시설을 제작하여 90일 동안 15일 간격으로 토양시료 를 채취하여 토양 내 잔류하는 에토프로포스의 농도와 미생물 군집들의 변화를 조사하여 생물적환경정화 활성이 우수한 신 규 미생물을 동정하였고, 분해능력을 검정하였다.

재료 및 방법

유기인계 농약 에토프로포스의 토양 내 처리

에토프로포스는 환경에 유독하므로 비에 의한 처리물질의 확산 및 희석이 방지 되도록 특수시설을 제작하여 실험을 수 행하였다. 처리군 토양에 유기인계 농약 에토프로포스 입제(유 효농도 5%, 제품명 ‘모캡’, 동방아그로)를 60 g/3.3 m²의 비율 로 처리한 후, 15일 간격으로 토양시료를 채취하여 토양에 잔 류하는 에토프로포스 농도를 90일간 조사 하였다.

에토프로포스 처리 토양의 유효 농약 농도 측정

토양 50 g에 아세톤 100 mL를 가한 뒤 식품공전의 잔류농 약 분석방법에 따라 에토프로포스를 추출, 정제하였다.2) 가스 크로마토그래피(GC) 분석을 위해 에토프로포스 표준물질(순도 99.0%, Fluka)을 아세톤에 용해하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/kg의 표준용액을 만든 후 각각 1 uL씩 주입하여 나타 난 크로마토그램상의 피크면적을 기준으로 검량선을 작성하였 다. 분석에 사용된 GC는 Agilent 7890A 모델이였고, 칼럼은 DB-1701 [30 m(L)×250 μm(I.D.), 0.25 μm(film thickness)] 을 사용하였으며, 피크들은 전자포획검출기[electron capture detector(μ-ECD)]로 검출되었다. 주입구의 온도(injection port) 는 250°C, 검출기 블록(detector block)은 300°C, 칼럼오븐 (column oven)은 [150°C → 10°C/min → 210°C(3 min) → 20°C/min → 250°C(4 min)]로 유지되었고, 캐리어 가스[carrier gas(N₂)]의 유량(flow rate)은 1.0 mL/min으로 설정하였다.

에토프로포스 처리 토양에서 경시별 미생물 군집변화 분석

에토프로포스 투입 후, 분해되는 정도에 따라 미생물 군집 들의 종 다양성과 분포도를 조사하기 위해 15일 간격의 토양 에서 직접 DNA를 추출하였다. 토양에서 메타게놈 DNA를 분 리하기 위하여 약 5 g 토양을 PowerMax Soil DNA isolation kit(MOBIO, 미국)을 사용하여 분리하였고, 메타게놈 분리의 효율을 높이기 위하여 토양에 인산 완충액(phosphate buffer)과 bead 가 포함된 상태에서 라이소자임(lysozyme)을 10 mg 넣고 37°C에서 30분간 배양한 후 vortex mixer에서 20분간 진탕 처리하였다. 이후 상기 kit 시스템에서 제공하는 방식에 따라 전체 DNA를 분리하였고, pyrosequencing을 수행 하였다(Kim et al., 2011).

Soil-extract 배지를 이용한 에토프로포스 분해 미생물 선 발 및 검증

실제 토양 생태에서 에토프로포스를 분해하는 활성 저영양 균주를 선발하기 위해 일반 배지가 아닌 토양 추출액과 과량 의 에토프로포스가 첨가된 별도의 배지를 조제하여 저영양 세 균의 선발에 이용하였다. 토양 500 g에 증류수 500 mL로 혼 합하여 멸균하고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등 액을 여과 하였다. 이 여액에 Bactoagar 15%를 첨가하고 재 멸균하여 만든 에토프로포스 무첨가 배지와 같은 토양 추출액 에 100~1000 mg/L의 에토프로포스를 첨가하여 만든 soilextract agar(SEA) 배지를 실험에 사용하였다. SEA 배지에서 성장하는 미생물들만을 대상으로 0.03% glucose와 0.2% casamino acid를 첨가한 soil-extract liquid(SEL) 배지에 에토 프로포스를 100 mg/L가 되도록 첨가한 후 선발된 균주를 접 종하여 28°C에서 경시별로 진탕 배양하였으며, 이렇게 배양된 배지를 원심분리 하여 배양액을 수집하였다. 배양액과 hexane 을 1:2 비율로 분액 깔때기에 첨가하여 40분 동안 수직 왕복 식 진탕기로 혼합한 후 층이 분리되도록 정치하였고, 이중 hexane층만 분리하여 rotary 감압 농축기로 농축하여 60% acetonitrile에 녹여 여과한 것을 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 분석시료로 하였 다. HPLC는 AKTA basic (Amersham Pharmacia, 스웨덴) 모델이고, 칼럼은 SUPELCOSIL LC-18(25 cm × 4.6 mm, 5 um, SUPELCO, 미국)을 사용하였다. 이동상은 60% acetonitrile을 isocratic 조건으로 유속 1 mL/min으로 유지되었 다. 본 조건에서 232 nm의 UV 파장에서 분리되는 에토프로 포스 피크의 면적을 계산하여 정성 및 정량 분석을 수행하였 고, 대조구에 비해 에토프로포스 농도의 감소가 확연한 후보 미생물들을 선발하였다.

선발된 미생물들의 활성을 검증하기 위해 에토프로포스 오 염을 인위적으로 유도한 토양시료에 접종한 후 경시별 농약의 분해도 측정을 수행하였다. 에토프로포스를 처리한 토양(250 mg/kg of soil)에 미생물 균체를 토양 1 g 당 10⁶ 개로 접종 하고, 토양을 1일, 3일, 5일, 7일 간격으로 채취하였으며, 대조 구로 농약 무 처리구의 토양도 같은 간격으로 채취하여 에토 프로포스 함량을 GC로 분석하여 비교하였다.

에토프로포스 고분해능 신규 미생물 동정

에토프로포스 분해 미생물의 분자생물학적 분류 및 동정을 위 해 선발 균주의 총 DNA를 분리하였으며, 이로부터 16S rDNA 유전자를 증폭하기 위해 fD1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′) 및 Rp2(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′) 프라이머를 이용하여 94°C에서 5분간 변성시킨 후 94°C에서 1분, 30°C에 서 1분 30초, 72°C에서 2분의 순서로 34 cycle로 PCR을 수 행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5~1.6 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit(Qiagen, 독일)로 정제한 후 PCR 2.1 Topo TA 벡터 시스템(Invitrogen, 미국)에 서브클로닝 하였고, M13 forward primer(5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′)와 M13 reverse primer(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)를 이용하여 50°C에서 5초간 annealing, 60°C에서 4분간 extension하는 조 건으로 25 cycle의 PCR을 수행하고, 72°C에서 10분간 추가 연장 후 생성된 반응물을 정제하여 자동염기서열분석(ABI 3700, Perkin Elmer, 미국)을 수행하였다.

결과 및 고찰

에토프로포스의 토양 처리 후 경시별 잔류농약 변화 추적

유기인계 농약 에토프로포스 입제를 60 g/3.3 m²의 농도로 처리한 후 15일 간격으로 토양 시료를 채취하여 토양에서 분 해되고 잔류하는 에토프로포스 농도를 90일간 조사하였다. 그 결과, 에토프로포스 처리 당일 농도인 184.37 mg/kg에서 30 일 경과 후 89.96 mg/kg으로 유효농도가 급격하게 감소하였 다. 특히 토양에서의 잔류농도는 처리 후 30일까지 유효농도 의 일차 대량 감소가 발생하였으며 이후 60일에서 90일 사이 에 이차 감소가 발생하고, 최종 90일에는 잔류양이 1.25 mg/ kg에 불과해 처리 전 원상태에 가까워짐을 발견하였다(Fig. 1).Table 1

경시별 토양 내 미생물 군집의 종 풍부성 및 근연도 분석

에토프로포스 처리 전을 대조구(PT)로 하고, 처리 직후 (ET0), 1일(ET1), 15일(ET15), 30일(ET30), 45일(ET45), 60 일(ET60), 75일(ET75), 90일(ET90) 경과 후 토양에서 추출한 DNA를 pyrosequencing하여 종 다양성을 분석한 결과 에토프 로포스 처리 전 토양에서는 처리 후 토양보다 훨씬 다양한 종 다양성과 많은 생존 집락을 나타냈고, 에토프로포스 처리 후 15일 부터는 종 다양성과 생존 개체 수가 현저히 감소되는 것 을 관찰할 수 있었다. 처리 직후 15일 후 토양에서는 종 다양 성과 풍부성이 가장 낮았고 이후에는 서서히 증가하는 양상을 보였다(Data not shown). 에토프로포스 처리 후 각각의 경시 별 토양 내 미생물 군락 간 상호 근연관계 분석을 수행한 결 과 에토프로포스 처리직후(ET0)와 1일차(ET1)의 토양 내 미 생물 군집의 종 유사성이 높았고, 본격적인 에토프로포스 분 해가 일어난 15일(ET15)과 30일(ET30), 그리고 이 그룹과 45 일(ET45)의 미생물 군집 내 종들이 서로 근연도가 높고 유사 함을 알 수 있었다. 또한 2차 분해가 일어나는 60일(ET60)과 75일(ET75)의 미생물 군락 종류가 45일의 토양 군락과는 차 이가 있는 것으로 확인되었고, 전체적으로 에토프로포스의 분 해가 90% 이상 진행되면서 ET0 및 ET1 군락과 유사하게 변 화되는 것으로 생각된다(Fig. 2).

경시별 토양 내 미생물 군집의 종 다양성 분석

경시별 각각의 토양 내 미생물 군집의 분포를 genus 및 species 별로 조사하였다. Genus 수준에서 처리별 미생물 종 다양성을 분석한 결과 Pseudomonas 속의 미생물이 에토프로 포스 처리 후 1차 분해가 일어나는 단계인 15일과 30일 경과 토양에서 급격히 증가하고, 전체 미생물 군집에서도 압도적인 우점현상을 보이고 있다. 그러나 2차 분해가 일어나는 단계인 60일과 75일 토양에서 각각 Collimonas 속이나 Sphingobium 속의 뚜렷한 증가가 관찰되었다(Fig. 3A). 또한 species 수준 에서 미생물들의 종 다양성을 분석한 결과 Pseudomonas amygdali, Pseudomonas frederiksbergensis, Pseudomonas agarici가 에토프로포스의 1차 분해가 일어나는 단계(15일 및 30일)에서 우점하는 양상을 보였고, 2차 분해가 일어나 는 단계(60일 및 75일)에는 각각 Collimonas pratensis와 Sphingobium baderi가 우점하는 것으로 나타났다(Fig. 3B).

에토프로포스 분해 미생물 선발 및 균주 처리 후 토양 내 에토프로포스 분해도 조사

저 영양 미생물자원들 중 1000 mg/L의 에토프로포스를 함 유한 soil-extract agar(SEA) 배지에서 성장하는 균주, 100 mg/L의 에토프로포스를 함유한 soil-extract broth(SEB) 배지에 서 성장할 수 있는 균주, 그리고 60일과 75일 경과 토양의 군집분석에서 급작스럽게 우점하는 Collimonas와 Sphingobium 균주들을 대상으로 대조구와 비교하여 에토프로포스 분해 활 성이 높은 미생물들을 2차 선발하였다. 이들 균들의 in vitro 에서의 에토프로포스 분해활성을 측정하기 위해 100 mg/L의 에토프로포스가 함유된 SEB 배지에 균들을 접종 후 배양하였 고, HPLC 분석에 의해 분해 정도를 확인하였다. 그중에 EP60845는 10% 접종 시 5시간 이내에 배지 내 에토프로포스 를 완전 분해시키는 것으로 나타났다(Fig. 4A, 4B).

In vitro에서 에토프로포스의 분해효과가 확인된 EP60845의 실제적인 적용을 위해 토양 내에서의 에토프로포스 분해 활성 여부를 조사하였다. 대조구로 토양에 에토프로포스만을 처리 하여 경과 일별로 자연 분해도를 평가한 결과 3일, 5일, 7일 경과 후 각각 약 7.1%, 11.2%, 20.8%의 에토프로포스 농도 감소를 보였다. 반면에 EP60845와 에토프로포스를 함께 접종 한 토양의 경우 접종한 직후 분석 시에도 대조구와 비교하여 약 10.4% 정도 에토프로포스 농도가 감소하였고, 접종 후 1일 경과 시 농도의 감소율은 약 27.4% 정도였으며, 3일 경과 시 에는 53.8%로 3일 동안 에토프로포스가 급격히 분해된 것으 로 나타났다. 그 후에도 시간이 지남에 따라 에토프로포스 농 도는 지속적으로 감소하여 5일 경과 시에는 71.5%, 7일 경과 후에는 85.6%가 분해된 것을 확인하였다(Fig. 4C). 이는 에토 프로포스로 오염된 토양이나 수변 환경에서 EP60845 배양액 을 살포했을 때 단기간 내에 생분해하는 능력이 실제로 있음 을 나타내는 결과이다.

EP60845의 동정 및 16S rDNA에 의한 근연관계 분석

EP60845의 동정을 위해 16S rRNA gene의 염기서열을 분 석하였고, 그 상동성을 비교하고 계통분류도를 작성하기 위하 여 비교염기서열을 EzTaxon-e(Kim et al., 2012) 및 DDBJ/ NCBI/GenBank DB 로부터 얻었다. 비교균주들과의 염기서열 의 상동성은 EzTaxon-e 프로그램을 이용하여 산출하였고, 얻 은 염기서열들은 SINA 프로그램을 이용하여(Pruesse et al., 2012) 병렬로 정렬하였고, MEGA version 5.0(Tamura et al., 2011)의 maximum likelihood 알고리즘(Felsenstein, 1981)에 의 거하여 본 균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다(Fig. 5). 특 히, 생리화학적 특성비교를 위해 Sphingobium herbicidovorans 종의 표준균주인 Sphingobium herbicidovorans MH (KACC12333)(Zipper et al., 1996)(Takeuchi et al., 2001)와 API 키트(bioMrieux) 실험을 수행한 결과 질산환원능, 탄소원 기질의 이용성, 효소생산능 등에서 많은 차이를 나타내어 생 화학적 특성에 있어서도 명확하게 구분됨을 확인하였다. 따라 서 Sphingobium sp. EP60845는 Sphingobium 속으로 분류되 지만 이미 보고된 스핑고비움 속의 다른 종들과는 뚜렷이 구 분되는 독립적인 위치를 차지한다는 것을 확인하였다.

자연계에서 미생물에 의한 유기인계 화합물의 생물학적 분 해는 크게 두 단계를 거쳐 이루어진다. 첫 번째 단계는 phosphotriesterase가 인(P)과 산소(O) 간의 공유결합을 분해한 다. 다음 단계에서 아릴기(R-O-OH)의 카복실 결합을 절단하 는 carboxyesterase가 최종적으로 유기인 화합물을 환원시켜 분해가 완성된다(Kambiranda et al., 2009). 이러한 두 단계 분해 효소 시스템을 모두 가진 유용 미생물을 선발하여 친환 경적인 생물정화 공정에 이용하기 위해 토양을 비롯한 다양한 시료에서 스크리닝이 꾸준히 이루어졌지만, 현재까지 알려진 유기인계 농약을 분해하는 균들 가운데 특히 에토프로포스를 효과적으로 분해하는 균은 많지 않다. 에토프로포스를 분해하 는 균들로는 Flavobacterium 계열(Amareshwari et al., 2015), Acinetobacter 계열(Chanika et al., 2011), Pseudomonas 계 열(Karpouzas et al, 2000), Arthrobacter 계열 (Ohshiro, 1996) 미생물들이 기존의 연구로 알려졌다. 하지만 Sphingobium 계열의 균으로는 에토프로포스를 미량 분해하지 만, 유기인계 살충제 카두사포스(cadusafos)에 좀 더 특이적인 Sphinogomonas paucimobilis 만이 현재까지 보고되었다 (Karpouzas et al., 2005).

본 연구로 분리 동정한 Sphingobium sp. EP60845는 기존 에 알려져 있지 않은 신종 세균으로 유기인계 농약인 에토프 로포스를 특이적으로 분해하는 미생물이다. 그러므로 Sphingobium sp. EP60845는 미생물을 이용한 생물정화, 특히 토양에 잔류하는 고독성 유기인계 농약의 대량정화에 유용하 게 이용할 수 있을 것이다.

적 요

미생물을 이용한 환경정화는 기존의 화학공학적 기법들을 이용할 때 보다 훨씬 더 저렴하고, 오염물질을 선택적으로 제 거할 수 있게 하는 특이성도 다른 여타의 방법에 비하여 우수 하다. 본 연구에서는 유기인계 농약인 에토프로포스의 분해능 이 우수한 신규 미생물을 선발하기 위해 과량의 에토프로포스 를 첨가한 특수 시설을 제작하여 실험을 수행하였고, 90일 동 안 15일 간격으로 토양시료를 채취하여 토양 내 잔류하는 에 토프로포스의 농도와 미생물 군집들의 변화를 조사하여 생물 적환경정화 활성이 우수한 신규 미생물을 분리하였다.