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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)

Journal of the Korean Society of International Agriculture Vol.30 No.4 pp.347-356
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2018.30.4.347

Influence of heading date difference on gene flow from GM to non-GM rices

Sung-Dug Oh^‡

, Ancheol Chang, Boeun Kim, Soo-In Sohn, Doh-Won Yun†

Department of Agricultural Biotechnology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Jeonju, 54874, Korea

‡

The first two authors contributed equally to this work

Corresponding author : (Phone) +82-63-238-4713 (E-mail) dwyun@korea.kr

Received November 15, 2018 Review December 13, 2018 Accepted December 14, 2018

Abstract

Genetically modified (GM) crops have been increased continuously over the world and concerns about the potential risks of GM crops have also been increasing. Even though GM crops have not been cultivated commercially in Korea, it should be necessary to develop the safety assesment technology for GM crops. In this study, we investigated the influence of heading date difference on gene flow from GM to non-GM rice. In the experimental plot design, The PAC GM rice was placed in the center as a pollen donor and non-GM rice were placed in eight directions as pollen receivers. Five pollen receiver rice cultivars were Unkawng, Daebo, Saegyejinmi, Nakdong-byeo, and Ilmi which had different flowering times. A total of 266,436, 300,237, 305,223, 273,373, and 290,759 seeds were collected from Unkawng, Daebo, Saegyejinmi, Nakdong, and Ilmi, respectively, which were planted around PAC GM rice. The GM×non-GM hybrids were detected by repeated spraying of herbicide and PAT immunostrip assay. Finally, the hybrids were confirmed by PCR analysis using PAC gene specific primer. The hybrids were found in Nakdong-byeo which had the same heading date with PAC GM rice. The hybridization rate was 0.0007% at Nakdong-byeo plot. All of GM×non-GM hybrids were located within 2 m distance from the PAC GM rice zone. The physiological elements including rice heading date were found to be important factors to determine GM?rice out crossing rate with GM rice. Consideration should be taken into for many factors like the physiological elements of field heading date of rice cultivars to set up the safety management guideline for prevention of GM rice gene flow.

Key Words : Genetically modified (GM) , gene flow , heading date , rice

GM벼에서 non-GM벼로 유전자 이동에 대한 개화기 차이의 영향 분석

오 성덕^‡

, 장 안철, 김 보은, 손 수인, 윤 도원†

농촌진흥청 국립농업과학원 생명자원부

초록

키워드 :

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Cited-By

Funding:

Rural Development Administration
PJ011867022018

서 론

제초제 내성 GM콩이 상업적으로 재배된 1996년 이후 GM 작물 (genetically modified, 유전자변형)은 매년 지속적으로 재 배면적이 증가하여, 2017년에는 189.8백만 헥타르의 면적에서 재배되었다(James, 2018). 해충 또는 제초제저항성을 갖도록 개 발된 GM 작물들은 농약사용 절감과 농업 생산량 증가를 통한 생산 농가 소득 증대 및 살충제나 제초제 등의 농약 사용량을 감소에 의한 농업 주변 환경 피해 감소, 그리고 이를 통한 지 구 온실가스 감소 등 다양한 이점으로 농업생태계를 보호한다 (Owen 2000;James, 2018). GM 작물의 다양한 이점에도 불 구하고, GM 작물에 도입된 유전자의 교잡에 의한 일반 재배 품종의 유전자 오염, 잡초화 가능성 증가와 근연·야생종 감소 등에 따른 농업환경 및 농경지 주변 생태계의 교란 문제도 제 기되고 있다(Conner et al. 2003;Al-Ahmad & Gressel, 2005). 이와 같은 GM작물의 유전자 교잡에 대한 사회·과학적 우려와 관심이 높은 이유는 GM 작물 개발할 때 선발을 위해 항생·제초제 저항성 유전자를 주로 이용하기 때문이며, GM 작 물이 농경지 재배시에 선발 유전자가 경작지 주변의 다른 작 물 또는 근연·야생종 등으로 이동되어 항생·제초제 저항성을 갖 는 슈퍼잡초 발생 또는 농경지 주변의 생태계 교란이 일어날 수 있는 가능성이 존재하기 때문이다. Raybould 와 Gray 연 구에 의하면 사탕무, 당근, 사과 등 품종화된 31종의 재배 작 물의 30% 정도에서 하나 이상의 야생종과의 교잡이 발생할 수 있으며(Raybould & Gray 1993), Ellstrand 등의 연구에서 도 42 종의 식물에서 약 11종에서 교잡될 가능성 있는 것으 로 보고되었다(Ellstrand et al. 1999). 식용 및 사료용 등의 용도로 국내에 수입되는 GM곡물은 2017년에만 약 9,601천 톤, 20.1억 달러 규모이며, 주로 옥수수, 콩, 면화이다. 이중 콩은 대부분 식용으로 약 1,043천 톤이 수입되었고, 옥수수는 사료용이 7,168천 톤, 식용이 1,239천 톤이 수입되었으며, 면 화는 사료용으로만 151천 톤이 수입되었다(KBCH, 2018). 한 국으로 농산물을 수출하는 주요 농산물 생산국들로는 브라질, 미국, 아르헨티나, 캐나다, 중국 등이며, 이들 나라에서는 GM 작물을 상업적인 재배하고 있기 때문에, 국내에 유통되는 수 입 농산물에 유전자변형생물체(genetically modified organism, GMO)가 비의도적인 혼입이 되어 유통될 수 있으며. 국내 주 요 작물들에 대한 GMO의 환경 위해성 평가 기술 및 유전자 교잡 저해 프로토콜 개발이 필요하다. 최근 국내에서도 농업 생명공학기술을 이용한 GM 벼, GM 콩 등의 GMO가 개발되 었지만, 격리된 공간에서의 시험연구용 이외에는 아직 GM 작 물 재배가 허용되고 있지 않다. 이들 국내 개발된 GMO들을 안전하게 활용하기 위해서는 GMO의 환경위해성 평가가 반 드시 이루어져야 한다. 우리나라는 GM 작물의 안전한 이용 을 위해 ‘유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률 (LMO법)’을 제정하여 시행하고 있다(Lee & Suh, 2011). LMO법에서는 GMO의 상용화를 위해 환경과 인체에 미칠 수 있는 요인들에 대한 철저한 안전성 평가를 요구하고 있으며, GM 작물들의 근연·야생종 및 이종 간의 교잡에 의한 도입 유 전자의 이동 가능성여부는 GM 작물의 환경위해성 평가에서 주요 항목이다.

벼(Oryza sativa)는 전 세계적으로 분포하는 옥수수, 밀과 함께 주요 곡물이며, 세계 인구의 절반 가량이 주식으로 식용 하고 있다(OECD 1999). 벼는 자가수정 작물이며, 공기 중에 노출된 화분은 화분 활력이 짧아 개화 즉시 수분이 이루어지 고 오전 11시쯤에 개화가 최성기에 도달한다. 벼(Oryza sativa)의 자연 교잡율은 일반적으로 1%로 보고되었으나, 제초 제저항성 GM 벼로부터 재배종인 비형질전환 벼로의 유전자 이동률이 0.05~0.53%로 보고되었으며, 잡초성벼로의 유전자 이동률은 제초제저항성 GM 벼로부터 0.001~0.046%로 보고되 었다(Messeguer et al. 2001;Chen et al. 2004). 또한, 벼의 교잡 가능 거리는 최대 30m로 보고되어 벼의 화분에 의한 유 전자 이동에 의한 농업환경과 재배지 주변 생태계에 미치는 영향이 제한적이라고 알려져 있지만(Gealy et al. 2003), Oryza sativa에 속해 있는 일반 재배 품종벼와 잡초성벼는 다 양한 교잡 요인에 의한 유전자 이동이 가능하며(Song et al. 2004), Langevin 등의 연구에서 잡초성벼(weed red rice)와 재배 품종간의 교잡율 분석 결과 ‘Lemont’ 품종에서 1%, ‘Nortai’ 품종에서는 최대 52%의 교잡율이 보였는데 이는 공 여체인 ‘Nortai’ 품종의 후속 개화로 인한 개화 기간 연장과 수여체인 잡초성벼의 개화기가 중복으로 인한 것으로 보고된 바 있다(Langevin et al. 1990). 국내에서도 비타민A 강화벼 의 유전자 이동성 평가를 수행한 결과, 비타민A 강화벼에 가 장 근접하게 심겨진 30cm에서의 낙동벼와의 교잡률은 9%로 보고되었다(Bae et al. 2013). 국제적으로 삼나무 꽃가루 알레 르기 저항성, 비타민A 강화벼, 해충저항성 등의 GM 벼가 개 발되었으며, 제초제저항성 GM 벼(LL RICE 601)는 1998년과 2001년에 실험용 재배도 이루어졌지만, 아직까지 GM 벼의 상 업적인 재배는 하고 있지 않다. 근래에 국내에서도 농업생명 공학분야에 대한 집중된 연구와 투자로 인해 다양한 특성을 지닌 GM 벼가 개발되었으며, 가뭄저항성 GM벼, 병저항성 GM벼, 레스베라트롤 생합성벼 등의 실험 연구용 포장 재배도 이루어졌지만, 아직까지 국내에서는 GM 벼의 상업재배는 이 루어지지 않고 있다(Oh et al. 2014). 국내에서 GM 작물로부 터 교잡 가능한 식물로의 교잡 연구는 벼 이외에도 콩(Baek et al., 2010;Lee et al., 2015), 배추(Baek et al., 2008), 고추(Kim et al., 2009a, Kim et al., 2009b), 유채(Lee et al., 2007;Lee et al., 2009), 양배추(Kim et al., 2014), 잔 디(Lee et al., 2014), 수박(Kim et al., 2008) 등 다양한 작 물에서 수행되었다.

유전자 이동은 일반적으로 매개충과 바람 등에 인해 발생되 며, 개화시기, 강우, 풍속, 재배면적, 기후 등의 환경적 요인에 의해 영향 받는다(Warwick et al, 2009). 비록 국내외적으로 다양한 GM 작물에서 유전자 이동 연구가 수행되었으나 개화 기의 차이에 대한 연구는 거의 수행되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 목적 유전자 PAC (CrtI, Psy)과 선발마커 bar 유 전자가 도입된 비타민A 강화벼를 이용하여 재배 품종 벼들의 개화기 차이에 따른 유전자 이동의 변화에 미치는 영향을 조 사하고자 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

공시 재료

비타민A 강화벼(Phytoene synthase-st2A-Carotene desaturase transgenic rice, PAC)는 고추(Capsicum annuum)와 박테리아 (Pantoea)의 카로티노이드 (carotenoid) 대사관련 다중유전자인 PAC 유전자를 동시 발현기술에 의해 쌀의 배유부위에 발현되 는 운반체(Fig. 1)가 낙동벼에 형질 전환되었으며, 선발마커로 글루포시네이트(바스타, glufosinate ammonium) 제초제저항성 유전자(bar)도 같이 도입되어 교잡된 개체 선발 시에 바스타 를 처리하여 선별하였다. 비타민 A 강화벼(PAC)와 모품종인 낙동벼와 선행 연구 및 문헌 조사를 통해 개화기가 차이가 있 는 일미벼, 운광벼, 대보벼, 세계진미벼를 각각 파종하고 포장 에 이앙하기 전까지 온실에서 재배하였다.

기상 관측

국립농업과학원 전주 LMO 격리 포장(RDA-가AB-2013- 041)에서 비타민A 강화벼(PAC)의 유전자 이동성 평가를 수행 하였다. 벼 개화기간 중 화분 비산 및 수분이 가장 활발한 오 전 11시를 전후로 4시간 동안 풍향, 풍속, 습도 및 온도를 LMO 격리포장의 기상측정 장치를 이용하여 관측하였으며, 기 상청에서 수행하는 방법에 따라 30분 단위로 기상 자료를 측 정하였다.

포장 배치

비타민A 강화벼(PAC)의 유전자 이동성을 평가하기 위하여 중앙의 core포장에 비타민A 강화벼(PAC)를 1 m×1m 넓이로 재식한 후, 모품종인 낙동벼 및 공시품종 운광벼, 대보벼, 세 계진미벼, 일미벼를 동서 방향으로 3 m, 남북으로 8 m, 북서, 북동, 남서, 남동으로 4 m까지 심어 유전자이동성 분석을 위 한 포장을 조성하였다. 시험포의 재식거리는 15×30 cm 이 었고, 주위에 모품종인 낙동벼 및 공시품종 운광벼, 대보벼, 세 계진미벼, 일미벼를 동일한 재식거리로 정식하였다(Fig. 2).

종자 수확

비타민A 강화벼(PAC)와 낙동벼, 일미벼, 운광벼, 대보벼, 세 계진미벼의 개화 진행 상황은 7월 25일부터 약 4주간 조사하 였고, 비타민A 강화벼(PAC)가 정식된 마지막 위치를 기준으 로 동, 서, 남, 북, 북동, 북서, 남동, 남서의 8방향 및 거리별 (30, 60, 90 cm 등 30 cm 간격으로 최대 8 m)로 각각의 품종 별로 수확하였다. LMO 격리포장의 건조장에서 종자 건조한 후 정선 및 계수하고 유전자 이동성을 분석할 때까지 저온실 (4°C)에 보관하였다.

유전자 이동성 개체 선별

방향 및 거리별로 낙동벼, 일미벼, 운광벼, 대보벼, 세계진미 벼로부터 수확한 종자는 혼입을 막기 위해 각각 벼모판 (54×28 cm)에 파종하고 발아시켰다. 3~4엽기에 0.3% 바스타 (glufosinate ammonium)를 처리(살포)하고 10일 간격으로 2차 와 3차 제초제(바스타)를 살포하였으며, 3차 제초제를 살포 후 1주일 후에 육안으로 제초제 저항성 개체를 최종 선발하였다. 분자생물학적 검정을 위한 시료 채취를 위해서 최종 선발된 제초제저항성 개체는 온실에서 재배하였다.

도입유전자의 단백질 발현 검정

최종 선발된 제초제저항성 개체의 제초제저항성 단백질 (Phosphinothricin- acetyl-transferase, PAT) 발현 검정을 위해 Immunostrip (lateral strip test) 분석을 수행하였다. 제초제저 항성 개체(유전자 이동 개체)와 비형질전환 벼로부터 유래한 잎 조직으로부터 단백질을 추출한 후, Trait LL Test Strip(Strategic Diagnostics Inc, Newark, USA)를 이용하여 PAT 단백질의 발현을 검정하였다. PAT Immunostrip 검정을 통해 검증된 비타민A 강화벼(PAC)와의 교잡된 개체수를 계수 하여 비타민A 강화벼(PAC)로부터의 유전자 이동률을 계산하 였다.

벼 DNA 분리 및 PCR 검정

Immunostrip 검정을 통해 검증된 제초제저항성 교잡 개체들 로부터 잎 조직 시료를 각 0.1 g씩 취하여, 막자사발을 이용 하여 분말화한 후, DNeasy plant kit (Qiagen, Valencia, USA)를 이용하여 교잡 개체의 genomic DNA를 추출하였다. 교잡 개체 genomic DNA는 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc, Wilmington, USA) 을 사용하여 260/280 nm 파장 값이 1.8~2.0의 시료들만 PCR (Polymerase chain reaction) 실험을 수행하였다. PCR 분석을 위하여 f-Taq DNA polymerase 1U (Solgent, Korea), 10× PCR buffer 4 μl, dNTP(10mM) 4 μl, 프라이머 각 20 μM (Table 1), 주형 DNA 200pg를 첨가하고 마지막으로 증류수를 첨가하여 최종 PCR 반응 용량이 40 μl가 되도록 하였다. PCR 반응은 95°C에서 5분 후, 95°C에서 30초, 58°C에서 30 초, 72°C에서 1분의 조건에서 35 사이클로 증폭한 뒤 72°C에 서 5분간 반응을 순차적으로 PTC-100 Thermal cycler (MJ Research, USA)를 사용하여 반응시켰다. 1% 한천 겔에서 100V, 25분간 전기 영동한 후에 UV 조사로 PCR 산물들을 확인하였다.

결과 및 고찰

벼 품종 개화기 기상 조건 분석

Shivrain 등은 화분 매개에 의한 유전자 이동은 식물체간의 개화기간, 벌의 다리에 묻혀진 꽃가루인 화분하(pollen load), 화기형태, 유전적 교잡친화성 및 기상 조건 등의 환경 요인에 의해 영향이 있다고 보고하였다(Shivrain et al. 2009). 비타민 A 강화벼(PAC)의 화분 매개에 의한 유전자 이동에 관여하는 기상 조건을 조사하기 위하여 국립농업과학원 전주 LMO 격 리포장 내 설치된 기상 측정 장치로 개화 기간 중 30분 간격 으로 온도, 강우량, 풍속 및 풍향을 관측하였다. 개화기간 중 관측된 기상자료를 분석한 결과, 화분의 비산 및 수분이 가장 활발한 오전 9시~12시에는 풍속 0등급(0~0.2 m/s)의 고요바람 상태가 13.7%였으며, 풍속 1등급(0.3~1.5 m/s)의 실바람이 77.5%, 풍속 2등급(1.6~3.3 m/s)인 남실바람이 4.4%, 풍속 3등 급(3.4~5.4 m/s)의 산들바람이 2.2%, 풍속 4등급(3.4~5.4 m/s) 의 건들바람이 2.2%이었으며, 바람의 방향은 서풍(42%), 남남 서풍(10.2%), 남동풍(9.9%) 순서로 관측되었다(Fig. 3). 이는 근처 지형지물의 변화가 없는 한 국립농업과학원 전주 LMO 격리포장 지역의 개화기간 중 풍향과 풍속의 정보를 축적하여 추후 LMO 격리포장의 안전관리 방안에 필요한 기초 자료로 활용될 것이다. 개화기간 동안 총 강수량은 40.4 mm 였으며, 소폭의 비가 내린 8월 26일부터 8월 31일까지 기온 저하 (21~24°C)가 나타났으며, 이 기간을 제외하고는 온도(25~30°C) 와 상대 습도도 70% 이상으로 기상 조건을 관측되었고, 비타 민A 강화벼(PAC)의 개화기(8월 18일) 전후 일주일간의 기상 조건은 기온 저하나 강우로 인한 저온다습한 환경 조건이 아 니므로 화분에 의한 유전자 이동에 큰 영향을 주지는 않았을 것으로 판단되었다.

공시 품종별 생육 특성

공시 품종들의 농업형질 조사 결과, 간장 길이는 GM벼인 비타민A 강화벼(PAC) 86±3.6 cm, 낙동벼 84.1±5.0 cm, 일미 벼 80.8±3.1 cm, 운광벼 74.3±3.0 cm, 대보벼 67.9±3.0 cm, 세계진미벼 90.4±4.4 cm로 측정되었으며, 수장 길이는 비타민 A 강화벼(PAC) 20±2.6 cm, 낙동벼 20.5±2.4 cm, 일미벼 21.3 ±2.3 cm, 운광벼 22.6±1.3 cm, 대보벼 21.3±1.6 cm, 세계진미 벼 24.9±1.9cm로 측정되었다. 간장과 수장에서 비타민A 강화 벼(PAC)와 모품종인 낙동벼에서 유사한 결과를 보였다. 수당 립수에서는 비타민A 강화벼(PAC) 85±18.9개, 낙동벼 110.5 ±23.5개, 일미벼 150.4±34.1개, 운광벼 144.7±30.7개, 대보벼 138.4±28.4개, 세계진미벼 182.6±41.6개로 관측되었으며, 등숙 비율은 비타민A 강화벼(PAC) 78.3±8.6%, 낙동벼 93.7±3.8%, 일미벼 95.6±1.6%, 운광벼 91.8±3.6%, 대보벼 93.8±2.9%, 세 계진미벼 90.3±4.0%로 관측되었다. 비타민A 강화벼에서는 수 당립수와 등숙율에서 모품종인 낙동벼에 비해 저조하였다. 정 조천립중은 비타민A 강화벼(PAC) 25.3g, 낙동벼 25.4g로 유 사한 결과를 보였다. 각 품종별로 개화기는 비타민A 강화벼 (PAC) 8월 18일로 관측되었으며, 모품종인 낙동벼는 8월 18 일, 중만생종인 일미벼는 8월 20일, 조생종인 운광벼는 8월 5 일, 중생종인 대보벼는 8월 16일, 통일형인 세계진미벼는 8월 16일로 조사되었다(Table 1). 개화기의 중복은 인접한 근연종 과의 화분에 의한 교잡에 주요 인자이며(Shivrain et al. 2009), 본 실험에서도 각 품종별 벼의 개화 기간이 비타민A 강화벼(PAC)에 근접한 시기에 중복되거나 중복되지 않아 개 화기에 의한 유전자 이동성 평가에 미치는 영향이 있을 것으 로 예상되었다. Table 2

비타민A 강화벼(PAC)의 유전자 이동성 검정

8방향으로 30 cm에서 최대 8m까지 거리별로 조성된 포장에 서 재배된 화분 수용체 non-GM 벼로 모품종인 낙동벼와 중 만생종인 일미벼, 조생종인 운광벼, 중생종인 대보벼, 통일형 인 세계진미벼로부터 각각 273,373립, 290,759립, 266,436립, 300,237립, 305,223립의 종자를 수확하였으며, 수확된 non-GM 벼 품종들은 비닐온실에서 한 달 간 자연 건조 후 탈곡과 정 선 작업을 수행하였다. 각 품종별 종자들을 벼모판(육묘상자) 에 각 품종별로 파종하여 온실에서 발아시켰다. 선발 마커로 도입된 bar 유전자에 의한 제초제인 바스타(glufosinate ammonium) 저항성을 확인하기 위하여 발아된 개체들을 3엽 기까지 생육시킨 후, 제초제(바스타, 0.3%)를 10일 간격으로 3 회 살포하여 제초제저항성 여부를 육안으로 판별하였다. 제초 제 저항성으로 확인된 교잡된 개체들로부터 단백질을 추출하 고 비타민A 강화벼(PAC)의 제초제 저항성 단백질인 PAT의 발현 여부를 immunostrip 검정하였다. 제초제 저항성 개체들 은 오직 개화기가 8월 18일로 일치하는 모품종인 낙동벼에서 만 비타민A 강화벼(PAC)와 교잡된 개체가 선별되었고, 개화 기가 일치하지 않은 일미벼, 운광벼, 대보벼, 세계진미벼에서 는 교잡된 개체가 발견되지 않았다(Table 3, 4, 5, 6, 7). 출 수기가 8월 5일인 운광벼는 7일 이상 차이로 비타민A 강화벼 (PAC)와 출수기가 일치 하지 않지만, 대보벼, 세계진미벼, 일 미벼와 출수기가 각각 ±2일 차이이며, 일반적으로 벼의 개화 기간이 7일이라는 점을 고려하면 출수기가 같지 않더라도 인 접한 출수기를 가진 품종과 교잡될 수 있는 가능성이 있다. 기존에 보고된 바에 의하면 제초제저항성 GM벼와 잡초성벼 간의 교잡시에 잡초성벼의 초장 크기와 출수기에 따라 교잡율 이 0.011~0.046%로 차이를 보였으며, 이는 벼의 출수기뿐만 아니라 간장, 초장 등의 생육 특성이 유전자 이동성에 주요 요소임을 보고된바 있다(Kim et al. 2004). 비타민A 강화벼 (PAC)의 간장 길이는 86±3.6cm로 비타민A 강화벼(PAC)와 출 수기 ±2일 차이가 있는 대보벼, 일미벼, 세계진미벼에 비해 평 균 4.5~18 cm 정도의 간장 길이의 차이를 보였으며, 이는 본 실험에 사용된 재배 품종별 간장, 수장, 초장 등의 생육 특성 차이에 의해서 화분에 의한 유전자 이동이 발견되지 않았을 것으로 사료된다(Table 1). 제초제 저항성 선별과 PAT immunostrip 검정 결과, 모품종인 낙동벼로부터 제초제 저항 성을 보이는 2개의 교잡 개체를 확인하였으며(Fig. 4), 제초제 저항성을 나타내는 낙동벼 교잡 개체는 비타민A 강화벼(PAC) 의 남동쪽방향의 1 m~2m 거리에서 2개체만 발견되었다(Table 3). 비타민A 강화벼(PAC)의 화분에 의한 유전자 이동성을 분 석한 낙동벼 273,373립 중 2개체만 제초제 저항성을 나타내어 교잡율은 0.0007%로 분석되었다.

유전자 이동성 개체의 PCR 검정

글루포시네이트 암모니움(바스타) 살포를 통해 제초제 저 항성을 보이는 비타민 A 강화벼(PAC)에 대한 낙동벼의 유 전자 이동성 개체들에 대한 분자생물학적 검정을 위해 제초 제 선별된 벼의 유묘에서 genomic DNA를 추출하고 비타 민A 강화벼(PAC) 유전자 검출용 PCR 분석을 수행하였다. 추출된 genomic DNA를 주형으로 비타민A 강화벼(PAC)에 도입된 목적유전자(Psy)와 제초제저항성 유전자(bar)에 검출 하는 프라이머를 이용하여 비타민A 강화벼(PAC) 유전자 검 출을 확인하였다(Table 2). 모품종인 낙동벼는 목적유전자 (Psy)와 제초제저항성 유전자(bar)가 도입되지 않았기 때문 에 PCR 밴드가 검출되지 않았으며, 비타민 A 강화벼 (PAC)와 교잡된 2개의 개체들에서는 제초제 선별 및 PAT immunostrip 검정 결과와 일치되는 Psy 유전자와 bar 유전 자의 밴드가 검출되어 교잡된 개체의 도입된 유전자가 비타 민A 강화벼(PAC)로부터 유래된 것을 확인하였다. 또한, 고 정된 비타민A 강화벼(PAC)와는 달리 교잡된 개체(F1 세대 )는 모계(낙동벼)와 부계(PAC)의 양쪽에서 유래한 게놈이 조 합되었기 때문에 비타민 A 강화벼(PAC)와 교잡된 개체들에 서 rice genome 유전자(PAC의 T-DNA가 도입된 주변 염 기 서열)를 PCR을 분석한 결과에서 낙동벼와 동일한 크기 의 밴드가 검출됨을 확인하였다(Fig. 5).

국내에서 수행한 병저항성(OsCK1) GM 벼의 모품종인 낙 동벼에 대한 유전자 이동성 평가에서도 남쪽 30, 60 cm에서 각각 0.018% (1개체), 0.013% (1개체)와 동쪽 30 cm에서 0.015%(1개체)로 교잡개체가 발생하였으며, 낙동벼 449,711립 중 3개의 교잡개체가 발생하여 교잡율은 0.00066%로 분석되 어 유전자 이동 빈도는 높지 않았다(Oh et al. 2014). 병저항 성 GM 벼의 유전자 이동성 실험 기간 동안 경북대학교 LMO 격리포장 내의 기상 조건은 개화기간 중 풍향은 주로 남동풍이 불었으며, 풍속은 바람이 불지 않는 고요한 상태 (0~0.5 m/s)가 49%였으며, 약풍(0.5~2.0 m/s)은 21.3%, 강풍 (5.7 m/s 이상)의 비율은 2% 이었다. 또한, 동일한 경북대학교 LMO 격리포장에서 수행한 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 모 품종인 낙동벼에 대한 유전자 이동성 평가에서도 모품종인 낙 동벼로부터 해충 저항성을 보이는 20개의 교잡개체가 검출되 었으며, 유전자 이동성 분석한 낙동벼 729,917립의 종자에서 20개의 교잡 개체가 발생하여 교잡율은 0.0027%로 분석되었 다. 해충저항성을 나타내는 낙동벼 교잡개체는 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)을 중심으로 동쪽방향(30 cm)에서 1개체, 서쪽 방 향(60cm)에서 1개체, 북쪽방향에서는 30 cm에서 1개체, 60 cm에서 2개체, 남쪽방향(30 cm, 60 cm, 90 cm)에서 각각 1개 체씩 발견되었으며, 북서방향에서는 30 cm 거리에서 3개, 60, 90 cm에서 각각 1개체씩 검출되었고, 남동방향(30 cm)에서 1 개체, 남서방향에서는 30 cm에서 3개, 120 cm에서 1개체, 북 동방향(30, 90 cm)에서 각각 1개체씩 교잡 개체가 검출되었다 (Oh et al. 2017). 병저항성 GM 벼(OsCK1)와 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 유전자 이동성 실험에서 화분 수용체로 이 용된 모품종인 낙동벼의 교잡개체는 총 23개가 발생하였으며, 교잡개체들은 병저항성 GM 벼(OsCK1)와 해충저항성 Bt 벼 (Agb0101)에 근접한 2 m이내에서 교잡 개체가 발견되어 본 실험의 비타민A 강화벼(PAC)의 유전자 이동성 발생 개체들의 최대 거리와 유사하였다. 비록 병저항성 GM 벼(OsCK1)와 해 충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 다른 유전자가 도입된 벼이지만 동일한 모품종인 낙동벼에 대한 유전자 이동성 분석 시에 비 슷한 개화 성기의 포장내 풍향과 풍속에 따른 유전자 이동률 의 차이가 보여주는 결과들은 풍향과 풍속이 화분에 의한 유 전자 이동에 따른 교잡 개체의 발생 방향과 빈도에 영향을 주 는 환경 요인으로 사료되며, 병저항성 GM 벼(OsCK1)와 해충 저항성 Bt 벼(Agb0101)의 유전자 이동성 실험 기간 동안에 기상 관측시에 개화기간 중의 온도는 28~30°C와 습도는 80% 이상으로 관측되었으나, 개화 성기를 전후하여 내린 비로 저 온 다습한 환경이 화분에 의한 유전자 이동성에 영향을 주었 을 것으로 보여진다(Oh et al. 2014;Oh et al. 2017). 이는 벼 유전자 이동성의 환경 요인 중에서 개화시인 오전 10시에 서 오후 1시까지의 상대습도와 온도는 벼의 화분 및 화기 상 태의 변화를 초래하여 화분에 의한 교잡에 영향을 초래할 수 있다. 일반 재배품종 벼와 잡초성벼 간의 교잡률은 실험 조건 에 따라 약 0.04~2%로 발생한다고 보고되었다(Messeguer et al. 2004). 이는 해충저항성 또는 제초제 저항성 특성을 지닌 GM벼들에 의한 재배품종 및 잡초성 벼의 유전자 이동성이 발 생할 경우 슈퍼 잡초 생성 및 재배 품종으로 GM 유전자 오 염 확산 등으로 벼 경작지의 생태계에 영향을 미칠 수도 있으 나, 공시 재료로 이용된 비타민A 강화벼(PAC)는 기존에 보고 된 병저항성 GM 벼(OsCK1)와 해충저항성 Bt 벼(Agb0101) 에 비해 동일한 모품종인 낙동벼에서 유사하거나 낮은 교잡율 이 보였기에 유전자 이동성에 의한 농업생태계의 위험은 크지 않을 것으로 추정되며, 또한, 개화기가 차이가 있는 재배 품종 들에서는 화분에 의한 유전자 이동이 발생하지 않는 것으로 조사되었다. 그러나, 벼 재배지 내의 유전자 이동성에 대한 농 업생태계의 위해성 평가는 벼의 개화성기 중의 재배 지역의 기상 상태와 다양한 벼 품종들간의 개화기 차이 등의 변화에 따른 다년간의 유전자 이동성 평가와 과학적인 데이터 분석을 통한 체계적인 접근이 요구되며, 이를 기반으로 벼의 유전자 이동성 감축 기술 개발과 유전자 이동성의 모델링 통한 사전 예측과 관련된 연구가 수행되어야 할 것이다.

현재까지 GM작물은 식량위기 해소와 농약 사용량 최소 화에 따른 환경보호 및 경제적 이익 등의 이점에도 불구하 고 식품 안전성 및 경작지 주변 농업 환경 때문에 논쟁 중 이다(Bae et al. 2013). GM작물의 재배, 생산 및 이용 등 에 반대하는 측은 GM작물 재배에 따른 농업 환경 변화와 GM작물 식이에 의한 인간에 미치는 연구가 충분하지 않아 GM작물 안전성이 검증되지 않았다고 문제를 제기하고 있 다. 아직까지 대한민국에서는 GM벼를 포함한 생명공학 기 술을 이용한 GM작물이 상업적 재배를 하고 있지는 않지만 , 국내외적으로 수입 및 개발되는 GM작물로부터 유전자 이 동에 의한 슈퍼 잡초 발생, 종 다양성 영향 및 재배종의 유전자 오염 등의 문제를 야기할 수 있으며, GM작물로부터 유전자 이동성의 교잡율이 높지 않더라도 경작지 주변 생태 환경에 충분히 영향을 줄 수 있으므로, GM작물의 재배 시 에 발생될 수 있는 근연·재배종으로의 유전자 이동성을 억 제하고 최소화하는 안전 관리 매뉴얼과 대응 프로토콜의 개 발이 반드시 필요하다. 효율적인 GM벼의 유전자이동성평가 방법을 위한 GM벼 개화기에 따른 유전자 이동성 분석과 이를 통한 안전성평가 가이드라인 개발은 국내 생명공학작 물 연구에 있어 매우 유용한 항목이다. 이러한 유전자이동 성 평가를 위한 개화기 차이에 의한 유전자 이동성 검정은 기상 조건 및 화분 매개충 발생 유무 등 다양한 환경적 지 역적 변수가 포함되어야 하기 때문에 다양한 관련 연구가 지속적으로 수행되어야 한다. 본 실험 결과는 GM벼의 유전 자이동성 평가에 있어 개화기 차이로 인한 유전자 이동성 연구에 대한 기초 자료로 크게 활용될 것으로 기대한다.

적 요

GM작물은 세계적으로 재배면적이 지속적인 증가되고 있으 며, 이로 인한 GM작물의 잠재적인 환경위해성에 대한 우려도 증가되고 있다. 현재까지 국내에서 GM작물의 상업적 재배는 되고 있진 않지만 GM작물의 안전성 평가를 위한 기술 개발 은 크게 요구되고 있는 실정이다. 국내외적으로 다양한 GM작 물의 유전자이동성 평가가 수행되어왔으나 화분 공급원인 GM 벼의 개화기 차이에 의한 유전자 이동성 연구는 부족한 실정 이다. 본 연구에서는 벼의 개화기 차이에 따른 비타민A 강화 벼(PAC)로부터 모품종인 낙동벼와 중만생종인 일미벼, 조생종 인 운광벼, 중생종인 대보벼, 통일형인 세계진미벼로의 화분 매개에 의한 유전자 이동성을 평가하였다. 비타민A 강화벼 (PAC)의 도입 유전자를 검출하는 PCR 분석을 통해 유전자 이동성 유무를 최종적으로 검증하였다. 총 파종된 종자수에 대 한 교잡율은 개화기가 일치하는 낙동벼에서는 0.0007%, 개화 기가 차이가 있는 일미벼, 운광벼, 대보벼, 세계진미벼에서는 0%로 나타났으며, 모든 교잡개체들은 비타민A 강화벼(PAC)에 근접한 2m 내에서 발견되었다. 화분 매개에 의한 비타민A 강 화벼(PAC)의 유전자 이동 특성은 기존에 연구된 결과들과 비 슷한 결과를 보였으며, 벼 재배품종간의 개화기 차이가 화분 에 의한 교잡을 결정하는데 중요한 요인으로 작용하였다. 이 에 벼 경작지의 기상 조건과 벼 품종간의 개화시기 중복 여부 등이 GM벼에 의한 일반 재배품종 및 잡초성벼로의 유전자 이 동 최소화 기술 개발과 안전관리 기준 작성에서 주요 영향 요 소들로 고려해야 한다.

ACKNOWLEDGMENTS

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개 발사업(과제번호: PJ011867022018)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Figure

Fig. 1.

Schematic representation of the inserted PAC vector used for rice transformation. The arrows indicate gene specific primer (Table 1) sites and the direction of gene synthesis. PAC vector contained a recombinant gene, Psy-st2A-CrtI (Psy: phytoene synthase gene, st2A: sulfo-transferase 2A gene, CrtI: carotene desaturase gene, PAC). The remaining construct components had the same configuration, consist of the rice endosperm specific globulin promoter (Glb), transit peptide (TP), the 3’region of the potato proteinase inhibitor II gene (PinII) and the bar expression cassette containing a 35S promoter/bar gene coding region/3’region from the nopaline synthase gene (NOS). PAC entire expression cassette was flanked by a 5’ matrix attachment region (Mar) from the chicken lysozyme gene. RB: right border; LB: left border.

Fig. 2.

An experimental design for the field trial. The PAC (GM) rice was planted in white squares. Both Unkawng, Daebo, Nakdong-byeo, Saegyejinmi, and Ilmi were planted following by 8 different directions.

Fig. 3.

Variation of meteorological data during heading date. Windrose plot from direction and wind speed (A) and temperature and rainfall (B).

Fig. 4.

Confirmation of PAT(Phosphinothricin-acetyl-transferase) protein expression for hybrids between PAC rice and japonica non-GM rice (Nakdong-byeo) by using immunostrip. C: Nakdong-byeo, GM: PAC rice, NHY 1, 2: Nakdong × PAC hybrids.

Fig. 5.

Detection of hybrids between PAC rice and Nakdong. Three pairs of specific primers used to detect Bar gene, Psy gene, and rice genome for Nakdong × PAC hybrid rice. M: DNA marker, GM: PAC rice, C: Nakdong-byeo, NHY 1, 2: Nakdong × PAC hybrids.

Table

Table 1.

Comparisons of yield and yeild-associated characters in rice cultivars.

Table 2.

Primer sets used for gene flow confirmation.

Table 3.

Frequency of gene flow from the GM pollen donor and direction based on herbicide selection in Nakdong-byeo

Table 4.

Frequency of gene flow from the GM pollen donor and direction based on herbicide selection in Ilmi

Table 5.

Frequency of gene flow from the GM pollen donor and direction based on herbicide selection in Saegyejinmi

Table 6.

Frequency of gene flow from the GM pollen donor and direction based on herbicide selection in Unkawng

Table 7.

Frequency of gene flow from the GM pollen donor and direction based on herbicide selection in Daebo

Reference

Al-Ahmad, H. , and J. Gressel. 2006. Mitigation using tandem construct containing a selectively unfit gene precludes establishment of Brassica napus transgenes in hybrids and backcrosses with weedy Brassica rapa . Plant Biotech.4:23-33.
Bae, H.K. , M.M. Oo, J.E. Jeon, D.N. Tien, S.A. Oh, S.D. Oh, S.H. Kweon, M.Y. Eun, and S.K. Park. 2013. Evaluation of gene flow from GM to Non-GM rice . Plant Breeding and Biotech.1:162-170.
Baek, H.J. , S.I. Sohn, M.R. Cho, G.S. Lee, Y.J. Oh, J.S. Park, K.J. Lee, S.D. Oh, S.C. Suh, and T.H. Ryu. 2010. Development of protocol for analyzing pollinator insect-mediated gene transfer from gm crop . Korean J. Intl. Agri.22:293-297.
Baek, H.J. , S.Y. Won, J.K. Kim, S.I. Sohn, K. Lee, M.R. Cho, J.K. Song, M.S. Yoon, J. Lee, Y.M. Jin, and T.H. Ryu. 2008. Study on the gene introgression from GM Chinese cabbage to major crops in Cruciferae . Korean J. Intl. Agri.20:124-129.
Chen, L.J , D.S. Lee, Z.P. Song, H.S. Suh, and B.R. Lu. 2004. Gene flow from cultivated rice (Oryza sativa) to its weedy and wild relatives . Ann. Bot.93:67-73.
Conner, A. , T. Glare, and J. Nap. 2003. The release of genetically modified crops into the environment - Part II. Overview of ecological risk assessment . Plant J.33: 19-46.
Ellstrand, N. , H. Prentice, and J. Hancock. 1999. Gene flow and introgression from domesticated plants into their wild relatives . Annu. Rev. Ecol. Syst.30:539-563.
Gealy, D.R. , D.H. Mitten, and J.N. Rutger. 2003. Gene flow between red rice (Oryza sativa) and herbicide-resistant rice (O. sativa): implications for weed management . Weed Technol.17:627-645.
JamseC. 2018. Global status of commercialized biotech/GM crops: 2017, ISAAA BRIEF No. 53. ISAAA: Ithaca, NY.
KBCH. 2018. Stats of GM crops in Korea. KBCH, Daejeon, Korea.
Kim, C.G. , B. Lee, D.I. Kim, J.E. Park, H.J. Kim, K.W. Park, H. Yi, S.C. Jeong, W.K. Yoon, C.H. Harn, and H.M. Kim. 2008. Detection of gene flow from GM to non-GM watermelon in a field trial . J. Plant Bio.51:74-77.
Kim, C.G. , D.I. Kim, H.J. Kim, J.Y. Park, B. Lee, K.W. Park, S.C. Jeong, K.H. Cho, J.H. An, K.H. Cho, Y.S. Kim, and H.M. Kim. 2009a. Assessment of gene flow from genetically modified anthracnose-resistant chili pepper (Capsicum annuum L.) to a conventional crop . J. Plant Bio.52:251-258.
Kim, C.G. , K.W. Park, B. Lee, D.I. Kim, J.Y. Park, H.J. Kim, J.E. Park, J.H. An, K.H. Cho, S.C. Jeong, K.H. Choi, J.H. Harn, and H.M. Kim. 2009b. Gene flow from genetically modified to conventional chili pepper (Capsicum annuum L.) . Plant Sci.176:406-412.
Kim, K.U. , J.H. Lee, I.J. Lee, D.H. Shin, and S.U. Kim. 2004. Hybridization of LM(Living Modified) Rice with Weedy Rices . Kor. J. Weed Sci.24:51-55.
Kim, Y.J. , K.H. Nam, I.S. Pack, J.H. Park, S.C. Jeong, C.H. Harn, and C.G. Kim. 2014. Gene flow from GM cabbage to Non-GM control . CNU J. Agri. Sci.41:157-161.
Langevin, S.A. , K. Clay, and J.B. Grace. 1990. The incidence and effects of hybridization between cultivated rice and its related weed red rice (Oryza sativa L.) . Evolution.44:1000-1008.
Lee, B.C. , G. Kim, J.Y. Park, H. Yi, K.W. Park, S.C. Jeong, W.K. Yoon, J.H. An, K.H. Cho, and H.M. Kim. 2007. Survey of herbicide resistant oilseed rapes around the basin of rivers in Incheon harbor area . Korean J. Weed Sci.27:29-35.
Lee, B. , J.H. Kim, S.I. Sohn, S.J. Kweon, Y.S. Chung, and S.M. Lee. 2015. Influence of insect pollinators on gene transfer from GM to non-GM soybeans . Korean Journal of Agri. Sci.42:159-165.
Lee, B.K. , K.W. Park, C.G. Kim, H.G. Kang, H.J. Sun, Y.I. Kown, I.J. Song, T.H. Ryu, and H.Y. Lee. 2014. Environmental monitoring of herbicide tolerant genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica) around confined field trials . Weed and Turfgrass Sci.3:305-311.
Lee, B.K. , and S.C. Suh. 2011. A study on the trends and biosafety assessment of genetically modified crops . Research of Environ. Law.33:1-25.
Lee, Y.H. , K.S. Kim, Y.S. Jang, H.J. Cho, J.K. Bang, and S.J. Suh. 2009. Pollen-mediated gene flow from glufosinate resistant transgenic oilseed rape (Brassica napus L.) into its wild relatives . Korean J. Intl. Agri.21:193-198.
Messeguer, J. , C. Fogher, E. Guiderdoni, V. Marfa, M. Catala, G. Baldi, and E. Mele. 2001. Field assessments of gene flow from transgenic to cultivated rice (Oryza sativa L.) using a herbicide resistance gene as tracer marker . Theor. Appl. Genet.103:1151-1159.
Messeguer, J. , V. Marfa, M. Catala, E. Guiderdoni, and E. Mele. 2004. A field study of pollen-mediated gene flow from Mediterranean GM rice to conventional rice and the red rice weed . Mole.Breeding13:103-112.
OECD. 1999. Consensus document on the biology of Oryza sativa (Rice). Paris: Organization for Economic Cooperation and Development
Oh, S.D. , M.H. Lim, T.H. Ryu, S.I. Shon, S.Y. Park, and K.J. Lee. 2014. Assessment of gene flow in disease resistant (OsCK1) genetically modified rice . Korean J. of Breeding Sci.46:44-51.
Oh, S.D. , D.W. Yun, S.I. Shon, S.K. Park, and A.C. Chang. 2017. Assessment of gene flow from insect-resistant genetically modified rice (Agb0101) to non-GM rice . Korean J. Breeding Sci.49:180-189.
Owen, M.D.K. 2000. Current use of transgenic herbicide-resistant soybean and corn in the USA . Crop Pro.19:765-771.
Raybould, A. , and A. Gray. 1993. Genetically-modified crops and hybridization with wild Relatives - a Uk perspective . J. Appl. Ecol.30:199-219.
Shivrain, V.K. , N.R. Burgos, M.A. Sales, A. Mauromoustakos, D.R. Gealy, K.L. Smith, H.L. Black, and M. Jia. 2009. Factors affecting the outcrossing rate between Clearfield™ rice and red rice (Oryza sativa) . Weed Sci.57:394-403.
Song, Z.P. , B.R. Lu, and J.K. Chen. 2004. Pollen flow of cultivated rice measured under experimental conditions . Biodivers. Conserv.13:579-590.
Warwick, S.I. , H.J. Beckie, and L.M. Hall. 2009. Gene flow, invasiveness, and ecological impact of genetically modified crops. The Year in Evolutionary Biology 2009 : Annals of the New YorkAcademy of Sciences1168:72–99.