search
Contact Us
HOME

  • Crossref logo
  • Crossref Similarity Check logo
Journal Search Engine

to

Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agriculture Vol.31 No.1 pp.25-33
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2019.31.1.25

Development of Analytical Method for Valinamide Carbamate Fungicide Iprovalicarb Residue

Myoung-Gun Choung†
Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University, Samcheok 25949, Korea.
Corresponding author (Phone) +82-33-540-3321 (E-mail) cmg7004@kangwon.ac.kr
December 23, 2018 February 18, 2019 February 22, 2019

Abstract


This experiment was conducted to establish an analytical method for residues of iprovalicarb, as recently developed a valinamide carbamate fungicide showing effect on pathogens of the oomycetes, in crops using HPLC-UVD/MS for the official purpose. Iprovalicarb residue was extracted with acetonitrile from representative samples of five raw products which comprised apple, green pepper, Kimchi cabbage, hulled rice and soybean. The extract was diluted with large volume of saline water and directly partitioned into n-hexane/dichloromethane(20/80, v/v) to remove polar co-extractives in the aqueous phase. For the hulled rice and soybean samples, n-hexane/acetonitrile partition was additionally employed to remove non-polar lipids. The extract was finally purified by optimized florisil column chromatography. On an octadecylsilyl column in HPLC, iprovalicarb was successfully separated from coextractives of sample, and sensitively quantitated by ultraviolet absorption at 210 nm with no interference. Accuracy and precision of the proposed method was validated by the recovery experiment on every crop samples fortified with iprovalicarb at 3 concentration levels per crop in each triplication. Mean recoveries ranged from 87.5 to 101.6% in five representative agricultural commodities. The coefficients of variation were all less than 10%, irrespective of sample types and fortification levels. Limit of quantitation(LOQ) of iprovalicarb was 0.04 mg/kg as verified by the recovery experiment. A confirmatory method using LC/MS with selected-ion monitoring technique was also provided to clearly identify the suspected residue.


Iprovalicarb , HPLC-UVD/MS , Residue

Valinamide carbamate계 살균제 iprovalicarb의 잔류 분석법 개발

정 명근†
강원대학교 생약자원개발학과

초록

    서 언

    살균제 iprovalicarb [isopropyl [(1S)-2-methyl-1-[{(1RS)-1-p-tolylethyl} carbamoyl] propyl] carbamate ; Fig. 1]는 1988 년 Bayer사에 의해 처음 개발되어 1998년 인도네시아에서 최 초 사용 승인을 받았고, 이후 2000년에는 tolylfluanid와의 혼 합제제 형태로 독일에서 사용 승인을 받은 최초의 amino acid amide carbamate계 살균제이다(Kramer et al., 2012). 주로 포 도나무 노균병(Plasmopara vitacola) 및 감자역병(Phytophthora infestans)과 같은 난균강의 병원균에 효과를 보인다(Kramer et al., 2012).

    국내에서는 고추, 오이, 양파, 참외, 토마토, 포도, 배추, 수박, 감자 및 인삼 등 다양한 작물의 역병 및 노균병 방제에 fluopicolide와의 혼합제제 형태로 사용되며(Korea Crop Protection Association, 2015), 국내농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)은 0.1~5 mg/kg으로 설정되어 있다 (Ministry of Food and Drug Safety, 2017b).

    Iprovalicarb의 물리화학적 특성으로 n-octanol/water 분배계 수(Log Pow)는 3.2로 중간 극성인 화합물이고, 녹는점은 163~199°C이며, 분자량은 320.4(C18H28N2O3)로 백색에 가까운 분말 형태이다(European Food Safety Authority, 2015). 다양 한 유기용매에 잘 녹으며 (acetone 41.0 g, dichloromethane 132.0 g, ethyl acetate 20.0 g, acetonitrile 19.1 g, toluene 5.3 g/L), 물에 대한 용해도는 낮아 11.0 mg/L에 불과하다 (European Food Safety Authority, 2015).

    Iprovalicarb의 잔류분석은 gas chromatograph-ion trap-mass spectrometry(GC-IT-MS)를 이용한 분석법이 보고된 바 있 으나, 해당 분석법은 정제과정의 부재와 더불어 기기선정의 적절성이 떨어진다고 판단되며(Angioni et al., 2011), QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) 및 liquid chromatograph-tandem mass spectrometry (LCMS/ MS)를 이용한 분석도 이루어진 바 있으며, 이 방법의 경 우 성분의 잔류 유무를 판단하는 monitoring의 목적으로 분석 법이 개발된 것으로 개별 성분에 대한 분석조건 및 회수율은 검토되지 않았다(Tran et al., 2012). 한편, 국내에서는 식품공전 7.1.2.2 다종농약다성분 분석법 - 제2법에 gas chromatography/ electron capture detector(GC/ECD)를 이용한 분석법이 수재되 어 있으나, iprovalicarb는 이성체에 따라 증기압이 4.4×10-5 ~3.5×10-5 mPa(20°C) 범위로서 휘발성이 낮고 분자 내에 amide기를 2개 함유하고 있어 열분해 가능성이 극히 높으므로 재현성 있는 gas liquid chromatography(GLC) 분석이 어렵고, 실제 농산물을 대상으로 대상농약의 분석조건 확립 및 회수율 등이 정밀 검토된 결과는 제한된 실정이다.

    따라서 본 연구는 valinamide carbamate계 살균제인 iprovalicarb를 분석대상 성분으로 하여 다양한 농산물에 적용 가능하며 정확성 및 정밀성이 확보된 신규 단성분 분석체계를 확립하여 국내ㆍ외 농산물의 수출입 검역 시 잔류농약 검사의 기초 자료를 제공하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 시약 및 기구

    본 연구에 사용한 iprovalicarb의 분석용 표준품은 Sigma- Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 순도 98.7% 이상인 것을 구입하여 사용하였다. Iprovalicarb의 stock solution은 분석용 표준품을 acetonitrile에 녹여 1,000 mg/L의 농도가 되도록 조 제한 후 -20°C의 냉동고에 보관하였고, 필요 시 마다 acetonitrile로 재희석하여 사용하였다. J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)사에서 구입한 florisil(60~100 mesh)은 130°C에서 하룻밤 이상 가열하여 활성화 후 사용하였다(Ahn et al., 2014). Deionized water의 경우 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)사로부터 HPLC용을 구입하여 사용하였고, n-hexane, dichloromethane, acetonitrile 및 ethyl acetate는 잔류분석용, 기타 시약들은 시약특급 또는 잔류분석용을 사용하였다. 감압 농축은 Eyela NE-1000SW(Tokyo, Japan)를 이용하여 수행하 였으며, 농산물 시료의 균질화는 고속 호모게나이져(IKA, Ultra-Turrax T-25, Wilmington, NC, USA)를 사용하였다.

    2. 농산물 시료

    식품의 농약 잔류허용기준(Ministry of Food and Drug Safety, 2017b)에 iprovalicarb의 사용이 등록 되어있는 농산물 을 대상으로 국내 소비량을 고려하여 채소류는 배추 및 고추, 곡류는 현미, 두류는 콩, 과일류에서는 사과를 대표적 농산물 로 선정하였다(Lee et al., 2010). 유기농 인증을 받은 배추, 고추, 현미, 콩 및 사과의 무농약 시료를 지역의 대형마트에서 구입 후 식품공전 상의 검체 처리방법(Ministry of Food and Drug Safety, 2017a)에 의거하여 전처리하여 사용하였다. 대조 구는 잔류농약 검사를 수행하여 무농약 시료임을 확인한 후 사용하였다.

    3. HPLC-UVD/MS 기기분석 조건

    Iprovalicarb는 분자구조 내에 2개의 amide기를 포함하고 있 어 고온에서의 열분해 가능성이 있고, 휘발성이 낮은 특성으 로 인해 GLC 분석에 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 HPLC를 이용한 분석법을 검토하였으며, iprovalicarb는 분자구 조 내 장파장을 흡수하는 특이 발색단은 없으나 단파장에서의 강한 자외 흡광이 관찰되므로 검출기는 자외부흡광검출기(ultra violet detector; UVD)를 이용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 UVD를 장착한 Agilent 1200 series(Wilmington, DE, USA) 를 이용하였으며, 분리 및 분석용 column은 YMC-Pack Pro C18 RS(4.6×250 mm, 5 μm, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 잔류분의 재확인에는 Agilent 6110 Quadrupole liquid chromatograph mass spectrometry (LC/MS, Wilmington, DE, USA)를 사용하였으며, 각각의 분석조건은 표 1 및 2에 자세히 나타내었다.

    4. 표준검량선 및 분석정량한계(Limit of quantitation, LOQ)

    Iporvalicarb의 stock solution을 0.1~10 mg/L의 농도가 되도 록 각각 희석하여 표준용액을 조제하고, 각 20 μL를 HPLC에 주입, 분석하여 얻은 peak의 면적을 기준으로 표준검량선을 작 성하였다. 또한, 분석기기의 재현성(reproducibility)을 확인하기 위해 0.5 mg/L 수준의 iprovalicarb의 표준용액을 15회 연속 HPLC에 주입 후 크로마토그램에서 머무름시간(retention time, tR) 및 peak 면적(peak area)의 변이를 비교, 평가하였다.

    분석법의 정량한계는 무농약 시료로부터 간섭물질이 존재하 지 않음을 확인한 뒤 분석기기의 정량한계 및 시료량, 분석과 정 중 농축배율을 계상하여 아래의 계산식으로 산출하였고 (Ahn et al., 2014), iprovalicarb를 무농약 시료에 처리한 후 각 처리 농도별 회수율을 검토하였다.

    정량한계(mg/kg)   =   [[기기 정량한계(ng)   /   주입량(μL)] ×   [시료용액(mL)   /   시료량(g)]

    5. Iporvalicarb의 추출 및 분배

    농산물 시료 25 g에 acetonitrile을 100 mL 가한 후(콩 및 현미 시료의 경우 추출 30분 전 미리 20 mL의 증류수를 가 하여 습윤화 함) 호모게나이져를 이용하여 2분 동안 고속 마 쇄(12,000 rpm), 추출하였다. 추출물은 여과지(Toyo No. 6, Japan)가 장착되어 있는 부흐너 깔때기에서 감압 여과하고, acetonitrile 40 mL로 세척한 시료 및 호모게나이져 컵의 세척 액은 앞서의 여과액과 합쳤다. 합한 추출 및 여과액을 1 L 용량의 분액깔때기에 옮긴 후 포화식염수 50 mL 및 증류수 450 mL를 첨가하고 n-hexane/dichloromethane(20/80, v/v) 100 mL로 분배 추출하였으며, 정치하여 분액깔때기 아래의 n-hexane/ dichloromethane 층만을 취해 무수황산나트륨에 통과시 켜 탈수한 뒤 40°C의 수욕 상에서 감압 농축하여 건고하였다. 현미 및 콩을 제외한 농산물 시료의 잔류물들은 n-hexane 10 mL에 재용해하여 florisil 흡착 크로마토그래피에 직접 공시하 였다. 현미 및 콩 시료의 경우 잔류물을 acetonitrile로 미리 포화시킨 n-hexane 40 mL에 재용해하여 250 mL 용량의 분 액깔때기에 옮기고 n-hexane으로 미리 포화시켜둔 acetonitrile 40 mL로 2회 분배하여 추출하였다. 합친 acetonitrile 추출액 을 40°C에서 감압 농축, 건고하고 잔류물을 n-hexane 10 mL 에 재용해하여 florisil 흡착 크로마토그래피에 공시하였다.

    6. Florisil 흡착 크로마토그래피

    130°C에서 하룻밤 이상 가열한 후 활성화시킨 florisil 10 g 을 내경 1.5 cm, 길이 40 cm인 유리 칼럼에 건식 충전하고, 상단에 3 g의 무수황산나트륨을 첨가하였다. 칼럼에 n-hexane 50 mL를 가하여 충전제 위에 소량의 n-hexane이 남을 정도로 유출시켜 버린 후 n-hexane 10 mL에 용해한 시료 용액을 가 하여 약 3 mL/min의 유속으로 용출시켰다. 충전제의 표면이 노출되기 않게 다시 n-hexane/ethyl acetate(85/15, v/v) 100 mL를 용출시켜 버리고 재차 n-hexane/ethyl acetate(70/30, v/v) 150 mL를 용출시켜 iprovalicarb 성분을 회수하였다. Iprovalicarb가 용출된 분획은 40°C의 수욕상에서 감압 농축, 건고하고 잔류물을 acetonitrile 10 mL에 재용해하여 HPLC로 분석하였다.

    7. 대표 농산물에 대한 iprovalicarb의 회수율 시험

    본 연구에서 확립한 iprovalicarb의 잔류분석법의 신뢰성 및 분석 효율을 검증하기 위하여 실제 농산물 시료를 이용한 회 수율 시험을 수행하였다. 즉, 마쇄한 각각의 대표 농산물 무농 약 시료 25 g에 정량한계, 정량한계의 10배 및 50배가 되도록 iprovalicarb 표준용액을 3반복씩 처리한 후 상기의 분석과정을 수행하여 회수율과 분석오차를 측정하였다.

    결과 및 고찰

    1. HPLC 분석조건 확립

    Iprovalicarb 분석 시 최적의 HPLC 분석파장을 선정하기 위 하여 acetonitrile에 용해한 5 mg/L 수준의 표준용액을 on-line HPLC/DAD에 주입하여 190~400 nm 범위에서 최대흡수파장 (λmax)을 확인하였다. 관찰된 흡수파장은 194 nm에서 흡광계 수가 가장 높아 분석 감도가 가장 높게 관찰되었으나 시료와 함께 추출되는 메트릭스 성분에 대한 흡광 및 용매의 자외선 흡광(UV cut-off)이 예상되므로 상대적으로 시료의 추출물과 이동상 용매에 의한 간섭 정도가 낮아 iprovalicarb 분석 시 선택성이 194 nm 대비 우수할 것으로 예상되는 210 nm를 검 출파장으로 설정하였다(Fig. 2).

    HPLC 분석 시 column은 C18계열의 YMC-Pack Pro C18 RS(4.6×250 mm, 5 μm, Waters, Milford, MA, USA)를 이 용하였다. 이동상 중 acetonitrile의 농도를 달리하여 머무름시 간 및 peak의 이론단수 등을 검토한 결과, acetonitrile/water (60/40, v/v) 혼합용액의 등용매용리 (isocratic) 조건이 분리도 및 머무름시간 측면에서 가장 적합한 양상을 나타내었으며(Fig. 3), 이때 iprovalicarb 성분의 머무름시간은 약 7.3분이었다.

    Iprovalicarb는 분자 내에 2개의 chiral carbon을 가지고 있어 총 2쌍의 enantiomer가 존재 가능하나, 이 중 N-2- methylpropyl chain의 1번 carbon은 S-configuration이며, 유효 성분은(S,R)- 및 (S,S)-diastereoisomer의 1:1 혼합물로 사용되 며, 잔류물도 두 isomer들의 총합으로 평가한다. 본 실험의 HPLC 분석 결과 iprovalicarb는 별도의 이온억압제 없이 acetonitrile/water 혼합액을 isocratic 조건으로 사용하여도 샤프 한 대칭형 peak로 나타남을 알 수 있고, 상기 제시한 HPLC 조건에서 iprovalicarb의 isomer들은 그 극성이 매우 유사하여 분리되지 않고 하나의 peak로 관찰됨을 알 수 있다.

    분석기기의 정량한계란 크로마토그램에서 peak로 나타난 대 상 성분의 정량적 결과에 신뢰성을 부여할 수 있는 한계농도 로서, 크로마토그램에서 검출된 peak의 signal/noise(S/N) 비가 최소 10 이상인 성분의 농도를 의미한다(Armbruster et al., 1994;Fong et al., 1999;Miller, 2005). 상기에서 확립한 HPLC 분석조건(Table 1)으로 iprovalicarb 표준용액을 분석한 후 S/N 비를 계산한 결과, 분석기기의 정량한계(S/N≥10)는 2 ng 이었다.

    한편, 안정적인 기기분석 여부의 평가를 위해 0.5 mg/L의 표준용액을 15번 연속 주입, 분석하여 얻은 머무름시간 및 peak 면적의 변이계수(CV, %)를 확인하여 재현성을 평가한 결 과, 두 가지 척도 모두에서 최대 1.13%의 오차를 나타내어 기기분석 시 재현성 있고 안정적인 분석이 가능함을 확인하였 다(Table 3).

    한편, 0.1~10 mg/L의 농도가 되도록 조제한 iprovalicarb의 표준용액을 각각 20 μL씩 HPLC에 주입, 분석하여 얻은 검량 선의 회귀방정식은 y = 40.0144x + 0.3188(R2=0.999**)로 나타 나 우수한 직선성을 나타내었다(Fig. 4). 즉, iprovalicarb는 기 기정량한계 수준인 2 ng에서 그 100배인 200 ng까지의 표준 검량선에 대한 회귀계수가 R2=0.999** 이상으로 정량의 직선 성이 확인되었으므로, 광범위한 범위의 농도에서 시료 내 잔 류량을 비례적으로 산출하는 것이 가능하였다.

    2. 시료 중 iprovalicarb의 추출 및 분배과정의 확립

    농산물 시료의 iprovalicarb 추출은 acetonitrile을 이용하여 추출하였다. Acetonitrile은 비극성 및 중간극성 농약의 추출에 흔히 사용되는 표준적 용매로써 이미 수많은 연구자들에 의해 농약 추출에 대한 효율성 및 재현성이 인정된 바 있다. 농산 물 추출액에서 대상 성분 외에 추가적으로 함께 추출되는 방 해물질을 제거하기 위한 1차적 조정제법으로는 액-액 분배법 을 적용하였다. 즉, 수용성의 유기용매 추출액에 다량의 증류 수와 포화식염수를 첨가하여 희석한 뒤 비극성 유기용매로 직 접 분배 및 추출하는 방법을 사용하였으며, 이는 US FDA법 이나 AOAC법에서 중간~비극성 농약 성분에 대해 보편적으 로 사용하는 방법이며, 번거로운 추출액 농축과정을 생략할 수 있다는 장점이 있다(AOAC, 2000;Lee et al., 2008).

    액-액 분배법의 분배용매로는 n-hexane, dichloromethane 및 2종의 n-hexane/dichloromethane 혼합액을 포함하여 총 4종을 공시하여(Lee et al., 2011), 대상 성분에 대한 분배효율을 검 토하였다(Table 4). 액-액 분배조건에 의한 대상 성분의 분배 효율을 검토한 결과, 100 mL의 n-hexane으로 분배하였을 때 iprovalicarb의 회수율은 62.7% 수준이었으며, 100 mL의 n-hexane/ dichloromethane(80/20, v/v)으로 분배하였을 때 94.5%, 100 mL의 n-hexane/dichloromethane(20/80, v/v)으로 분배하 였을 때 100.3%의 회수율을 나타내어 전량 회수되는 양상을 보였다. 분배용매 극성의 강도를 높여 dichloromethane 50 mL로 2회 반복하여 분배하여도 회수율은 100.7%로 회수율 향상 효과는 없었으며, 오히려 극성 메트릭스 혼입의 우려가 있을 것으로 판단되었다. 따라서 회수율과 작업자의 편의성 등 을 고려하여 가장 적합하다고 판단되는 100 mL의 n-hexane/ dichloromethane(20/80, v/v)으로 분배하는 조건(분배용매 III)을 iprovalicarb의 분배용매로 선정하였다.

    n-Hexane/dichloromethane(20/80, v/v) 100 mL를 이용한 액-액 분배과정을 통해 시료 내 포함되어 있는 상당 부분의 극성물질과 기타 방해물질 등이 제거되었으리라 예상되나, 유 지성분은 n-hexane/dichloromethane(20/80, v/v)층으로 분배되 므로 제거되지 않는다. 유지성분은 기기분석 수행 시 유발되 는 치명적 간섭, 분리용 column의 분리능 저하 및 기준선의 심각한 변화(baseline shift and drift) 등의 문제로 인해 반드 시 제거되어야 할 간섭물질이다. 대상 농산물 중 현미와 콩은 유지성분이 약 1~3% 및 20% 수준으로 포함되어 있는 시료 들로써 유지성분 제거를 위하여 n-hexane/acetonitrile 분배법을 추가하였다(US FDA, 1999;AOAC, 2000).

    Table 5에 나타낸 바와 같이 n-hexane으로 미리 포화시킨 acetonitrile로 2회 분배하였을 시 iprovalicarb의 회수율이 100.4%로 전량 회수 가능하였으므로, 유지성분 및 비극성 간 섭물질 제거를 위한 n-hexane/acetonitrile 분배법은 분배조건 I 로 설정하였다. 한편, 유지성분이 0.1~0.4% 함유되어 있어 비 유지 시료로 분류되는 사과, 고추 및 배추 시료에 대해서는 제거되는 비극성 불순물과 유지성분의 양이 극히 작고, 크로 마토그램 상에서 정제의 정도 또한 미미하였으므로 n-hexane/ acetonitrile 액-액 분배과정을 생략하였다.

    3. Florisil 흡착 크로마토그래피 정제조건의 최적화

    농산물 중 iprovalicarb의 잔류분석 시 상기의 액-액 분배와 n-hexane/acetonitrile 분배과정으로 인해 대부분의 불순물 및 비극성 간섭물질이 제거되었으리라 판단되지만 여전히 각각의 농산물 시료에 따라 유래되는 상이한 기타 불순물들이 존재하 므로, 정제과정의 필요성이 요구되어 흡착크로마토그래피에 의 한 정제법을 추가로 검토하였다.

    흡착크로마토그래피는 잔류농약 분석 시 정제과정에 가장 많이 이용되는 방법으로서, 흡착제로는 silica gel, florisil 및 alumina 등이 가장 많이 이용된다. 그 중 florisil은 지방성분과 색소의 제거에 뛰어난 특성으로 인해 미국의 FDA(1999)나 AOAC(2000) 등에서 가장 보편적으로 사용하는 방법이다. 본 연구에서도 iprovalicarb의 극성을 감안하여 florisil을 사용하였 으며, 용매의 극성조절을 위해 n-hexane/ethyl acetate의 용매 체계를 이용하여 최적화 하였다(Table 6). 극성을 다양하게 조 절한 florisil 흡착크로마토그래피용 용매체계를 이용하여 iprovalicarb의 회수율을 검토한 결과, n-hexane/ethyl acetate (85/15, v/v) 100mL로 pre-washing한 후, n-hexane/ethyl acetate (70/30, v/v) 150 mL로 용출할 경우 iprovalicarb의 회수율이 96.4%로 검토한 용매체계 중 가장 우수한 회수율을 나타내었 으므로 florisil 흡착크로마토그래피법을 이용한 간섭물질 제거 를 위한 추가적인 정제법은 상기의 방법과 같이 적용하였다.

    4. 농산물 시료 중 iprovalicarb의 분석 정량한계 및 회수율

    Fig. 5는 본 연구에서 확립한 시료의 추출 및 정제, 기기분 석을 포함하는 일련의 과정을 농산물 시료에 적용한 결과이다. 최종의 무농약 농산물 시료용액에서 대상농약과 동일한 머무 름 시간대에 간섭물질이 존재하지 않음을 확인하였고, 분석기 기의 정량한계(LOQ)와 시료량 및 분석과정 중의 농축배율을 계상하여 본 분석법의 정량한계를 산출하였다.

    본 연구에 의해 산출된 iprovalicarb의 정량한계는 0.04mg/kg 이었으며, 국제기준인 Codex Alimentarius Commission(2003) 와 식품공전 잔류농약분석법 실무 해설서(Lee, 2017)에서 제 안하는 잔류농약 분석법 기준인 0.05 mg/kg 이하 또는 허용 기준의 1/2 이하의 정량한계 기준을 만족하였다.

    각 대표 농산물의 무처리 시료에 정량한계, 정량한계의 10 배 및 50배의 농도가 되도록 iprovalicarb 표준용액을 첨가하 고, 상기에서 확립한 분석방법에 따라 대표 농산물을 각 3반 복으로 분석하여 회수율을 조사한 결과, 정량한계 수준에서는 87.5~101.6%, 정량한계 10배 수준에서는 87.8~96.9%, 정량한 계 50배 수준에서는 88.8~95.0%의 양호한 회수율을 나타내었 고, 분석오차는 최대 7.7%로 조사되어 재현성 역시 양호한 양 상을 나타내었다. 따라서 처리농도 수준과 농산물 시료의 종 류에 상관없이 회수율 70~120% 범위와 분석오차 10% 이내 의 잔류분석 기준을 만족하는 결과를 도출하였다(Table 7).

    이상의 결과를 볼 때, 본 연구에서 확립한 iprovalicarb의 잔류분석법은 국내·외 농산물의 잔류농약 검사에 충분히 적용 가능함을 확인하였다.

    5. LC/MS를 이용한 잔류분의 재확인

    최종 확립한 분석법의 신뢰성을 확보하고자 LC/MS를 이용 하여 재확인 과정을 추가하였다. LC/MS 분석 시 대상 성분의 분자구조로부터 유도되는 분자이온과 주요 fragment ion을 확 인함으로써 보다 신뢰성 있는 정성적 확인이 가능하다는 장점 이 있다(Kwon et al., 2008).

    Iprovalicarb의 이온화 향상을 위해 HPLC 분석에 이용된 이 동상 용매 가운데 증류수에 10mM ammonium acetate를 첨 가하여 분석을 실시하였고, total-ion chromatogram(TIC; Fig. 6) 및 mass spectrum(Fig. 7)으로부터 iprovalicarb는 electrospray ionization(ESI) positive ion 조건에서 용이하게 protonation 되어 [M+H]+인 m/z=321.2 ion을 형성함을 확인할 수 있다. 본 연구에서는 iprovalicarb의 [M+H]+ peak가 base peak로 나타나므로 selected-ion monitoring(SIM)용 ion으로는 [M+H]+ 인 m/z=321.2 ion만을 이용하여도 충분히 정성적 확인이 가능 하였다(Ardrey, 2003;McLafferty and Turecek, 1993).

    Fig. 8은 본 연구에 사용된 대표적 농산물 시료 중 현미를 대 상으로 iprovalicarb의 잔류분을 재확인한 SIM chromatogram이 며, 본 연구에서의 모든 농산물 무처리 시료에서는 대상 농약 성분과 동일한 머무름 시간대에 peak가 전혀 관찰되지 않았고, 인위 첨가된 시료에서는 동일한 머무름 시간대에 iprovalicarb 의 잔류분만을 정확하게 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에 서 확립한 LC/MS/SIM조건을 이용할 경우에도 HPLC-UVD를 이용한 정량법과 더불어 iprovalicarb 잔류분의 추가적 정성분 석법으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

    적 요

    본 연구에서는 HPLC-UVD/MS를 이용하여 농산물 중 valinamide carbamate계 살균제 iprovalicarb의 잔류 분석법을 확립하였다. 대표 농산물은 사과, 고추, 배추, 현미 및 콩을 선 정하였고, acetonitrile를 이용하여 추출한 iprovalicarb는 n-hexane/ dichloromethane(20/80, v/v) 혼합용매를 이용한 액-액 분배법과 florisil 흡착크로마토그래피법으로 정제하여 HPLCUVD/ MS의 분석시료로 사용하였다. Iprovalicarb의 정량분석을 위한 최적 HPLC-UVD 분석 조건을 확립하였으며, 정량한계 (LOQ)는 0.04 mg/kg 이었다. 각 대표 농산물에 대한 정량한 계, 정량한계의 10배 및 50배 수준에서 회수율을 검토한 결과, 모든 처리농도에서 87.5~101.6% 수준의 회수율을 나타내었고, 반복 간 변이계수(CV)는 최대 7.7%를 나타내어 잔류분석 기 준인 회수율 70~120% 및 분석오차 10% 이내를 충족시키는 만족한 결과를 도출하였으며, LC/MS/SIM을 이용하여 실제 농 산물 시료에 적용하여 재확인 하였다. 이상의 결과로 신규 iprovalicarb의 HPLC-UVD/MS 분석법은 국내·외 농산물 잔류 농약 검사 시 검출한계, 회수율 및 분석오차 면에서 국제적 분석기준을 만족하는 신뢰성이 확보된 정량 분석법으로 사용 가능할 것이다.

    Figure

    KSIA-31-1-25_F1.gif

    Chemical structure of iprovalicarb.

    KSIA-31-1-25_F2.gif

    UV absorption spectrum of iprovalicarb.

    KSIA-31-1-25_F3.gif

    Chromatogram of iprovalicarb standard solution. (20 μL of 0.1 mg/L in acetonitrile).

    KSIA-31-1-25_F4.gif

    Calibration curve of iprovalicarb using HPLC.

    KSIA-31-1-25_F5.gif

    HPLC chromatograms of typical agricultural commodity extracts for the analysis of iprovalicarb.

    KSIA-31-1-25_F6.gif

    Total-ion chromatogram(TIC) of iprovalicarb using LC/MS.

    KSIA-31-1-25_F7.gif

    ESI(positive ion) mass spectrum of iprovalicarb.

    KSIA-31-1-25_F8.gif

    SIM chromatograms of hulled rice extract for the confirmation of iprovalicarb.

    Table

    HPLC-UVD operating parameters for the analysis of iprovalicarb

    Reproducibility of peak area and retention time of iprovalicarb using HPLC-UVD

    Efficiency of liquid-liquid partition of crude extract by different solvents for iprovalicarb

    Efficiency of n-hexane/acetonitrile partition for iprovalicarb

    Elution profile of iprovalicarb on florisil column chromatography

    Recovery rates of iprovalicarb with different agricultural commodity samples

    Reference

    1. Ahn, K.G. , Kim, G.H. , Kim, G.P., Kim, M.J., Hwang, Y.S., Hong, S.B., Lee, Y.D., & Choung, M.G. 2014. Determination of amisulbrom residues in agricultural commodities using HPLC-UVD/MS, Korean Journal of Pesticide Science 18(4): 321-329.
    2. Angioni, A. , Dedola, F. , Garau, V.L., Schirra, M., & Caboni, P. 2011. Fate of Iprovalicarb, Indoxacarb, and Boscalid Residues in Grapes and Wine by GC-ITMS Analysis, Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 6806-6812.
    3. AOAC. 2000. Pesticide and industrial chemical residues, In Official method of analysis, pp. 1-88. 17th ed. Arlington, USA.
    4. Ardrey, R.E. 2003. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, pp. 98-122, West Sussex, UK.
    5. Armbruster, D.A. , Tillman, M.D. , & Hubbs, L.M. 1994. Limit of detection (LQD)/limit of quantitation (LOQ): comparison of the empirical and the statistical methods exemplified with GC-MS assays of abused drugs, Clinical Chemistry 40: 1233-1238.
    6. Codex Alimentarius Commission. 2003. Guidelines on Good Laboratory Practice in Residue Analysis. CAC/GL 40-1993, Rev.1-2003, Rome, Italy.
    7. European Food Safety Authority. 2015. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance iprovalicarb, pp. 21-22, Parma, Italy.
    8. Fong, W.G , Moye, H.A. , Seiber, J.N., & Toth, J.P. 1999. Pesticide Residues in Food: Methods, Technologies and Regulations, pp. 3-4, 40-44, Canada.
    9. Korea Crop Protection Association. 2015. Using guideline of crop protection agents, p. 364, Seoul, Korea.
    10. Kramer, W. , Schimer, U. , Jeschke, P., & Witschel, M. 2012. Modern crop protection compounds, pp. 813-814. 2nd ed. Hong Kong.
    11. Kwon, C. H. , Chang, M.I. , Im, M.H., Choi, H., Jung, D.I., Lee, S.C., Yu, J.Y., Lee, Y.D., Lee, J.O., & Hong, M.K. 2008. Determination of mandipropamid residues in agricultural commodities using high-performance liquid chromatography with mass spectrometry, Analytical Science & Technoligy 21(6): 518-525.
    12. Lee, J.H. , Park, H.W. , Keum, Y.S., Kwon, C.H., Lee, Y.D., & Kim, J.H. 2008. Dissipation pattern of boscalid in cucumber under greenhouse condition, Korean Journal of Pesticide Science 12(1): 67-73.
    13. Lee, S.J. , Hwang, Y.S. , Kim, Y.H., Kwon, C.H., Do, J.A., Im, M.H., Lee, Y.D., & Choung, M.G. 2010. Determination of captan, folpet, captafol and chlorothanonil residues in agricultural commodities using GC-ECD/MS, Korean Journal of Environmental Agriculture 29(2): 165-175.
    14. Lee, S.J. , Kim, Y.H. , Song, L.S., & Choung, M.G. 2010. Determination of ametryn residue in agricultural commodities using HPLCUVD/MS, Korean Journal of Pesticide Science 15(2): 125-133.
    15. Lee, Y.D. 2017. Pesticide Analytical Residues Manual in Food Code. Ministry of Food and Drug Safety, Seoul, Korea.
    16. McLafferty, F.W ., & Turecek, F. 1993. Interpretation of mass spectra. pp. 19-50. 4th ed. Sausalito, CA, USA.
    17. Miller, J.M. 2005. Chromatography : Concepts and Contrasts. pp. 286-287. 2nd ed. USA.
    18. Ministry of Food and Drug Safety. 2017a. Korea Food Code, pp. 10-4-340-10-4-342, Seoul, Korea.
    19. Ministry of Food and Drug Safety. 2017b. MRLs for Pesticides in Foods, pp. 141-142, Seoul, Korea.
    20. Park, S.Y. , Jung, J.K. , Kang, J.M., Kim, S.H., Yang, J.Y., Kang, S.A., Chun, H.K., & Park, K.Y. 2009. Monitoring of 160 kinds of pesticide residues in commercial baechu (Chinese) cabbage throughout the year. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 38(7): 970-975.
    21. Tran, K. , Eide, D. , Nickols, S.M., Cromer, M.R., & Sabaa-srur, A. 2012. Finding of pesticides in fashionable fruit juices by LC–MS/ MS and GC–MS/MS, Food Chemistry 134: 2398-2405.
    22. US FDA. 1999. Pesticide Analytical Manual, Vol 1: Multi-residue Methods (3rd ed.), US Food and Drug Administration, USA.
    Copyright © The Korean Society of International Agriculture. All rights reserved.
    Rural Development Administration Bldg., 300 Nongsaengmyeong-ro, Wansan-gu, Jeonju 54875, Republic of Korea