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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.31 No.2 pp.150-163
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2019.31.2.150

Simultaneous Analysis of Eight Kinds of Organophosphorus Pesticides for Inspection of Residual Pesticides in Import-Export Agricultural Products

Myoung-Gun Choung
Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University, Samcheok 25949, Korea.
Corresponding author (Phone) +82-33-540-3321 (E-mail) cmg7004@kangwon.ac.kr
March 29, 2019 May 14, 2019 May 17, 2019

Abstract


This experiment was conducted to establish a simultaneous analytical method for 8 kinds of organophosphorus pesticides of 3 different purposes with similar physicochemical characteristics as insecticide(chlorpyrifos-methyl, mecarbam, parathion- methyl, phenthoate, prothiofos and tebupirimfos), fungicide(iprobenfos), and herbicide (anilofos) in crops using GC-NPD/MS. All the pesticides residues were extracted with acetone from representative samples of five raw products which comprised mandarin, green pepper, kimchi cabbage, hulled rice and soybean. The extract was diluted with large volume of saline water and directly partitioned into n-hexane to remove polar co-extractives in the aqueous phase. For the hulled rice and soybean samples, n-hexane/acetonitrile partition was additionally employed to remove non-polar lipids. The extract was finally purified by optimized florisil column chromatography. The analytes were separated and quantitated by GLC with NPD using a DB-17 capillary column. Accuracy and precision of the proposed method was validated by the recovery experiment on every crop samples fortified with anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos and tebupirimfos at 3 concentration levels per crop in each triplication. Mean recoveries ranged from 80.5 to 105.0% in five representative agricultural commodities. The coefficients of variation were all less than 10%, irrespective of sample types and fortification levels. Limit of quantitation(LOQ) of the analytes were 0.004(tebupirimfos, chlorpyrifos-methyl and parathion-methyl) and 0.008(iprobenfos, mecarbam, prothiofos, phenthoate and anilofos) mg/kg as verified by the recovery experiment. A confirmatory technique using GC/MS with selected-ion monitoring was also provided to clearly identify the suspected residues. Therefore, this analytical method was reproducible and sensitive enough to determine the residues of anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos, and tebupirimfos in import-export agricultural products.



수출입 농산물의 잔류농약 검사를 위한 유기인계 농약 8종의 동시 분석

정 명근
강원대학교 생약자원개발학과

초록


    서 언

    최근 작물생산의 중요성이 증대되면서 농약의 사용은 각종 병해충 및 잡초로부터 작물을 보호하고 작물의 생산성 향상과 동시에 방제시간을 단축하여 노동력 및 생산비용 감소의 효과 를 가져왔다(Lee et al., 2012). 이처럼 농약은 현대의 식량안보 위기 속에서 필수적이고, 지속적인 생산성 향상을 위해 사용이 불가피한 실정이다(Rural Development Administration, 2000).

    그 중 유기인계 농약은 과거에 사용된 유기염소계 농약의 대안으로 간주되어 국내뿐만 아니라 여러 나라에서 사용량이 증가하던 추세였으나, 최근 사용량이 급격하게 감소하고 있는 양상이다. 일반적으로 곤충의 신경에 작용하는 살충제의 형태 가 많고, 잔류성이 작으며 체내에서 잘 분해되어 배출되는 반 면, 포유동물에 대한 급성독성은 매우 큰 편이다(Sim et al., 2009). 유기인계 농약은 신경계에 존재하는 acetyl-cholinesterase 를 저해함으로써 신경계에 acetylcolin을 축적시켜 오심, 구토, 무기력 및 피로와 같은 증상을 유발하는 공통적인 독성기전을 가지고 있다(Janssen, 1997;Lee, 2003).

    본 연구는 국내 식품공전 다종농약다성분 분석법 제2법 (7.1.2.2)에 수록된 gas chromatograpy(GC) 분석 대상 농약 201종 중 일상분석 시 다성분 분석의 특성 상 분리능이 열등 하고, 분석 재현성 부족 및 검출기의 최적화가 미비하다고 판 단되는 유기인계 농약을 대상으로 살충제로 사용되는 chlorpyrifos-methyl, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos, 살균제로 사용되는 iprobenfos 및 제초제로 사용되는 anilofos를 포함하여 물리화학적 특성이 유 사한 8종의 유기인계 농약을 대상으로 하여 국내외 수출입 농 산물의 잔류농약 검사에 사용가능한 동시 분석법을 개발하고 자 하였다(Fig. 1).

    분석대상 유기인계 농약 중 살충제에 해당하는 chlorpyrifosmethyl, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos는 공통적으로 흡즙 및 저작성 해충의 박멸에 사용되며, 벼, 과수 및 채소 등 다양한 작물의 잎나방벌레, 흡 즙곤충, 가루이, 총채벌레목, 매미충 및 벼멸구 등을 방제하는 데에도 널리 사용되는 침투성 살충제이다(Roberts and Hutson, 1999). 이 중 chlorpyfos-methyl은 곡물 저장이나 종 자 처리 시 주로 사용되고, 거짓쌀도둑거저리를 포함하는 딱 정벌레목과 쌀 바구미, 나방 및 밀웜으로부터 곡물을 보호하 고 방제하는 목적으로 사용된다(US EPA, 2000). 한편 살균제 인 iprobenfos는 균류의 인지질 합성을 억제함으로써 살균효과 를 발휘하며, 벼 줄기의 부패 및 마름병과 잎 및 이삭의 도열 병을 효과적으로 치료 및 예방하고, 제초제인 anilofos는 뿌리 를 통해 흡수되며, 이앙 후 벼 포장의 사초과 및 한해살이 잡 초를 제거하는 데 사용된다(Roberts and Hutson, 1999). 국내 에서는 벼, 귀리, 메밀, 밀, 수수, 옥수수, 포도, 배, 토마토, 자 두, 딸기, 살구, 배추, 가지, 감자, 오이, 버섯류, 고추, 당근, 마늘, 피망, 파, 상추, 생강, 파 대두, 완두콩 및 해바라기 등 매우 다양한 작물에 사용이 등록되어 있으며, 대상농약 8종에 대한 국내 농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)은 0.01~1.0 mg/kg 범위로 설정되어 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2017b).

    Anilofos[S-4-chloro-N-isopropylcarbaniloylmethyl O,O-dimethyl phosphorodithioate], chlorpyrifos-methyl [O,O-dimethyl O-(3,5,6-trichloro-2-pyridinyl) phosphorothioate], iprobenfos[S-benzyl O,O-diisopropyl phosphorothioate], mecarbam[S-(N-ethoxycarbonyl-N-methylcarbamoylmethyl) O,O-diethyl phosphorodithioate], parathion-methyl [O,O-dimethyl O-4-nitrophenyl phosphorothioate], phenthoate[S-α-ethoxycarbonylbenzyl O,O-dimethyl phosphorodithioate], prothiofos[(RS)-(O-2,4-dichlorophenyl O-ethyl S-propyl phosphorodithioate)] 및 tebupirimfos[(RS)-{O-(2-tert-butylpyrimidin-5-yl) O-ethyl O-isopropyl phosphorothioate}]의 물리화학적 특성을 살펴보면, 대상농약 8종은 모두 일상적 조건에서 해리하지 않는 중성 화 합물로 n-octanol/water 분배계수(Log Pow)는 3.0~5.7 범위의 중간 혹은 비극성 성분들이다. 증기압이 0.2~12.2 mPa 범위로 gas-liquid chromatography(GLC) 분석이 가능한 충분한 휘발성 을 갖고 있으며, parathion-methyl(55 mg/L) 및 tebupirimfos (5,500 mg/L)를 제외한 기타 대상성분은 공통적으로 물에 잘 녹지 않지만(0.07~13.6mg/L), 다양한 유기용매에는 잘 녹는 특 성이 있다(California Environmental Protection Agency, 1999;Roberts and Hutson, 1999;European Commission, 2005;United States Environmental Protection Agency, 2006).

    유기인계 살충제인 chlorpyrifos-methyl, mecarbam, parathionmethyl, phenthoate, prothiofos, tebupirimfos, 살균제인 iprobenfos 및 제초제인 anilofos의 잔류분석은 각각 gas chromatographymass spectrometry(GC-MS) 혹은 liquid chromatographymass spectrometry(LC-MS)를 이용한 분석법들이 일부 보고된 바 있으나(Pang et al., 2006;Wang et al., 2007;Cha et al., 2012;López et al., 2014;He et al., 2015;Qin et al., 2015;Sivaperumal et al., 2015), 이들 방법 모두 다성분 분 석법을 적용하였고, 정제법으로 solid phase extraction(SPE)을 이용함으로 인해 정제도와 재현성이 불량할 우려가 극히 높다. 또한, 선행 연구의 결과들은 거의 monitoring의 목적으로 분석 법이 개발된 것으로 해당 성분들에 대하여 실제 농산물을 적 용한 정밀한 분석조건 확립 및 회수율은 검토된 바 없고, 상 기 기술한 내용처럼 본 연구의 대상이 되는 유기인계 농약 8 종에 대한 포괄적 계열별 동시분석법은 아직 보고된 바 없다.

    따라서 본 연구에서는 물리화학적 특성이 유사한 유기인계 살충제 chlorpyrifos-methyl, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos, tebupirimfos, 유기인계 살균제 iprobenfos 및 유기인계 제초제 anilofos를 포함하는 8종의 대상 농약에 대해 잔류 유무를 판단하는 monitoring의 수준에 그치지 않고, 정확성 및 정밀성이 확보된 정량적 계열 동시 분석법을 개발 하고자 하였으며, 시료 조제를 비롯한 모든 과정의 통합을 통 해 편이성까지 확보된 새로운 동시 정량분석법을 확립하여 국 내·외 수출입 농산물 잔류농약 검사의 기초 자료를 제공하고 자 하였다.

    재료 및 방법

    시약 및 기구

    본 연구에 사용된 anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos의 표준품은 순도 97.7%의 이상의 분석용 표준시 약을 Dr. Ehrenstorfer GmbH(Augsburg, Germany)로부터 구 입하여 사용하였다. 표준품의 stock solution은 acetone에 녹여 1,000 mg/L의 농도로 조제하여 -20°C의 냉동고에서 보관하고, 필요 시 마다 n-hexane으로 희석하여 사용하였다. Florisil (60~100 mesh)은 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)로부 터 구입하여 130°C에서 하룻밤 이상 가열, 활성화하여 사용하 였다. Acetone, n-hexane 및 acetonitrile은 잔류분석용을, deionized water는 HPLC용을 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 기타 유기용매 및 무기시 약은 시약특급 또는 잔류분석용을 사용하였다. 농축기는 Eyela NE-1000SW(Tokyo, Japan)를 사용하였고, 농산물 시료의 마쇄 및 균질화는 고속 호모게나이져(IKA, Ultra-Turrax T-25, Wilmington, NC, USA)를 이용하였다.

    농산물 시료

    식품의 농약 잔류허용기준(Ministry of Food and Drug Safety, 2017b) 중 anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos에 기준이 설정되어 있는 농산물을 분석대상으로 하였으며, Codex의 잔류분석법 대상 대표 농산물군(Codex, 2003)과 국내 소비량을 감안하여 곡류는 현미, 두류는 콩, 채 소류는 고추 및 배추, 과일류에서는 감귤을 대표시료로 선정 하였다. 현미, 콩, 고추, 배추 및 감귤의 무농약 시료는 지역 대형마트에서 유기농 인증시료를 구입한 후 식품공전 상 검체 처리방법(Ministry of Food and Drug Safety, 2017a)에 따라 전처리하여 사용하였다. 대조구 시료는 잔류농약 검사를 실시 하여 무농약 시료임을 확인하였다.

    GC-NPD/MS 기기분석 조건

    8종의 유기인계 농약 anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos는 모두 분자구조 내에 phosphorus를 함유하고 있 어 gas chromatography-nitrogen phosphorous detector(GCNPD) 혹은 gas chromatography-flame photometric detector (GC-FPD)로 분석 가능하나, 대상농약들 중 parathion-methyl 과 tebupirimfos의 국내 농약 잔류허용기준(MRL)이 0.01 mg/ kg으로 극히 낮은 수준임을 감안하여, 사용 가능한 두 검출기 중 분석 감도가 더욱 높은 NPD를 이용하였다. GC-NPD의 경우 분석 시 안정성 및 분석 재현성이 다소 떨어지는 양상이 발생할 수 있으므로 분석의 재현성 향상을 위해 대상농약들과 머무름 시간이 겹치지 않고, 안정한 특성을 나타내는 triphenyl phosphate(TPP)를 내부표준물질(internal standard; IS)로 사용 하여 기기분석 조건을 최적화 하였다.

    NPD를 장착한 GC는 Agilent(Wilmington, DE, USA) 6890 시리즈를 사용하였고, 내경이 0.53 mm인 capillary column을 사용하여 분석하였다. 잔류분의 재확인을 위한 gas chromatography/mass spectrometer(GC/MS) 분석에는 Agilent (Wilmington, DE, USA) 6890/5975를 사용하였으며, 각각의 자세한 분석조건은 Table 12에 나타내었다.

    표준검량선 및 분석정량한계(Limit of quantitation, LOQ)

    유기인계 농약 8종의 stock solution을 희석하여 성분별 로 0.01~2.0 mg/L의 농도가 되도록 농도별 표준용액을 조제 하고, 각 1 μL씩 GC-NPD에 주입하여 내부표준물질(TPP) 대비 분석된 peak의 면적을 기준으로 표준검량선을 작성하 였다.

    분석법의 정량한계(Limit of quantitation; LOQ)는 무 농약 농산물 시료에서 간섭물질이 존재하지 않음을 확인 한 후, 분석기기의 정량한계와 시료량 및 분석과정 중의 농 축배율을 계산하여 아래의 계산식에 의해 산출하였으며, 동일 수준으로 대상농약 8종을 처리한 회수율 시험으로 재확인하였다.

    LOQ(mg/kg) = [기기 정량한계(ng)/주입량(μL)] × [시료용액(mL)/시료량(g)]

    시료 추출 및 분배

    농산물 시료 25 g에 acetone 100 mL를 가하고(콩 및 현미 시료의 경우 추출 전 20 mL의 증류수를 가한 후 30분간 방 치하여 미리 습윤화 함) 호모게나이져를 이용하여 2분간 고속 마쇄(12,000rpm) 추출하였다. 추출물은 여과지(Toyo No. 6, Japan)가 장착된 Büchner funnel 에서 감압여과하고 시료 및 호모게나이저 컵을 여분의 acetone 40 mL로 세척하여 앞의 여과액과 합하였다. 합친 추출액을 1 L 용량의 분액여두에 옮 기고 포화식염수 50 mL와 증류수 450 mL를 첨가한 뒤 nhexane 100 mL로 분배 추출하였으며, 정치하여 n-hexane 층 만을 취해 무수 sodium sulfate에 통과시켜 탈수한 후 40°C에 서 감압 농축, 건고하였다. 콩 및 현미를 제외한 시료의 잔류 물은 n-hexane 10 mL에 재용해하여 florisil 흡착 크로마토그 래피에 직접 공시하였다. 콩 및 현미 시료의 경우 잔류물을 미리 acetonitrile을 포화시킨 n-hexane 40 mL에 재용해하여 250 mL 용량의 분액여두에 옮기고 미리 n-hexane을 포화시킨 acetonitrile 40 mL씩으로 3회 분배 추출하였다. 합친 acetonitrile 추출액을 40°C에서 감압 농축, 건고하고 잔류물을 n-hexane 10 mL에 재용해하여 florisil 흡착 크로마토그래피에 공시하였다.

    Florisil 흡착크로마토그래피

    내경 1.5 cm, 길이 40 cm의 유리 칼럼에 130°C에서 하룻 밤 이상 가열한 후 활성화시킨 florisil 10 g을 건식 충전한 후, 3 g의 무수 sodium sulfate를 그 위에 첨가하였다. 충전된 칼럼에 n-hexane 50 mL를 가하여 상단에 소량의 n-hexane이 남을 정도로 유출시켜 버린 후 n-hexane 10 mL에 녹인 시료 용액을 가하여 약 3 mL/min의 유속으로 유출시켰다. 충전제 표면이 노출되기 직전 n-hexane/acetone 혼합용액(99.5/0.5, v/ v) 50 mL를 용출시켜 버린 후 재차 n-hexane/acetone 혼합용 액(97/3, v/v) 150 mL를 용출시켜 tebupirimfos, chlorpyrifosmethyl, parathion-methyl, mecarbam, prothiofos 및 phenthoate를 회수하였다. 6종의 성분이 먼저 회수된 칼럼에 계속하여 150 mL의 n-hexane/acetone 혼합용액(92/8, v/v)을 용출시켜 iprobenfos 및 anilofos를 회수하였으며, 각 성분들이 회수된 분획들은 40°C에서 감압 농축, 건고하고 잔류물을 내부표준물 질(TPP)이 함유된 n-hexane 10 mL에 재용해하여 GC-NPD로 분석하였다.

    대표 농산물에 대한 유기인계 농약 8종의 회수율 검정

    본 연구에 의해 확립된 대상 유기인계 농약 8종 잔류분석법 의 신뢰성 및 분석 효율을 검증하기 위하여 실제 농산물 시료 에 대한 회수율 시험을 수행하였다. 즉, 마쇄한 각 대표 무농 약 농산물 시료 25 g에 정량한계(LOQ), 정량한계의 10배 및 50배가 되도록 대상농약 8종의 표준용액을 각각 3반복으로 처 리한 다음 상기 분석과정을 수행하여 회수율과 분석오차를 측 정하였다.

    결과 및 고찰

    GC-NPD 분석조건의 확립

    GC-NPD를 이용한 유기인계 농약 8종(anilofos, chlorpyrifosmethyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos)의 동시분석을 위한 최적 분석 column을 선정하기 위하여 column의 극성별로 분리양상을 조 사하였다. Column에 충전된 phenylsiloxane/methylsiloxane의 함량별로 극성을 달리하여 분리능을 조사한 결과, methylsiloxane 이 100% 함유된 비극성 DB-1 capillary column에서는 주입 구 및 검출기 온도, oven의 승온 programming 등 분석 resolution에 영향을 주는 모든 인자를 변화시켜도 대상농약 중 chlorpyrifos-methyl, parathion-methyl 및 iprobenfos 성분이 한 개의 peak로 중첩되었으며, phenthoate와 mecarbam 역시 한 개의 peak로 겹치는 양상을 보여 총 8종의 대상농약에 대 해 5개의 peak만 검출되는 양상을 나타내었다. Methylsiloxane 이 95% 함유된 DB-5 capillary column 역시 분리능 및 감 도를 향상시키기 위해 여러 기기조건을 달리하여 검토하였으 나, tebupirimfos와 iprobenfos가 한 개의 peak로 중첩되었고, chlorpyrifos-methyl과 parathion-methyl이 한 개의 peak로, phenthoate와 mecarbam이 각 한 개의 peak로 중첩되는 양상 을 나타내어, 앞의 DB-1 capillary column과 마찬가지로 총 5 개의 peak만 검출되었다. 반면, methylsiloxane이 50% 함유된 극성 DB-17 capillary column에서는 prothiofos와 phenthoate 두 성분이 아주 근접한 머무름시간으로 겹쳐지는 양상을 보여 총 8성분에 대해 7개의 피크가 검출되는 것으로 확인되나, peak의 정단부를 확대하면 prothiofos와 phenthoate가 미약하게 나마 분리되는 양상을 나타내어 검토된 column 중 감도 및 분리능 면에서는 가장 우수한 양상을 나타내었다(Fig. 2). 따 라서 대상성분의 최적 분석용 column은 DB-17 capillary column으로 선정하고, peak가 중첩된 두 성분(prothiofos 및 phenthoate)의 정확한 정량 및 정성적 검토를 위해 prothiofos 를 포함하는 대상농약 7종과 phenthoate 한 성분만을 서로 구 분하여 전처리만을 개별적으로 수행한 후, 동일한 기기 분석 조건으로 정량분석만을 별도로 수행하였다(Fig. 3). Table 1의 GC-NPD 분석조건에서 DB-17 capillary column을 이용하여 분리할 경우 각 성분의 머무름 시간은 tebupirimfos 7.9분, iprobenfos 9.7분, chlorpyrifos-methyl 11.4분, parathion-methyl 12.1분, mecarbam 16.2분, prothiofos 16.7분, phenthoate 16.8분 및 anilofos 22.0분을 나타내었다.

    분석기기의 정량한계란 크로마토그램에서 peak로 나타난 대 상 성분의 정량적 결과에 신뢰성을 부여할 수 있는 한계농도 로서, 크로마토그램에서 검출된 peak의 signal/noise(S/N) 비가 최소 10 이상인 성분의 농도를 의미한다(Fong et al., 1999;Miller, 2005). Table 1의 GC-NPD 분석 조건에서 대상농약 8종의 표준용액을 분석하여 S/N비를 계산한 결과, 각 성분의 기기상의 정량한계(S/N≥10)는 chlorpyrifos-methyl, parathionmethyl 및 tebupirimfos가 0.01 ng 수준, anilofos, iprobenfos, mecarbam, phenthoate 및 prothiofos가 0.02 ng 수준을 나타 내었다.

    한편, 대상농약 8종의 농도별 표준용액(0.01~2.0 mg/L) 1 μL를 GC-NPD에 주입, 분석하여 얻은 검량선의 회귀방정식은 모두 우수한 직선성을 나타내었으며(Table 3), 모든 표준검량 선에 대한 회귀계수가 R2=0.999** 이상으로 정량의 직선성이 검정되었으므로 해당 범위의 시료 중 잔류량을 비례적으로 산 출하는 것이 가능하였다.

    시료 추출 및 분배과정의 확립

    농산물 시료로부터 대상농약 8종 성분을 추출하기 위한 용 매로는 acetone을 사용하였다. Acetone은 다양한 농약의 추출 에 보편적으로 사용되는 표준적 용매로써 이미 많은 연구자들 에 의하여 농약 추출에 그 효율과 재현성이 인정된 바 있다. 농산물 추출액으로부터 대상 성분들과 함께 추출되는 방해물 질을 1차적으로 제거하기 위한 조정제법으로는 액-액 분배 법을 사용하였다. 즉, 수용성 유기용매 추출액을 다량의 포 화식염수와 증류수로 희석한 후 직접 비극성 용매로 분배 추출하는 방법을 사용하였는데, 이는 US Food and Drug Administration(US FDA)법이나 AOAC법에서 중간~비극성 농 약 성분에 대하여 보편적으로 사용되며, 번거로운 추출액의 농축과정을 생략할 수 있는 장점이 있다(AOAC, 2000;Lee et al., 2008). 액-액 분배법의 분배 용매로는 n-hexane, 2 종의 n-hexane/dichloromethane 혼합액, dichloromethane 등 4 종을 공시하여 대상 성분들의 분배효율을 조사하였다(Table 4). 액-액 분배조건에 따른 분배효율을 조사한 결과 n-hexane 용액 100 mL로 분배하였을 때 대상농약 8종의 회 수율은 96.8~102.7% 수준이었고, 각각 100 mL의 n-hexane/dichloromethane 혼합액(80/20, v/v) 및 n-hexane/ dichloromethane 혼합액(80/20, v/v) 조건에서도 비교적 유사한 양상을 나타내었으나, dichloromethane의 농도가 높아질수록 phenthoate의 회수율이 낮아지는 양상을 나타내었다. 특히 dichloromethane 50 mL로 2회 반복하여 분획하는 조건에서는 대상농약 8종의 회수율이 72.2~85.0%로 검토 용매 중 가장 낮은 회수율을 나타내었다. 따라서 대상농약 8종 전체의 회수 율 및 작업자의 편이성을 고려할 때, 가장 효율적이라 판단되 는 분획용매 I 조건의 n-hexane 100 mL로 분배를 수행하는 액-액 분배조건을 최종 분배용매로 선정하였다.

    상기 액-액 분배과정을 통해 시료 중에 포함된 상당량의 극 성 및 기타 방해물질이 제거될 것으로 기대되나, 시료로부터 유래하는 유지 성분은 n-hexane층으로 대상농약 성분과 함께 분배되기 때문에 제거되지 않는다. 이러한 유지 성분은 기기 분석 시 치명적 간섭 또는 분리용 column 및 검출기의 급격 한 열화를 초래하므로 반드시 제거해야 할 간섭물질이다. 대 상 시료 중 현미 및 콩은 유지가 각각 약 1~3% 및 20% 수 준 함유되어 있는 시료이므로 이러한 유지 제거를 위하여 n-hexane/ acetonitrile 분배법을 추가로 공시하였다(US FDA, 1999;AOAC, 2000).

    Table 5에 나타낸 바와 같이 미리 n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile로 3회 분배하였을 때 대상농약 8종은 90.6~ 100.5% 수준으로 회수가 가능하였으므로 유지 및 비극성 간 섭물질의 제거를 위한 n-hexane/acetonitrile 분배법은 3회 분 배하는 분배조건 II로 설정하였다. 한편, 유지 함량이 0.1~0.4%로써 비유지 시료로 분류되는 고추, 배추 및 감귤에 서는 제거되는 비극성 유지 성분 및 불순물의 양이 매우 작고, 또한 크로마토그램 상에서 그 정제 효과 또한 미미하였으므로 n-hexane/acetonitrile 분배과정을 생략하였다.

    Florisil 흡착 크로마토그래피 정제조건의 최적화

    농산물에 함유된 8종 유기인계 대상 농약의 분석 시 상기의 n-hexane 및 n-hexane/acetonitrile 분배과정을 통해 상당량의 불순물 및 비극성 간섭물질들이 제거되었을 것으로 판단되나, 농산물에 따라 시료로부터 유래되는 다양한 기타 불순물 및 색소가 여전히 존재하므로, 추가적인 정제과정이 필요할 것으 로 판단되어 흡착크로마토그래피에 의한 정제법을 검토하였다. 흡착크로마토그래피는 잔류농약 분석 시 가장 많이 이용하는 방법으로, 흡착제로는 silica gel, florisil 및 alumina 등이 주 로 사용된다. 이 중 florisil은 색소성분과 지질의 제거가 뛰어 나 미국의 FDA(1999)AOAC(2000) 등에서 가장 많이 사 용하는 방법이다. 본 연구에서도 대상농약 8종의 극성을 고려 하여 florisil을 흡착제로 선정 하였으며, 용매의 극성 조절을 위해 n-hexane/acetone 혼합용액의 용매체계를 사용하여 최적 화 하였다(Table 6). Florisil 흡착크로마토그래피용 용매의 다 양한 극성 조절을 이용하여 대상농약 8종의 회수율을 조사한 결과, n-hexane/acetone 혼합액(99.5/0.5, v/v) 50 mL로 prewashing한 후, 150 mL의 n-hexane/acetone 혼합액(97/3, v/v) 으로 용출할 경우 tebupirimfos, chlorpyrifos-methyl, parathionmethyl, mecarbam, prothiofos 및 phenthoate가 각각 90.1 ~102.5%로 용출되었으며, 연속하여 동일한 칼럼에 150 mL의 n-hexane/acetone 혼합액(92/8, v/v)으로 용출하였을 때 iprobenfos 및 anilofos 성분이 각각 95.6% 및 93.1% 수준으 로 회수되는 양상을 나타내어 대상성분 8종 모두를 순차적으 로 용출해내는 것이 가능하였다. 따라서 florisil 흡착크로마토 그래피법을 이용한 간섭물질 제거를 위한 추가적인 정제법은 상기의 방법과 같이 적용하였다.

    농산물 시료 중 유기인계 농약 8종의 분석정량한계 및 회 수율

    본 연구에서 확립한 시료의 추출 및 정제과정, 그리고 기기 분석 과정을 대표하여 무농약 농산물 시료 중 현미에 적용한 결과는 Fig. 4와 같다. 모든 무농약 농산물의 최종 시료용액에 서 대상농약 8종과 동일한 머무름 시간에 간섭물질이 존재하 지 않음을 확인하였고, 분석기기의 정량한계(LOQ)와 시료량, 그리고 분석과정 중의 농축배율을 계상하여 분석법의 정량한 계를 산출하였다. 본 연구에서 무농약 농산물 시료에서 간섭물 질이 존재하지 않음을 확인한 후 산출된 대상농약 8종 각각의 정량한계는 tebupirimfos, chlorpyrifos-methyl 및 parathionmethyl은 0.004 mg/kg, 그 외 iprobenfos, mecarbam, prothiofos, phenthoate 및 anilofos는 0.008 mg/kg이었으며, 국제기준인 Codex(Codex Alimentarius Commission, 2003) 및 식품공전 잔류농약분석법 실무 해설서(Lee, 2017)에서 권장하는 잔류농 약분석법 기준인 0.05 mg/kg 이하 또는 잔류허용기준의 1/2 이하의 정량한계 기준에 적합하였다.

    각각의 농산물 무처리 시료에 대상농약 8종의 표준용액을 정량한계, 정량한계의 10배 및 50배의 농도가 되도록 첨가하 고, 상기 확립된 분석방법에 의하여 대표 농산물별 3반복으로 분석하여 회수율을 조사한 결과, 정량한계 수준에서는 전체 성 분에 대해 80.5~105.0%, 정량한계 10배 수준에서는 80.7~ 101.3%, 정량한계 50배 수준에서는 81.1~99.5%의 양호한 회 수율을 나타내었고, 분석오차는 최대 5.8%로 조사되었다. 따 라서, 처리수준 및 농산물 시료 종류에 관계없이 잔류분석기 준인 회수율 70~120% 범위와 분석오차 10% 이내를 만족하 였다(Table 7~11). Table 8, 9, 10

    이상의 결과로 볼 때, 본 연구에서 확립된 유기인계 농약 8종(anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos)의 분석법은 국내·외 수출입 농산물의 잔류농약 분석 및 검사에 충분히 적용 가능함을 확인하였다.

    GC/MS를 이용한 잔류분의 재확인

    개발된 분석법의 신뢰성을 확보하기 위하여 GC/MS에 의한 재확인 과정을 추가하였다. Narrow bore capillary column을 사용하고, 전 대상성분을 완전히 분리하는 조건으로 표준용액 을 주입하여 Fig. 5와 같이 GC/MS의 total-ion chromatogram (TIC)를 얻었다. TIC로부터 각 성분별 EI spectrum(Fig. 4)을 조사한 결과, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate 및 tebupirimfos의 [M]+ ion인 288.1, 263.0, 329.1, 320.0 및 318.1 m/z는 충분한 intensity로 관찰되어 각 성분의 분자 구조를 EI spectrum을 통해 명확히 확인할 수 있었다. 반면, chlorpyrifos-methyl은 [M]+ ion인 320.9 m/z의 intensity가 매 우 낮았으나, [(CH3O)2P=S]+ ion인 125.0 m/z가 충분한 intensity 로 관찰되어 명확한 정성적 확인이 가능하였다. Prothiofos 및 anilofos 역시 마찬가지로 [M]+ ion인 344.0 및 367.0 m/z는 관찰되지 않았으나, 각각 309.0 및 266.7에서 238.8 m/z로, 226.0에서 184.0 m/z로 전이(transition)되는 고유의 특성이 잘 반영되어 충분한 정성적 확인이 가능하였다(Hayward et al., 2013).

    Fig. 6은 본 실험에 사용된 대표적 농산물 시료 중 현미를 대상으로 대상농약 8종의 잔류분을 재확인한 selected-ion monitoring(SIM) chromatogram이며, 본 실험에서 사용된 모든 농산물의 무처리 시료에서는 대상 농약성분의 peak가 전혀 관찰되지 않았고, 인위 첨가된 시료에서는 동일한 머 무름 시간대에 정확하게 대상농약 8종의 잔류분만을 재확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사용한 GC/MS의 SIM 조건을 이용할 경우에도 GC-NPD를 이용한 정량법과 더불 어 대상농약 잔류분의 추가적 정성분석법으로 사용할 수 있 을 것으로 판단된다.

    적 요

    본 연구에서는 농산물 시료 중 GC-NPD/MS 분석법을 이용 하여 물리화학적 특성이 유사한 유기인계 살충제 chlorpyrifosmethyl, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos, tebupirimfos, 유기인계 살균제 iprobenfos 및 유기인계 제초제 anilofos를 포함하는 8종의 유기인계 농약에 대해 동시 분석법 을 확립하였다. 농산물 시료에 acetone을 가하여 추출된 대상 농약 8종의 잔류분은 n-hexane 분배법과 florisil 흡착 크로마 토그래피법으로 정제하여 분석대상 시료로 하였다. DB-17 capillary column을 이용한 GC-NPD 분석 시 불순물의 간섭 은 없었으며, 감귤, 고추, 배추, 현미 및 콩을 포함한 5종의 대표 농산물 중 대상농약 8종 각각의 정량한계(LOQ)는 tebupirimfos, chlorpyrifos-methyl 및 parathion-methyl은 0.004 mg/kg, 그 외 iprobenfos, mecarbam, prothiofos, phenthoate 및 anilofos는 0.008 mg/kg이었다. 5종의 대표 농산물에 대 한 대상농약 전체의 회수율은 80.5~105.0%를 나타내었으며, 농산물 시료 및 처리수준에 관계없이 10% 미만의 분석오차 를 나타내어 잔류분석기준 이내를 만족하였다. 본 연구에서 확립된 유기인계 농약 8종(anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos 및 tebupirimfos)의 동시 분석법은 검출한계, 회수율 및 분 석오차 면에서 국제적 분석기준을 만족할 뿐만 아니라, GC/ MS SIM을 이용한 잔류분의 재확인 과정의 결과를 종합해 볼 때 분석과정의 편이성 및 신뢰성이 확보된 계열별 동시 분석법으로 국내·외 수출입 농산물 잔류농약 검사에 사용 가 능할 것이다. Fig. 7

    Figure

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    Chemical structures of anilofos, chlorpyrifos-methyl, iprobenfos, mecarbam, parathion-methyl, phenthoate, prothiofos and tebupirimfos.

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    GC-NPD chromatograms of 8 kinds of organophosphorus pesticides using typical capillary columns(1 μL of 0.05 mg/L in n-hexane, respectively).

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    GC-NPD chromatograms of 8 kinds of organophosphorus pesticides contained internal standard(1 μL of 0.1 mg/L in n-hexane).

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    GC-NPD chromatograms of hulled rice extract for the analysis of 8 kinds of organophosphorus pesticides, fortified at ten-fold of LOQ level.

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    Total-ion chromatogram(TIC) of 8 kinds of organophosphorus pesticides using GC/MS.

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    EI mass spectrums of 8 kinds of organophosphorus pesticides

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    SIM chromatograms of hulled rice extract for the confirmation of 8 kinds of organophosphorus pesticides, fortified at ten-fold of LOQ level.

    Table

    GC-NPD operating parameters for 8 kinds of organophosphorus pesticides

    GC/MS operating parameters for 8 kinds of organophosphorus pesticides

    Comparison of retention time, calibration and instrumental LOQ for 8 kinds of organophosphorus pesticides

    Efficiency of liquid-liquid partition of crude extract by different solvents for 8 kinds of organophosphorus pesticides

    Efficiency of n-hexane/acetonitrile partition for 8 kinds of organophosphorus pesticides

    Elution profile of 8 kinds of organophosphorus pesticides on florisil column chromatography

    Recovery rate of 8 kinds of organophosphorus pesticides in hulled rice sample

    Recovery rate of 8 kinds of organophosphorus pesticides in soybean sample

    Recovery rate of 8 kinds of organophosphorus pesticides in mandarin sample

    Recovery rate of 8 kinds of organophosphorus pesticides in Kimchi cabbage sample

    Recovery rate of 8 kinds of organophosphorus pesticides in green pepper sample

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