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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.32 No.1 pp.18-23
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2020.32.1.18

Virus Infection and Growth of Advanced Generations in Northern-type Garlic bulbs from Meristem Culture

Won-Kwon Jung*,†, Ji-Eun Lee**, Mun-Jung Lee**, Han-Woo Do*, Il-Kweon Yeon*, Seuk-Hee Park*
*Organic Agricultural Research Institute, Gyeongsangbuk-do Agricultural Research & Extension Services, Uiseong 37339, Korea
**Department of Horticulture & Management Research Department, Gyeongsangbuk-do Agricultural Research & Extension Services, Daegu 41404, Korea
Corresponding author (Phone) +82-54-832-9669 (E-mail) jwonkwon@korea.kr
November 11, 2019 February 18, 2020 February 28, 2020

Abstract


All conventional garlics cultivated at farmer’s fields were infected with various plant viruses such as Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV) and Allexivirus. The infection rate of these viruses in northern-type garlics was from 14% to 100% in Uiseong and Yecheon area. For producing virus-free garlic, meristem was removed from garlic plants and cultivated in Murashige & Skoog (MS) medium. No OYDV and Shallot latent virus (SLV) were detected on leaf of garlic from first generation to 3rd generation. Virus infection rates of 2nd generation of garlic plants grown in net houses were 3.4%, 21.7% and 10.0% for LYSV, GCLV and Allexivirus, respectively, and those of 3rd generation were 17.5% and 7.5% for GCLV and Allexivirus, respectively. The average weight of a bulb infected with viruses in Uiseong was 29.3 g but that of bulbs from meristem culture in 2nd and 3rd generations were 57.6 g 66.2 g, respectively, showing more than two times increase in bulb weight.



한지형 마늘 생장점 배양체의 세대별 바이러스 감염양상과 생육특성

정 원권*,†, 이 지은**, 이 문중**, 도 한우*, 연 일권*, 박 석희*
*경북농업기술원 유기농업연구소
**경북농업기술원 원예경영연구과

초록


    Rural Development Administration
    PJ012638062019

    서 론

    마늘(Allium sativum L.)은 백합과(Liliaceae) 파속에 속하는 양념용 채소이며, 건강보조 식품으로 이용되기도 한다. 국내에 서 재배종 마늘은 화기의 비정상적 발달로 인해 불임이 되어 진정한 씨앗이 생기지 않지만, 일부 유전자원은 가임계통이 존 재한다(Kamenetsky et al., 2015). 인편 및 주아를 씨마늘로 이용하는 영양번식 방법으로 재배되고 있다. 마늘은 인편에 의 한 무성번식을 하며 지리적 고립에 의해 생태종으로 분화되었 다. 우리나라 재배 마늘은 생태형에 따라 난지형과 한지형으로 구분한다. 국·내외에서 재배되는 마늘은 대부분 바이러스 감염 으로 수량과 품질이 떨어지는 문제점을 안고 있다(Chung & Chang, 1979;Lee et al., 1979;Pena-Iglesias & Ayuso, 1982). 따라서 바이러스 감염에 의한 피해를 저감할 수 있는 우량한 종구를 생산하는 것은 마늘 재배자들의 중요한 관심거 리이며 경제적으로 매우 중요하다.

    농가에서 관행적으로 하는 인편번식법은 증식효율이 낮고 바 이러스가 전염되기 때문에 지상부에 착색하는 주아를 번식과 종구생산 수단으로 활용하는 재배기술이 개발되어 실용화되었 다(Ban et al., 1982). 뿐만 아니라 생장점 배양이나 조직배양 기술을 통하여 virus-free 종구의 생산 가능성을 발표(Chang et al., 1992;Suh & Park, 1993;Yang et al., 1993)한 이 후 무병 씨마늘의 다량급속증식기술이 개발되어 상업적 생산 업이 시도되기도 하였다. 이와 같이 조직배양으로 생산한 우 량 종구 마늘과 주아로부터 생산된 씨마늘은 기존 마늘에 비 하여 수량이 증대되고 품질이 개선되는 효과가 입증되었다(Ban et al., 1982;Kwon et al., 2015). 이후 재배과정 중 인편분 화 초기에 마늘식물체로부터 생장점을 적출하여 조직배양하는 기술이 이용되었으며(Nam et al., 2009) 남도마늘에서 우량 씨마늘 생산 보급에 활용되었다. 그러나 생산된 씨마늘을 세 대별로 바이러스 감염 정도와 생육을 동시에 추적하는 시험결 과는 거의 없다.

    마늘에 경제적인 피해를 주는 것으로 알려진 Onion yellow dwarf virus(OYDV)와 Leek yellow stripe virus(LYSV)는 단 독 또는 복합감염으로 20~80% 정도의 수량 감소 피해를 일 으키는 것으로 알려져 있다(Lot et al., 1998). 이외에도 국내 에 보고된 마늘 바이러스병은 Shallot latent virus(SLV), Garlic commen latent virus(GCLV), Shallot yellow stripe virus(SYSV), Garlic virus A(GarV-A), Garlic virus D(GarV-D), Allexivirus 등이 있다(Chung et al., 1979;Koo et al., 1998;Koo et al., 2002;Lee et al., 2007). OYDV 와 LYSV 그리고 GLV는 진딧물에 의하여 충매전염되며, Allexivirus는 응애류에 의하여 매개되며 마늘 정단분열 조직에 서 바이러스가 관찰되기 때문에 생장점 배양만으로는 바이러 스를 완전히 제거할 수 없다는 연구 결과가 보고되었다(Chang et al., 1998). 그리고 마늘 무병주를 생산하였더라도, 증식과정 에서 이러한 매개충에 노출되면 쉽게 바이러스에 감염되므로, 무병주 생산체계를 확립하는 것은 매우 중요한 과정이다. 2005 년부터 국립원예특작과학원 채소과에서 생산하여 농업인들에 게 보급하고 있는 남도마늘 생장점 배양 마늘은 농가의 호응 도가 높으며 보급 사업이 지속되고 있다. 본 연구에서는 경북 의성지역과 예천지역에서 재배되고 있는 마늘의 바이러스 감 염을 조사하였으며, 생장점 배양을 통하여 얻어진 마늘의 세 대별 무병주율과 바이러스 재감염 양상을 파악하고 세대에 따 른 생육을 조사함으로 무병주의 재배효과와 지속성을 알아보 고자 하였다.

    재료 및 방법

    마늘재배지 시료채취 및 바이러스 진단

    경북지역 한지형 마늘을 많이 재배하는 의성과 예천 그리고 대구 지역의 마늘 바이러스 감염정도를 조사하기 위하여 2015 ~2017년 동안 매년 4~5월에 생육중인 농가의 마늘 잎을 100 개씩 채취하였다. 생장점 배양 마늘의 바이러스 진단을 위하 여 viral RNA Extraction Kit(Bioneer Co., Korea)를 이용하 여 Total RNA 를 추출하였다. 기내에서 생장점 배양 중 신초 와 세대별 마늘의 잎을 0.1 g 씩 잘라 phosphate buffered saline(0.01M) 400 μl를 분쇄용 bead와 함께 2.0 ml tube에 넣고 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 200 μl의 즙액을 획득하여 킷트 사용방법을 따라 total RNA를 분리하였다. 유전자 증폭 을 위하여 Nam et al.(2015)이 개발한 특이 Primer를 사용하 였다(Table 1). Carlavirus인 GCLV, SLV와 Potyviurs인 OYDV, LYSV 그리고 Allexivirus 9종(Garlic virus D; GarVD, Garlic virus E; GarV-E, Garlic virus X; GarV-X, Garlic mite-borne filamentous viurs; GMBFV, Garlic miteborne mosaic virus; GMBMV, Shallot virus X; shv-X)의 진단용 Primer 를 사용하였으며, GCLV, SLV, OYDV 및 LYSV는 종 특이 Primer 를 사용하였고, Allexivirus 는 속 특 이적 Primer를 사용하였다.

    RT-PCR premix(Bioneer Co., Korea)에 분리한 RNA template 2 μl, N-terminal과 C-terminal primer 각각 1μl, DNase free water 16 μl를 첨가한 혼합액을 유전자증폭기 MyGenie96 Thermal Block(Bioneer Co, Korea)를 이용하여 42°C, 1hr, 94°C에서 5분, 95°C에서 30초, 54°C에서 30초, 72°C에서 1분, 72°C에서 10분, 35회 반복하여 증폭하였다. RT-PCR 과정에서 OYDV와 Allexivirus를 동시에 증폭하였으 며, LYSV, GCLV 그리고 SLV를 동시에 증폭하였다. PCR 산물은 전기영동 장치 Mupid-Ex(Bioneer Corp., Korea)에 1×TAE 용액을 넣은 후 5ppm의 Red safe 를 첨가한 1.3% agarose gel에 넣어준 다음 100v에서 20분간 전기영동하여 Gel Doc(BIO-RAD Co., USA)에서 밴드를 확인하였다.

    마늘 생장점 적출

    한지형 마늘 의성종을 재배하면서 3월말부터 3일 간격으로 식 물체를 채취하여 인편분화 여부를 조사하여, 육안으로 작은 인 편이 관찰되는 4월 중순에 마늘을 채취하였다. 마늘 식물체를 채취하여 뿌리털과 줄기를 잘라낸 후 2 × 2 cm 크기로 다듬고 NaClO 0.1% 용액과 70% 에탄올에 각각 3분간 침지하여 표면 소독하였다. 멸균수로 3회 세척한 다음 무균대에서 실체현미경 으로 관찰하면서 생장점을 적출하였다. 인편분화기 마늘의 생장 점 적출은 Nam et al.(2009)이 사용한 방법을 참고하였다.

    마늘 생장점 배양

    적출한 생장점을 배양하기 위한 배지는 증류수 1L에 MS 배지(Biochemie), α-Naphthalene acetic acid(NAA) 0.5 mg/L, 6-(Y,Y-Dimethylallylamino)purine 0.3 mg/L, Sucrose 30 g/L, Agar 8 g/L 가 함유된 고체배지에 300개의 생장점을 치상하였 다. 배양은 온도 25°C, 조명시간은 12 hr/day, 조명의 광량은 150~200 μmol·m-2·S-1 의 조건에서 30일간 실시하였으며, 같은 배지로 계대배양하여 50일간 배양하였다. 구비대를 유도하기 위 하여 증류수 1 L에 MS 배지, Sucrose 80 g/L, Agar 8 g/Lml을 넣어 조제한 배지를 이용하였다. 이 배지에서 잎이 마르면서 지하부의 괴경이 둥근 모양으로 비대된 것을 소구(bulblet)라 고 하는데, 이것을 채취하여 음지에서 건조 및 보관하여 씨마 늘로 사용하였다. 이 배양과정과 수확한 소구 마늘을 1세대로 지칭하였다. 이 1세대 마늘인 소구를 파종하여 재배하는 과정 의 식물체와 수확한 마늘을 2세대로 지칭하였으며, 2세대를 파 종하여 재배하는 과정의 식물체와 수확한 마늘을 3세대로 칭 하였다.

    생장점 배양 마늘의 재배와 조사

    1세대 마늘을 가로 ×세로(1 mm × 1 mm) 크기의 구멍이 난 망사를 씌운 하우스 내에 재식거리 15 × 10 cm 간격의 유공비 닐을 피복한 후, 기내에서 수확한 소구를 10월에 한 개씩 파 종하였다. 12월 중순부터 3월 중순까지 하우스의 상면과 측면 을 닫아 보온하였다. 이듬해 6월 중순에 마늘을 수확하여 1개 월간 음지에서 건조한 후 생육조사를 실시하였다. 3세대 마늘 을 수확하여 씨마늘로 파종하여 동일한 방법으로 3세대 마늘 을 재배하여 수확하였다. 생육조사는 캘리퍼스를 이용하여 마 늘통의 높이(구고), 무게(구중), 직경(구경)을 측정하였으며, 그 리고 인편수는 육안으로 조사하였다.

    결과 및 고찰

    마늘 재배현장의 바이러스 감염실태

    경상북도 의성, 예천 및 대구 지역에서 재배하고 있는 일반 적인 마늘의 바이러스 감염여부를 2015년부터 2017년까지 3 년 동안 조사한 결과, 대부분의 마늘이 바이러스에 복합적으 로 감염되어 있었다. 3년치 평균 감염률을 보면, Allexivirus가 94.5%로 가장 높았고, 다음은 OYDV가 82.8%이었다(Table 2). 조사한 바이러스 중에 가장 감염률이 낮은 종은 LYSV로 56.2%이었다. OYDV와 Allexivirus를 동시에 그리고 LYSV, GCLV 그리고 SLV를 동시 진단하였을 때, 대부분 양성반응을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 신 등(2013)은 강원 도 지역 마늘포장의 바이러스 감염률이 OYDV 33.0%, LYSV 95%라고 하였으며, LYSV의 감염률이 매우 높아 경상 북도 지역과는 다소 상반된 감염 양상을 나타내었다. 바이러 스에 감염되지 않은 건전한 개체은 잎 색이 진녹색을 띄지만, 한 종 혹은 2종 이상의 바이러스에 감염된 마늘은 모자이크나 흰색 줄무늬 증상을 나타내며, 마늘밭 전체가 연두색 또는 연 녹색을 나타낸다(Fig. 1).

    마늘 조직배양

    마늘의 생육 중 인편분화 초기에 채취하여 미숙인편의 생장 점을 적출하여 기내 배양하였다(Fig. 2). 생장점을 치상일로부 터 180일 경과 시점에 평균적으로 0.3 g 크기의 소구를 240 개 수확하였다. 나머지는 구비대가 이루어지지 않거나 곰팡이 오염으로 수확할 수 없었다.

    생장점 배양 마늘의 세대별 바이러스 감염 양상

    RT-PCR 방법을 이용한 바이러스 진단 조사 결과, 1세대인 기내 배양 상태의 마늘 잎 조직에서 GCLV 3.8%와 Allexivirus 3.1%이 검출되었으나, OYDV, LYSV 그리고 SLV 는 검출되지 않았다(Table 3). Fig. 3에서 1세대 마늘 잎의 대 부분 시료에서 바이러스 음성반응을 나타내는 것을 확인할 수 있다. Chang 등(1988)의 마늘 조직배양 연구에서도 완전 Virus-free 개체를 얻는 것은 매우 어렵다고 하였다. 일반적으 로 식물체의 생장점은 바이러스에 감염되지 않는다고 알려져 있지만, 현실적으로 마늘의 생장점만 적출하여 배양하는 과정 은 매우 어려운 작업이다. 따라서 생장점 적출과정에서 생장 점을 싸고 있는 엽원기를 1~2개 붙여서 분리하게 되는데, 이 과정에서 바이러스가 감염된 엽원기 조직의 일부가 생장점에 부착된 상태로 분리되어 기내 생육 중 마늘의 식물체 세포 내 에서 바이러스가 증식되는 것으로 보인다. 기내에서 수확한 소 구를 토양에 파종하여 진딧물이 침입할 수 없는 망사를 설치 한 하우스에서 재배한 생장점 2세대 마늘의 생육 최성기에 바 이러스 검사를 한 결과 GCLV 21.5%, Allexivirus 10.0%, LYSV 3.4% 감염된 것으로 나타났으며, 이 마늘을 다시 파종 하여 재배한 생장점 3세대 마늘에서는 GCLV 17.5%, Allexivirus 7.5% 의 감염률을 나타내었다(Table 3). 이 결과 로 볼 때, 한지형 마늘은 생장점 배양을 통해 OYDV, SLV, LYSV는 효과적으로 제거할 수 있는 가능성이 높아 보이나, 1 세대 또는 2세대에서 검출되는 GCLV 와 Allexivirus 는 생장 점 배양을 통하여 상대적으로 제거하기가 어려운 것으로 보인 다. 이 2 가지 바이러스는 생장점을 싸고 있는 제 1엽원기와 제 2엽원기에 감염되어 있을 가능성이 높을 것으로 추정된다.

    생장점 배양 마늘의 세대별 생육

    한지형 마늘의 생장점을 기내에서 배양한 생장점 배양 1세 대를 수확한 소구의 평균 무게는 0.3 g 내외였다. 이 소구를 망사가 설치된 비닐하우스 안에 파종하여 동계 보온처리하여 재배한 2세대 마늘은 57.6 g으로 192배로 커졌다. 2세대 마늘 의 인편을 분리하여 파종 후 재배한 3세대는 66.2 g이었다. 생 장점 배양으로 생산된 마늘은 노지에서 재배된 관행의 일반마 늘 29.3 g에 비하여 무게가 월등하게 향상되었다(Table 4, Fig. 4). 생장점 배양한 마늘의 생육이 이같이 향상된 원인은 바이 러스 밀도의 획기적인 감소(Table 2, 3)와 12월 중순부터 3월 중순까지 동계 비닐 보온처리로 인한 생육 촉진 효과가 복합 적으로 작용한 것으로 고려된다. 57.6 g의 구중을 지닌 2세대 마늘은 0.3 g인 소구를 파종하여 이듬해에 수확된 것이며, 3세 대 마늘은 약 5.7 g 정도 무게의 2세대 마늘 인편을 파종하여 생산된 것이다. 관행재배한 일반마늘은 5.5 g 정도 크기의 인 편을 종구로 사용하였다. 일반적으로 마늘은 씨마늘로 사용한 인편의 크기에 따라 생육이 비례하는 경향을 나타내지만, 본 시험에서 생장점 배양 3세대 마늘과 일반마늘의 씨마늘 인편 크기가 5.7 g과 5.5 g 정도로 비슷한 크기를 사용하였으므로 인 편의 크기에 따른 생육 차이는 거의 배제할 수 있을 것으로 생각된다. 권 등(2015)은 난지형 마늘인 남도 마늘에서 생장 점 마늘의 생육 우수효과가 노지에서도 5년 이상 유지되는 것 으로 보고하였다. 마늘의 인편수는 소구인 1세대에서는 1개였 으며, 2세대는 8.6개, 3세대는 8.5개였다. 한지형 마늘의 종구 로 사용하기에는 4~5 g 정도 무게의 인편이 좋으며, 이 정도 크기의 인편수가 많이 생산될수록 종구 증식효율이 좋으므로 씨마늘 증식 단계에서는 인편수가 많을수록 좋다. 생장점 배 양 마늘의 종구의 인편 1개의 무게는 7 g 내외로 종구용으로 는 조금 큰 편이다. 종구 증식 과정에서 세대를 거듭할수록 구의 크기가 작아지므로 세대를 거듭할수록 종구로 사용하기 에 적절할 것으로 보인다. 그러나 생장점을 배양한 마늘의 생 육은 일반 마늘에 비하여 OYDV, LYSV 그리고 SLV의 감염 률이 현저하게 낮았으며, 정상적인 마늘의 형태를 갖춘 3세대 에서 일반마늘보다 2.3배나 무게가 더 무거웠다. 이것은 일반 재배되고 있는 마늘이 바이러스 감염에 의하여 매우 큰 피해 를 입고 있다는 것을 입증하는 결과이다. 생장점 배양에 의하 여 마늘의 품질과 수량이 높아질 수 있으며, 외부의 진딧물 등 매개충이 침입할 수 없는 망사를 설치한 하우스 내에서 바 이러스 감염확산을 최소화하며 씨마늘을 증식할 수 있는 가능 성을 나타낸다. 황 등(2004)은 다신초 유도를 통하여 생산한 한지형 마늘의 조직배양 종구를 이용하여 재배시험을 한 결과 3세대가 5세대보다 생산력이 우수하였으나, 생장과 수량의 안 정성은 5세대에서 나타났다고 하였다.

    적 요

    1. 경북지역 한지형 마늘 주산지인 의성지역을 중심으로 OYDV, LYSV, GCLV, SLV 그리고 Allexivirus를 진단한 결 과, 모든 마늘잎의 시료가 한 가지 이상의 바이러스에 복합감 염되어 있었다.

    2. 생장점 배양한 마늘은 1세대부터 3세대까지 OYDV와 SLV는 전혀 검출되지 않았다. 생장점 배양 마늘의 1세대는 GCLV 3.8%, Allexivirus 3.1%의 바이러스 감염률을 나타내었 으며, 생장점 배양 마늘 2세대는 LYSV 3.4%, GCLV 21.7% 그리고 Allexivirus 10.0%를 나타내었다. 생장점 배양 마늘 3 세대는 GCLV 17.5%, Allexivirus 7.5%의 바이러스 감염률을 나타내었다.

    3. 의성지역의 바이러스에 감염된 일반마늘 1통의 평균 무 게는 29.3 g 이었으나, 생장점 배양에 의하여 증식된 2세대 마 늘 1통의 평균 무게는 57.6 g, 3세대 마늘 1통의 평균 무게는 66.2 g 이었다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    본 연구는 농촌진흥청 어젠다 사업(과제번호: PJ012638062019) 의 지원에 의해 수행되었다.

    Figure

    KSIA-32-1-18_F1.gif

    Symptom of virus mixed infections on the leaves of garlic and healthy one. (A, Mosaic and stripe symptom of virus infected ; B, meristem cultured)

    KSIA-32-1-18_F2.gif

    Detection of OYDV, SLV, LYSV, GCLV and Allexiviruses using RT-PCR from growing garlics of farmer’s fields in Uiseong area.(M;marker, P;positive control, 1~11, 1~9; sample, 602 bp; OYDV, 281 bp; Allexivirus, SLV; 203 bp, LYSV; 316 bp, GCLV; 481 bp)

    KSIA-32-1-18_F3.gif

    Results of diagnosis using RT-PCR method about first generation leaf of meristem culture garlic.(M;marker, P;positive control, 1~8, 1~8; sample, 602bp; OYDV, 281bp;Allexivirus, SLV; 203bp, LYSV; 316bp, GCLV; 481bp)

    KSIA-32-1-18_F4.gif

    Growth comparison of 1st, 2nd, and 3rd generation garlic and general garlic.(Bulblet 1st generation; Produced in vitro, Bulb 2nd generation; Produced using first generation as seed garlic, Bulb 3rd generation; Produced using second generation garlic as seed, Bulb general garlic; Produced from farmers fields)

    Table

    Specific primers for detecting a garlic infecting viruses

    Virus infection rate of northern-type garlic in farming fields, three area from 2015 to 2017.

    Virus infection rate by generation in the garlic of meristem culture garlic.

    Garlic bulb growth characteristics of the meristem culture garlic as generations and normal cultivated garlic in farmers’ fields.

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