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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.32 No.3 pp.255-264
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2020.32.3.255

Evaluation of Foreign and Domestic Chinese Cabbage Germplasm for the Resistance to Turnip Mosaic Virus

In Gyeong Park, Eun Seo Lim, Su Kim
Institute of Plant Analysis Technology Development, The Saeron co., Suwon Venture Valley 2 A823, 142-10, Saneop-ro 156beon-gil, Gwonseon-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, 16648, Republic of Korea
Corresponding author (Phone) +82-31-5182-8112 (E-mail) gmsu25@thesaeron.co.kr
August 13, 2020 August 31, 2020 September 4, 2020

Abstract


One hundred seventy Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) accessions were mechanically inoculated to evaluate resistance to Turnip mosaic virus (TuMV) using a stain of TuMV which infects systemically Chinese cabbage plants. The inoculated Chinese cabbage plants were grown at 20±2°C and resistance to TuMV had been assessed by viral symptom development for 4 weeks. Among the inoculated Chinese cabbage germplasm, 157 accessions developed typical symptoms of TuMV, such as mosaic, chlorosis, and mottling. These accessions were also examined by RT-PCR analysis using primers specific to TuMV coat protein (CP) gene, suggesting that TuMV is responsible for the disease symptoms and they were susceptible to TuMV. In contrast, 13 Chinese cabbage accessions did not produce any symptoms in systemic leaves until 5 weeks. Further examination of TuMV infection for the 13 accessions using RT-PCR for TuMV CP gene confirmed no TuMV infection in systemic leaves among these accessions. These results indicate that the 13 Chinese cabbage accessions are resistant to TuMV.



국내외 수집 배추 유전자원의 순무모자이크바이러스 저항성 평가

박 인경, 임 은서, 김 수
더새론 식물분석연구소

초록


    Rural Development Administration
    PJ014501022020

    서 론

    배추(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)는 국내에서 무, 고 추, 마늘과 함께 4대 채소작물이다. 2019년 국내 배추 재배면 적은 최근 기상 악화, 소비 감소 등으로 인하여 다소 감소 추 세이지만 10,968 ha이며 생산량은 1,059,925톤에 달하는 주요 채소작물이다(KOSIS, 2019). 배추의 연작재배지 등에서 바이 러스병과 각종 병해가 점차 증가하여 수량 및 품질감소의 원 인이 되고 있으며, 바이러스 병해 중 순무모자이크바이러스 (Turnip mosaic virus, TuMV)를 비롯한 5종의 바이러스들이 보고되었다.(Choi & Choi, 1992;Chung et al., 2015;Ham, 1995;Kim et al., 2012).

    일반적으로 가을배추가 주요한 재배형태인 국내에서 바이러 스병은 진딧물 등 매개충의 주요 활동시기와 달라 생산에 피 해가 덜한 것으로 알려지고 있다. 아울러 잎을 이용하는 작물 이므로 출하까지의 생육 기간이 짧아 더욱 그러한 것으로 알 려지고 있다(Hur & Rho, 2003). 그러나 기후 변화 등으로 가 을 매개충의 활동기간이 연장되어 배추 생육 기간에 바이러스 감염 확산요인이 증가할 가능성과 같은 불안요소가 커지고 있 어 바이러스 감염확산에 대한 대책이 사전에 필요한 시점이다.

    Potyvirus속(屬, genus)으로 분류되는 TuMV는 아시아, 북미 및 유럽 등 세계적으로 경제적 피해를 지속적으로 발생시키는 중요한 바이러스이다(Tomlinson 1987;Provvidenti, 1996;Walsh & Jenner 2002;Mitchell & Bond 2005). TuMV병은 중국을 비롯한 일부 지역에서는 곰팡이, 박테리아 병원균보다 큰 피해를 주는 것으로 알려져 있다(Ma et al., 2010). TuMV는 배추를 비롯한 주요 배추과 작물들(Brassicaea), 잡초 들을 포함한 300여 종 이상의 식물을 감염하며, 약 90여 종의 진딧물을 통한 비영속적(nonpersistent) 전반을 하는 것으로 보 고되었다(Choi & Choi, 1992;Raybould et al., 1999;Shukla et al., 1994). 병리학적으로 TuMV는 TuMV (B)계통(배추과 작물 감염되나 병징 없음, 무 감염 못함), TuMV B계통(배추 과 작물 병징 발현, 무 감염 못함), TuMV B(R)계통(배추과 작물 병징 발현, 무 감염되나 병징 없음), TuMV BR계통(배 추과 작물, 무 병징 발현)으로 구분하고 있다(Ohshima et al., 2002, 2007). TuMV의 감염 증상은 모자이크, 엽맥괴사, 얼룩 등 다양하며 엽맥의 괴사는 모자이크 증상보다 더 심각한 피 해를 주는 것으로 보고되었다(Farzadfar et al., 2009). TuMV 감수성 배추의 손실을 줄이기 위한 예방은 조기진단으로 감염 주를 제거하거나 진딧물 구제를 들 수 있으며, 배추 재배 기 간에 해충 방제를 위한 화학 농약의 반복적인 사용이 불가피 하다. 그러나 이들 화학 농약은 환경안전에 대한 우려가 커지 고 있어 저항성 육종의 관심이 높아지고 있다(Ma et al., 2010). 따라서 TuMV에 대한 피해를 줄이기 위해서는 저항성 품종 육성이 필요하며, 성공적인 저항성 육성을 위해서는 다 양한 저항성 유전자원을 확보하는 것이 유리하다.

    본 연구는 국내 및 국외 수집 유전자원의 TuMV 저항성을 평가하여 선발된 저항성 유전자원을 저항성 품종의 육성에 활 용하고자 수행되었다.

    재료 및 방법

    바이러스 접종원 및 식물 재배

    저항성 평가를 위한 TuMV 접종원은 Yoon et al. (2017b) 의 연구에 이용한 TuMV HY 계통을 분양받아 공시 바이러스 로 사용하였다(국립원예특작과학원 분양). 순무모자이크 바이 러스 HY계통의 감염 증상은 배추에서 모자이크, 황화 병징 및 무에서 모자이크 및 위축 등 전신감염을 시킬 수 있는 계 통으로 보고되었다(Yoon et al., 2017b). HY계통은 BR 계통 인 TuMV FD27J 계통(accession no. AB093618)과 외피 단 백질의 아미노산 서열이 100% 일치하는 것으로 보고되었다 (Yoon et al., 2017b). 배추에 대한 저항성 평가를 위해 TuMV HY계통의 증식은 무 품종(태청; 신제타, 대한민국 서 울)에서 10 mM 인산완충액(pH 7.0)에 즙액 접종하여 병징이 발현된 잎을 감염원으로 저항성 평가에 사용하였다. 감염원은 즙액 접종을 위해 1 g 감염 잎/3 ml 10mM 인산완충액(pH 7.0)의 농도로 가정용 믹서기로 마쇄 한 다음 3000 rpm, 30 min으로 스핀 다운하여 상등액을 접종에 이용하였다.

    배추 저항성 평가 및 바이러스 검출

    저항성 평가를 위한 배추 국내외 수집 유전자원 170개 (Table 1)를 국립유전자원 센터로부터 분양받아 상토(바로커; 서울바이오,대한민국 음성)에 파종하여 본 잎이 3~4장인 시기 에 접종하였다. 접종 현탁액의 농도는 1 mg의 TuMV HY 계 통을 증식한 무 잎에 3 ml 인산완충액(10 mM potassium phospathe, pH 7.0)을 가하여 마쇄한 후 접종하였다. 1개 유 전자원 당 12개체에 mesh 600크기 연마제(Carborundum®; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 뿌린 후, 준비한 현탁액을 면봉을 사용하여 접종하였다. 접종 후 20±2°C에서 4 주간 생육시킨 후 발병을 조사하였다. 발병조사 기준은 그림 1에서 보는 바와 같이 병징 없을 경우 저항성으로, 모자이크, 황화, 괴사 등의 병징이 나타나면 감수성으로 평가하였다.

    아울러 정확한 선발을 위해 병징을 나타내지 않은 유전자원 을 대상으로 TuMV를 검출하였다. 배추 상엽에서 전체 RNA 를 식물 RNA 추출 kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용 하여, 제조회사에서 제공된 방법을 이용하여 추출하였다. 추출 된 RNA는 TuMV-CP-For (5’-gcaggtgaaacgcttgatgcaggtttg-3’), TuMV-CP-Rev (5’-taaccccttaacgccaagtaagttatg-3’)라 명명된 프 라이머들과 함께 One-Step SuperScriptIII® 역전사중합효소 kit (Thermo Scientific)를 이용하여 65°C, 10분(1회), 얼음에 5분간 방치 후, PCR 기기를 이용하여 55°C, 30분 및 95°C, 2분(각 1회), 94°C, 20초, 55°C, 30초, 72°C, 60초(35회 반복), 72°C, 10분(1회) 증폭 반응을 시켰다. 반응 후 1.2% 아가로스겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 산물을 확인하였다.

    결과 및 고찰

    배추 유전자원들의 TuMV 감염증상

    농촌진흥청 농업유전자원센터에서 분양받은 170개의 유전자 원을 접종 후 4주(28일 경) 후에 TuMV-HY 감염 증상을 조 사한 결과, 그림 1에서 보는 바와 같이 7종류의 병징으로 분 류되었다. 모자이크(mosaic: M)는 IT32747 등 155개, 엽맥녹 대(vein banding: VB)는 IT103155 등 5개, 엽맥투명화(vein clearing: VC)는 IT113292 등 4개, 괴사(necrotic local lesion: NLL)는 IT101058 등 8개, 위축(stunting: S)은 IT103641 등 9개, 얼룩(mottle: Mo)은 IT100483 등 9개, 퇴록반점(chlorotic spot: CS)은 IT102700 등 6개 자원으로 조사되었다(Table 2). 이들 병징은 유전자원에 따라 다르게 나타났으며 동일 유전자 원 내에서 여러 병징이 나타나는 경우는 조사되지 않았다. 한 편 모자이크 증상이 극심해져 증상이 다양하게 나타나는 것은 아니었으며 각각의 병징이 유전자원별로 구분되는 것을 확인 하였다. 그리고 얼룩 병징의 경우는 잎의 변형을 함께 나타내 어 위축과 유사한 증상을 보이지만 위축은 잎이 다소 두꺼워 지는 경향을 보여 얼룩과 구별되었다. 괴사는 처음에는 잎에 부분적으로 나타났으나 극심할 경우는 잎의 전면이 괴사하는 증상을 보였다. 퇴록반점은 엽육이 얇은 자원(IT111017, IT111116 등)에서 나타났다. Yoon et al.(2017b)은 TuMV의 감염에 의한 배추, 무 등 다양 식물체의 병징을 황화 (yellowing), 모자이크 (mosaic) 퇴록 (chlorosis), 국부괴사 (necrotic local lesion), 위축 (stunting) 등을 조사하였다. 배추 의 경우는 황화 (yellowing), 모자이크 (mosaic) 퇴록 (chlorosis)가 병징으로 나타나 본 연구의 결과와 다소의 차이 를 보였다. 이것은 170개의 다양한 유전자원에서 병징을 평가 하여 나타난 차이로 생각된다. Chung et al. (2015)은 TuMV 의 병징 발현이 23~28°C에서 바이러스 외피 단백질의 축적이 가장 많은 것으로 보고하여 온도 관리가 원활한 실내 항온항 습 시설을 이용하는 것이 다양한 병징 발현에 유리할 것으로 판단된다. 한편 다양한 병징은 식물체 내의 유전자 상호작용 과 관련이 있으며 TuMV에 감염되면 배추의 염색체 6번상의 rnt1-2에 의한 괴사, rnt1-2rnt1-3의 상호작용에 의한 모자 이크와 엽맥 주변의 약한 괴사, 잎의 변형 등이 나타나는 것 으로 보고하였다(Fujiwara et al., 2011). 애기장대에 TuMV를 접종하여 과민반응(hypersensitivity response: HR)와 같은 병 징을 관찰하였고(Kim et al., 2008), 담배 N gene의 코딩 염 기서열 또는 프로모터 부위에 변화를 준 형질전환체에서 과민 반응의 변화가 생겨(Dinesh-Kumar et al., 2000), 전신 괴사 반응은 저항성 반응과 관련이 있음을 제시하는 것으로 보고되 고 있다(Fujiwara et al., 2011).

    유전자원 평가에서 괴사가 나타난 자원의 저항성 여부를 본 연구 결과에서 판단할 수는 없으며 추가 연구가 필요한 부분 이다. 따라서 본 연구 결과는 TuMV 단독 감염에 대한 배추 유전자원에 대한 발병 판단의 기준 마련에 이용할 수 있을 것 으로 판단된다.

    배추 유전자원들의 TuMV 저항성 평가

    국내 및 국외 170개의 유전자원에 대한 저항성 평가 결과, 14개의 유전 자원이 병징이 나타나지 않았으나, RT-PCR 결과 하나의 자원에서 바이러스가 검출되었다(Table 3, Fig. 2). 따 라서 최종적으로 13점의 자원이 저항성으로 선발되었다. 국가 별로는 중국 3, 홍콩 1, 인도네시아 1, 일본 5, 네덜란드 1, 미국 2개의 유전자원이었으며, 그 외 공시한 국내 수집 유전 자원에서는 저항성이 없는 것으로 나타났다. 국내 수집 유전 자원인 Tongyeong-1985-3268 (IT103268)은 접종 후 28일경 증상이 없었으나 이후 35일경 병징이 나타났으며 RT-PCR 결 과 바이러스가 검출되어 감수성으로 평가하였다(Fig. 2). TuMV에 대한 저항성 품종 육성을 위해서는 국내 수집 유전 자원에서 저항성 자원이 없어 국외 저항성 유전자원의 도입이 필요한 부분이다.

    본 연구에서 선발한 자원은 TuMV의 증상이 전혀 나타나지 않는 자원을 선발하였으며, 학술적인 의미의 중도저항성 등의 평가는 이루어지지 않았다. 왜냐하면, 바이러스는 생육 초기감 염이 가장 문제시되고 있기 때문이다. TuMV와 오이모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV)가 중복으로 감염될 경우 CMV 농도가 36배까지 식물체 내에서 증가하며, CMV 는 전자현미경 관찰 결과, 세포질을 포함하여 액포막 주변에 서도 많은 입자가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 TuMV는 연한 모자이크 조직에서만 존재하는 것을 확인하였 다(Sano & Kojima, 1989;Yoon et al., 2017a). Ishimoto et al. (1990)은 TuMV에 의해 전신 이동성이 빨라져서 CMV 의 농도가 증가하는 것으로 보고하였다. 따라서 생육 초기감 염된 식물체의 경우 재배 기간에 복합감염 가능성이 크므로 상업육종을 위한 TuMV 저항성 선발은 저항성 자원이 전혀 없는 경우가 아니므로 중도저항성 이상의 저항성 수준을 보이 는 개체를 선발할 필요가 있다.

    선발된 유전자원은 Fig. 3에서 보는 바와 같이 배추와 유사 한 특성을 보여주고 있으며 품종육성과 관련하여 원예적 특성 은 재배연구를 통하여 품질 등에 대한 상세한 평가가 이루어 져야 할 것이다.

    한편 유전자원을 통한 유용형질의 도입은 해당 형질을 보유 한 자원의 다양성이 가장 중요한 부분이며, Jeon et al. (2018)은 배추 아시아 도입 유전자원의 뿌리혹병 저항성 평가 를 통하여 저항성 자원의 다양성 확보가 품종육성을 위해 중 요함을 보고하였다. 본 연구에서 선발된 TuMV에 대한 13개 의 유전자원은 배추 품종육성에 이용되어 종자 수출 활성화와 농가 피해 감소에 기여할 것으로 생각한다.

    적 요

    1. 배추(Brassica rapa L. ssp. pekinensis) 국내외 수집 유 전자원 170점에 대한 TuMV(Turnip mosaic virus, TuMV) 저항성 유전자원을 선발하기 위하여, 유전자원의 잎에 국내 분 리 계통인 TuMV-HY을 즙액 접종하였다.

    2. TuMV를 접종한 배추 유전자원 개체들은 20°C±2°C에서 재배하였으며 4주 동안 바이러스 병징 발현을 육안으로 조사 하여 저항성을 평가하였다.

    3. 배추 유전자원은 약한 모자이크, 얼룩에서 심한 모자이크 등의 전신 감염 병징을 보였으며 TuMV 감염이 역전사중합효 소반응으로 확인되었다.

    4. 바이러스 병징을 보인 배추 유전자원들은 TuMV에 대한 감수성 유전자원들로 판정되었다. 이들 중 공시한 국내 수집 자원들 모두가 감수성으로 판정되었다.

    5. 13개 배추 유전자원들은 감수성 개체들에서 관찰된 모자 이크 등 전신 감염 병징이 발현되지 않았으며 35일 동안 병징 이 관찰되지 않았다.

    6. 역전사중합 효소 연쇄반응으로 조사한 결과 13개 배추유 전자원들의 상위 잎들에서 TuMV가 검출되지 않았으므로 13 개 배추유전자원들이 TuMV에 대한 저항성 계통들로 판정되 었다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    이번 연구는 농촌진흥청 연구사업(과제번호:PJ014501022020) 의 지원에 의해서 수행되었습니다.

    Figure

    KSIA-32-3-255_F1.gif

    Symptoms of Chinese cabbage accessions inoculated with turnip mosaic virus (TuMV)-HY. A, mosaic; B, vein banding; C, vein clearing; D, necrotic local lesion; E, stunting; F, mottle; and G, chlorotic spots

    KSIA-32-3-255_F2.gif

    Detection of turnip mosaic virus (TuMV) by RT-PCR among Chinese cabbage accessions resistant to TuMV. 1: IT32739, 2: IT32740, 3: IT32751, 4: IT120033, 5: IT120031, 6: IT120019, 7: IT120020, 8: IT120058, 9: IT120062, 10: IT135456, 11: IT103268, 12: IT120022, 13: IT120018, 14: IT120048, C: Positive control NC: Healthy plant, size marker: 100bp plus ladder

    KSIA-32-3-255_F3.gif

    Leaf shapes among seedlings of Chinese cabbage accessions resistant to turnip mosic virus (TuMV), which showed no symptom in TuMV inoculation. Introduction number of gene bank of National Agrobiodiversity Center of Rural Development Administration(RDA)

    Table

    Lists of 170 Chinese cabbage accessions evaluated for the resistance to turnip mosaic virus (TuMV)

    <sup>z</sup>Introduction number of gene bank of National Agrobiodiversity Center of Rural Development Administration, Korea.
    <sup>y</sup>The abbreviation of the place of origin is: CHN_China, AUT_Austria, HKG_Hong Kong, KOR_Korea republic of, IDN_Indonesia, JPN_Japan, NLD_Nederland, TWN_Taiwan, USA_United States of America.

    Symptoms of Chinese cabbage accessions inoculated with TuMV-HY

    <sup>x</sup>Symptoms are briefly shown as symbols. A, mosaic (M); B, vein banding (VB); C, vein clearing (VC); D, necrotic local lesion (NLL); E, stunting (S); F, mottle (Mo); G, chlorotic spots (CS). <sup>z</sup>Introduction number of gene bank of National Agrobiodiversity Center of Rural Development Administration(RDA), Korea. <sup>y</sup>The abbreviation of the place of country is: CHN_China, AUT_Austria, HKG_Hong Kong, KOR_Korea republic of, IDN_Indonesia, JPN_Japan, NLD_Nederland, TWN_Taiwan, USA_United States of America.

    Chinese cabbage accessions showing resistance to turnip mosaic virus (TuMV) strain

    <sup>z</sup>Introduction number of gene bank of National Agrobiodiversity Center of Rural Development Administration(RDA), Korea. <sup>y</sup>The abbreviation of the place of country is: CHN_China, AUT_Austria, HKG_Hong Kong, KOR_Korea republic of, IDN_Indonesia, JPN_Japan, NLD_Nederland, TWN_Taiwan, USA_United States of America.

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