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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.32 No.4 pp.327-338
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2020.32.4.327

International Research Trend on Fruit Tree Virus Elimination

So Young Eun, Kang Hee Cho, Se Hee Kim, Sang-Yun Cho, Il Sheob Shin, Ji Hae Jun
Fruit Research Division, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
Corresponding author (Phone) +82-63-238-6712 (E-mail) khc7027@korea.kr
August 27, 2020 October 25, 2020 November 3, 2020

Abstract


Plant viral diseases are incurable and reduce fruit yield and quality, causing economic losses. Damages vary depending on the virus-host combination, virulence, and cultivar susceptibility. Therefore, the fundamental way to prevent virus damage is to cultivate virus-free plants. Thermotherapy, cold therapy, chemotherapy and cryotherapy combined with microshoot tip culture are used to eliminate fruit tree viruses. This review describes fruit viral diseases and summarizes the current elimination methods. Next-generation sequencing (NGS) has also been used to identify and diagnosis new fruit crop viruses. Therefore, studies are needed to optimize elimination methods for NGS-identified viruses.



과수 바이러스 제거 기술 최신 국제 연구 동향

은소영, 조강희, 김세희, 조상윤, 신일섭, 전지혜
농촌진흥청 국립원예특작과학원 과수과

초록


    Rural Development Administration(RDA)
    PJ01448101

    서 론

    과수나무에 발생하는 바이러스는 과실의 품질 저하 및 수 량 감소 등의 생산성을 저하시키고, 생리적 불균형을 야기해 경제적 손실을 발생시킨다. 과수작물은 대부분 접목 또는 삽목 을 통해 영양번식을 하므로, 일단 바이러스에 감염되면 세대 간의 전염으로 이어지는 것이 큰 문제이다(Barba et al., 2015;Hu et al., 2017;Nickel & Fajardo, 2014). 따라서 바이러스 피해를 예방하기 위해서는 무병 대목 및 접수를 사용한 무병 주(virus-free plant)의 식재가 근본적인 대책이다. 바이러스에 감염된 사과나무는 수세가 천천히 저하되며 과실이 작아지고 당도 및 상품성 저하를 초래하는 등 만성적인 피해가 나타나 는데, 국내 사과에서 20-40%의 생산량이 감소되는 것으로 확 인되었다(Kim et al., 2011). 또한 바이러스와 바이로이드는 복 합감염이 단독감염보다 생산량을 더 감소시키며(Han et al., 2015), 단독감염에서 주로 증상이 나타나지 않지만 복합감염일 때 바이러스가 뿌리까지 감염됨으로써 증상이 뚜렷하게 나타 난다(Barba et al., 2015). 사과줄기그루빙바이러스(Apple stem grooving virus, ASGV)는 주로 사과나무에 감염되는 바이러스 병 중의 하나로서 세계적으로 감염분포가 매우 넓고, 그 감염 이 지속적으로 보고되고 있다(Ji et al., 2013). ASGV는 다른 사과 바이러스인 사과황화잎반점바이러스(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV), 사과모자이크바이러스(Apple mosaic virus, ApMV), 사과줄기홈바이러스(Apple stem pitting virus, ASPV)에 비해 제거가 어려운 바이러스로 알려져 있다(Wang et al., 2006, 2016). 국제적으로 과수나무에서 바이러스가 없는 식물체의 확보는 생장점 배양 및 열처리 방법을 통해 무병주 를 획득하거나, 다양한 바이러스 제거 기술과 생장점 배양을 병행하여 발전하였다(Dĩas-Barrita et al., 2007;Maliogka et al., 2009, 2015). 기내배양 기술은 바이러스가 없는 식물을 생 산하기 위한 가장 성공적인 방법이며(Knapp et al., 1995;Panattoni et al., 2013;Smith et al., 2017), 정단분열조직 (apical meristem 또는 apical dome)과 엽원기(leaf primordium) 를 포함하여 배양하는 경정배양(microshoot tip culture), 한냉 처리법(cold therapy), 화학적 처리법(chemotherapy), 열처리법 (thermotherapy) 및 초저온처리법(cryotherapy) 등 식물 바이러 스 제거를 위한 다양한 방법이 확립되었다. 단독 제거기술 보 다는 서로 병행하여 처리하는 것이 바이러스 제거에 더 효과 적이라는 것이 여러 연구에 의해 입증되었다(Wang et al., 2008;Zhao et al., 2018). 현재까지 보고된 바이러스 제거기 술은 성공적이지만 많은 시간과 노력이 소요된다(Wang et al., 2014). 바이러스를 성공적으로 제거하기 위해서는 생장점을 0.1-0.3 mm로 미세하게 절취해야 하는데 경정조직의 크기가 크면 재생률은 높아지지만 바이러스 제거율은 낮아진다(Wang et al., 2016). 또한 열처리 방법도 모든 바이러스를 성공적으 로 제거하지 못하며, 고온에 취약한 식물체도 존재한다 (Bhojwani & Dantu, 2013;Hu et al., 2017). 그러므로 무병 주 생산 시 과수 품종 및 생육 단계별 기내배양 기술과 효과 적인 바이러스 제거기술이 확립된다면 향후 과수 무병주 생산 에 매우 유용하게 활용될 수 있다. 지난 수십 년간 바이러스 와 식물체 간의 상호작용 연구결과를 바탕으로 도출된 중요한 연구를 통해 새로운 바이러스 제거 방법들이 연구되고 있다. 축적된 연구내용을 바탕으로 과수 바이러스 제거 기술에 대한 최신 연구 동향 및 이를 활용한 바이러스 제거 방법을 기술하 고자 한다.

    본 론

    1. 과수에 발생하는 주요 바이러스와 피해 증상

    과수에서는 과종별로 다양한 종류의 바이러스가 분포하는 것으로 알려져 있으며, 국제적으로 새로운 바이러스에 대한 동 정이 지속적으로 보고되고 있다(Cho et al., 2017;Islam et al., 2020). 주로 사과, 배에 발생하는 바이러스는 ACLSV, ASPV, ASGV 등이며, 일반적으로 재배 품종에서 직접적인 피 해증상은 잘 나타나지 않으나, 복합감염의 형태로 흔히 발생 하여, 바이러스에 민감한 대목에 고접병을 일으킬 수 있다(Hu et al., 2015;Paprstein et al., 2008, Fig. 1). 사과과피얼룩바 이로이드(Apple scar skin viroid, ASSVd)는 주로 사과 과실 의 착색 불량, 과피 얼룩 및 과중 감소를 초래하여 품질을 저 하시킨다(Kim et al., 2010;Kwon et al., 2002, Fig. 2). ASGV는 배 품종인 ‘신고’ 잎에 부정형의 검은 점을 유도하고 (Cho et al., 2010), 사과 ‘화홍’에 생장량 지수와 과실 경도에 영향을 준다(Kim et al., 2009). 전 세계적으로 복숭아에 발생 하는 바이러스와 바이로이드는 ACLSV, 핵과류괴사원형반점 바이러스(Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV), 자두곰보 바이러스(Plum pox virus, PPV), 호프왜화바이로이드(Hop stunt viroid, HSVd) 및 복숭아잠재모자이크바이로이드(Peach latent mosaic viroid, PLMVd) 등이 있다. 사과, 배, 포도와 같이 접목 전염을 통해 감염되어 잎과 과실에 이상증상을 유 발시켜 수세 약화 및 생산량 감소로 경제적 피해를 준다 (Cambra et al., 2006;Pusey & Yadava, 1991). 포도에 발 생하는 바이러스는 포도얼룩반점바이러스(Grapevine fleck virus, GFkV), 포도잎말림바이러스(Grapevine leafroll associated virus, GLRaV), 포도부채잎바이러스(Grapevine fanleaf virus, GFLV), Grapevine yellow speckle viroid (GYSVD)-1, 2 등 이 있다. GLRaV-3에 감염된 포도나무는 잎이 붉게 변하면서 황화 모자이크 증상과 잎말림 증상이 나타난다(Fig. 3). GFkV 및 GLRaV-1, 2, 3는 포도 식물체의 체관에만 한정적으로 존 재하는 바이러스로 접목 전염을 통해서만 감염되며 종자로는 전염되지 않는다(Martelli et al., 2002). 특히, GFkV는 증상 이 나타나지 않는 잠복 감염형태로 존재하며, 다른 포도 바이 러스와 복합감염 시 과실의 품질에 부정적인 영향을 끼쳐 생 산량을 저하시킨다(Coetzzo et al., 2010;Komar et al., 2007;Kovacs et al., 2001). 이와 같이 바이러스에 의한 피 해는 점점 증가되고 있지만 이에 대한 방제 대책은 신속한 소 각 외에는 전무한 상황이다. 따라서 효과적으로 바이러스를 제 거할 수 있는 다양한 바이러스 제거 기술이 개발되어야 할 것 이다.

    2. 바이러스 감염이 과수의 생육 및 과실 품질에 미치는 영향 평가

    포도나무에 있어서 바이러스 감염이 나무 생장과 과실 품질 에 미치는 영향이 다수 보고되었다(Alabi et al., 2016;Atallah et al., 2012;Endeshaw et al., 2014;Naidu et al., 2014). GLRaV는 세계적으로 많은 지역에서 발생하고 있고 경 제적으로도 피해를 주고 있다(Naidu et al., 2014). 포도나무의 수량 감소와 과실 품질 저하에 의해 GLRaV 감염에 의한 경 제적 손실은 25,000-40,000$/ha로 추정되었다(Atallah et al., 2012). Endeshaw et al.(2014)의 보고에 의하면 GLRLaV-3에 감염된 ‘Cabernet Franc’ 포도나무는 건전주에 비해 수량과 가 용성 고형물 함량(soluble solids content)이 각각 40%, 43% 감소하였으나, 과립의 페놀화합물과 안토시아닌 함량은 유의 적인 차이가 없었다. 결과적으로 포도나무에 있어서 GLRLaV- 3의 감염은 CO2 동화작용(assimilation), 수량, 덩굴 크기, 가지 목질화를 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 GLRLaV-3와 GFkV가 복합 감염된 ‘Vidal blanc’ 포도나무는 건전주에 비해 평균 과립중이 7% 감소되었고, 적정산도(titratable acidity)는 14% 높았다(Kovacs et al., 2001). GLRaV가 포도의 수량 및 과실과 와인의 품질에 미치는 영향은 계절에 따라 달라 서늘 한 계절에 영향이 더 큰 것으로 관찰되어, 기주식물과 환경과 의 상호작용에 많은 영향을 받는 것으로 보인다(Alabi et al., 2016). Raspberry bushy dwarf virus (RBDV)에 감염된 블랙 베리(blackberry) ‘Marion’은 가지 생장과 과실 수는 영향이 없었지만 건전주에 비해 수량이 40-50%, 과중이 23-40%, 과 실 당 소핵과(drupelet) 수가 36-39% 감소되었다(Strik & Martin, 2003). PPV에 감염된 자두는 감염 수준에 따라 건전 주에 비해 과중, 과육 색, 경도, 당, 유기산, 안토시아닌 및 플 라보놀 등의 함량에 변화가 있었다(Usenik et al., 2015). 최 소 5년 이상의 장기간 감염된 나무에서 수확한 과실은 원예적 형질이 불량하였고, 영양 및 페놀화합물의 조성의 변화가 가 장 많았다. 감염기간이 3년 정도인 단기간 감염된 나무에서 수 확한 과실은 유의적으로 파이토케미컬(phytochemical) 성분의 조성이 변화되었지만 과실과 같은 원예적 형질은 유의적으로 변화가 없었다. 또한 PPV 감염 수준은 성숙과정에 영향을 미 쳐 PPV 감염으로 과실 성숙이 10-15일 더 빨라졌다.

    3. 다양한 과수 바이러스 제거 기술

    국제적으로 과수 바이러스를 제거하는 방법은 열처리, 한냉 처리, 항바이러스제 처리 및 초저온처리법 등 다양한 기술이 이용되고 있다. 그러나 단독처리만으로는 감염된 바이러스를 완전히 제거할 수 없기 때문에 대부분 경정배양과 함께 사용 하고 있다. 더 나아가 열처리한 식물체의 경정조직을 초저온 처리하는 방법까지 적용하고 있다. 현재까지 과수작물의 바이 러스를 제거하고 무병주 생산에 적용한 기술은 아래와 같다.

    가. 경정배양법(Microshoot tip culture)

    식물 RNA 바이러스는 식물체 내에서 광합성 산물이 이동 하는 경로를 따라 체관을 통하여 식물체 전체로 이동한다 (Citovsky & Zambryski, 2000). 그러나 식물의 정단분열조직 에는 체관 조직의 연결통로인 유관속계(vascular system)가 없 어 바이러스가 원형질연락사(plasmodesmata)를 통해 세포 간 이동이 가능하나 그 속도가 매우 느려 활발히 생장하는 생장 점에는 바이러스가 없거나 그 밀도가 낮다(Lizárraga et al., 2017). 따라서 바이러스를 효과적으로 제거하기 위해 생장점 과 엽원기 1-3매를 포함한 경정조직을 배양하는 방법이 과수 뿐만 아니라 고구마, 마늘 등 다양한 작물에서 이용되어 왔다 (Jung et al., 2020;Nam et al., 2016). 이 방법은 미세번식 (micropropagation)과 달리 배양 시 낮은 호르몬 수준과 짧은 배양기간으로 인해 돌연변이의 가능성과 이형주(off-type plant) 의 발생을 낮출 수 있다(Golino et al., 2017). 특히, 정단분열 조직의 배양은 체관에만 한정적으로 존재하는(phloem-limited) 바이러스를 제거하는데 효과적이다(Gambino et al., 2006). 과 수, 장미, 고구마 무병주를 생산하는 미국 Foundation Plant Services에서는 경정배양 방법만으로 포도에 발생하는 바이러 스를 제거하고 있다(Golino et al., 2017). 무병화가 진행 중인 포도 349개의 자원을 대상으로 경정배양한 결과 바이러스가 검출되지 않은 자원의 비율은 89.7%로, 포도 무병주 생산에는 경정배양이 매우 효과적임을 알 수 있었다. Kwon et al. (2019)은 ACLSV, ASPV, ASGV가 복합 감염된 사과 왜성대 목 M.9과 M.26을 이용하여 고온처리(37°C, 6주), 항바이러스 제(ribavirin) 처리 및 생장점 배양을 통한 바이러스 제거 효율 을 검토하였다. 그 결과, 생장점 배양에서 바이러스가 제거된 무병주의 획득률이 50.0-51.7%로 고온처리(26.7-31.7%), 항바 이러스제 처리(11.7-21.7%)보다 높아 사과 왜성대목의 무병주 생산에는 생장점 배양이 가장 효과적이었다. 이와 함께, 최근 에는 휴면아를 이용한 경정배양법이 보고되었는데 이는 낮은 온도가 생장점 부위에서 감염되지 않는 부위를 증가시킬 것이 라고 추정하였다(Kim et al., 2017a, 2017b). 바이러스 4종에 복합 감염된 사과 ‘홍로’의 동절기 휴면아의 경정조직(0.4- 1.2 mm)을 배양하여 바이러스 제거 유무를 조사한 결과, 바이 러스 제거율은 ACLSV 100%, ASPV와 ASSVd 93.5%로 높 은 반면, ASGV은 25.8%로 낮았다. 또한 GFkV에 감염된 포 도 ‘거봉’의 동절기 휴면아의 경정조직을 0.3 mm와 0.8 mm 크기로 배양했을 때의 바이러스 제거율은 0.3 mm에서 100% 였으나 0.8 mm에서는 50%였다. 휴면아 경정배양법은 휴면아 상태의 경정조직 그대로 배양하여 별도의 열처리 및 화학적 처리 등의 과정 없이 바이러스가 제거된 식물체를 획득하는 매우 경제적인 방법이다.

    나. 열처리법(Thermotherapy)

    과수에서 바이러스를 제거하고 무병주를 생산하는 전통적인 방법인 열처리 기술은 바이러스 활성보다 식물의 생장 속도가 더 왕성한 점을 이용하여 무병주를 생산할 수 있는 점을 이용 한 기술이다(Hollings, 1965). 높은 온도의 열처리는 바이러스 의 생장점으로 이동을 저해시켜 감염된 경정조직에서 바이러 스가 없는 부분을 넓히는 역할을 한다(Wang et al., 2008;Zhang et al., 2016). 또한 열처리는 바이러스 복제를 억제하 고 바이러스 RNA 분해를 촉진하여 감염된 신초에 있는 바이 러스의 입자를 감소시키는 것으로 알려져 있다(Chalak et al., 2015;Wang et al., 2016). Liu et al.(2016)은 열처리가 바이 러스가 감염된 배 ‘Jinshui no. 2’ 기내 식물체 잎의 RNA silencing을 유도시키고 이와 관련된 유전자들의 up-regulating 을 통해 바이러스 RNA의 분해를 촉진시킨다고 보고하였다. 열처리 방법은 일반적으로 기외 또는 기내 식물체를 36-38°C 이상의 열풍으로 21~35일간 처리한다(Knapp et al., 1995). 그러나 열처리 후 다시 바이러스가 복제되거나 바이러스의 RNA 분해가 억제되는 일이 발생하고, 열처리 온도가 너무 높 으면 작물이 스트레스를 받아 고사되어 생존율이 저하된다 (Paprstein et al., 2008). 또한 바이러스 종류에 따라 열처리의 효과가 달라 ACLSV(66.7%)와 PNRSV(58.3%) 제거에는 효 과적이었으나, 자두위축바이러스(Prune dwarf virus, PDV) 제 거에는 전혀 효과가 없었다는 보고도 있다(Cieślińska, 2007). 열처리법의 성공은 대부분 열처리 후 처리된 식물체의 일부를 제거하는 것과 바이러스와 식물체의 종류에 달려있다 (Cieślińska, 2007;Nyland & Goheen, 1969). 특히 열에 안정 한 바이러스에 대해서는 열처리와 경정배양을 병행하는 것이 효과적이다. 따라서 열처리 단독으로는 이병된 바이러스를 완 전히 불활성화 시킬 수 없는 경우가 많아 경정배양을 병행하 는 보조 수단으로 활용하고 있다(Wang et al., 2008;Zhao et al., 2018). Hu et al.(2019)은 ACLSV, ASPV, ApNMV, ASGV 가 복합 감염된 사과 ‘Xiangfu, Xiangji’를 38°C에서 30일 동 안 열처리한 후 경정배양하였다. 그 결과 생존율은 평균 66.7%이었으며, 바이러스 제거율은 48-13%로 ACLSV 제거율 이 가장 높았고 ASGV 제거율이 가장 낮았다. 배에 있어서는 ACLSV와 ASGV에 감염된 'Huang-Hua' 식물체를 38°C에서 35일 동안 열처리한 후 경정배양하여 바이러스 진단한 결과 생존율은 64%이었고, ACLSV와 ASGV의 제거율을 각각 66.7%, 33.3%였다(Wang et al., 2010). 자두 ‘Earliblue’를 35°C-38°C, 10-12일 동안 열처리한 후 경정배양하였을 때 PNRSV를 100% 제거할 수 있었다(Dziedzic, 2008). Panattoni & Triolo(2010)Grapevine vitivirus A (GVA), GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV가 단독 감염된 포도 ‘Kober 5BB’ (Vitis berlandieri × V. riparia)를 기내 열처리(37°C, 48 일 동안) 후 경정배양하여 바이러스를 진단한 결과 GVA, GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3의 제거율은 각각 70.2%, 100%, 25.1%, 24.7%였으나 GFkV는 전혀 제거되지 않았음은 보고하 였다. 이와 같이 열처리와 경정배양을 병행하는 방법은 가장 빈번하게 과수 바이러스를 제거하는 무병화 기술이며, 과종 및 바이러스별 열처리 조건 및 시간을 확립하는 것이 중요하다. 열처리 및 경정배양을 통해 성공적인 바이러스 제거된 사례를 Table 1에 정리하였다.

    다. 한냉처리법(Cold therapy)

    바이러스에 감염된 식물체를 저온에 일정기간 처리하는 한 냉처리법은 바이러스의 증식을 억제함에 따라 바이러스가 퇴 화한다고 알려져 있다(Lizárraga et al., 1980). 국화왜화바이로 이드(Chrysanthemum stunt viroid, CSVd), 호프잠재바이로이 드(Hop latent viroid, HLVd) 등 고온에 저항성인 바이로이드 를 제거하기 위해 경정배양 전의 한냉처리가 이용되었다 (Adams et al., 1996;Paduch-Cichal & Kryczyński, 1987). El-Dougdoug et al.(2010)은 HSVd에 감염된 복숭아 ‘Florida prince’와 배 ‘Balady’에 대한 한냉처리 등 무병화 방법에 따 른 바이로이드 제거 효율을 비교하였다. 37°C에서 3주 동안의 기내 열처리에서는 복숭아와 배 모두 신초 생존율이 100%였 지만 HSVd 제거율은 0%로 무병화된 개체를 얻을 수 없었다. 그러나 4°C에서 1-3개월 동안의 한냉처리에서는 신초 생존율 이 25-70%로 처리기간이 길어질수록 생존율이 높아졌고, HSVd 제거율은 5-18%로 처리기간이 길어질수록 효율도 높았 다. 더욱이 20 mg/L의 ribavirin이 포함된 배지에 있는 신초를 4°C에서 1개월 동안 한냉처리한 복숭아, 배의 신초 생존율은 각각 63%, 75%였고, 40%의 HSVd 무병화 개체를 얻을 수 있었다. 감에 있어서는 한냉처리를 이용하여 감바이로이드 (Persimmon viroid, PVd)와 감귤바이로이드(Citrus viroid, CVd)를 제거하는 방법이 보고되었다(Kim et al., 2015). PVd 와 CVd가 복합 감염된 ‘부유’의 기내 식물체를 4°C에서 4주 동안 한냉처리한 결과 생존율이 67%였으며 바이로이드 제거 율은 67%였다. 또한 한냉처리와 항바이러스제를 2주 동안 복 합처리 시 바이로이드 제거율은 67%로 동일하여 복합처리를 통해 무병화 처리 기간을 줄일 수 있었다. 앞서 언급한 바와 같이 한냉처리는 HSVd, PVd, CVd 등의 바이로이드를 제거 하는데 효과적으로 사용할 수 있는 방법으로 금후 다양한 과수 작물의 바이러스 무병화에 적용할 수 있을 것으로 생각된다.

    라. 화학적 처리법(Chemotherapy)

    대부분의 화학적 처리법은 1-2 cm 크기의 감염된 신초를 항 바이러스제가 포함된 배지에 최소 30일 이상 배양한 후 항바 이러스제가 없는 배지에서 계대배양(subculture)해서 바이러스 를 제거한다. 항바이러스제 처리를 이용한 바이러스 제거 기 작은 명확히 알려져 있지 않지만, 핵산과 RNA polymerase의 합성을 저해하여 바이러스 복제를 억제시킨다. 따라서 감염된 세포에서 새로 분열된 세포로 방출되는 바이러스 입자가 감소 되면 바이러스가 없는 영역을 늘리거나 경정조직의 바이러스 농도를 감소시킨다(Hansen & Stace-Smith, 1989;Verma et al., 2005). 식물 바이러스에 많이 사용하는 항바이러스제는 ribavirin(Hu et al., 2015;Panattoni et al., 2013;Skiada et al., 2013)이며 2-thiouracil(Ram et al., 2005;Singh, 2015) 도 사용되고 있다. 바이러스 제거에 사용되는 농도는 주로 ribavirin 20-50 mg/L, 2-thiouracil 25-40 mg/L이다. 신초 생존 율과 바이러스 제거율은 사용하는 항바이러스제의 종류와 농 도 및 바이러스·식물체의 종류에 따라 달라진다(Guta et al., 2014;Skiada et al., 2013). ACLSV, ASPV, ASGV가 복합 감염된 사과 ‘Xinhongjiangjun’에 ribavirin 15 mg/L (R15)와 25 mg/L (R25) 단독처리 후 정아(apical), 측아(axillary)를 1.0 mm 크기로 경정배양하면 생존율은 67.7-88.5%였으며, 바 이러스 제거율은 69.6-76.8%였다(Hu et al., 2015). 단독 열처 리(34-38°C, T34-T38) 시 고온일수록 생존율은 감소하였고, 바이러스 제거율은 열처리 온도가 34°C일 때 23.8-42.9%, 36°C에서는 48.1-60.0%였다. 그러나 ribavirin과 열처리를 병행 하였을 때, 바이러스 제거율은 T34+R15에서 72.7-76.9%, T34+R25에서 76.2-81.4%, T36+R15는 80.0-83.3%, T36+R25 는 93.8-83.3%로 높아졌다. 이와 같이 항바이러스제 단독 처 리 보다 열처리와 항바이러스제의 복합 처리가 바이러스 제거 에 더 효과적임을 알 수 있었다. 열처리 및 화학적 처리를 통 해 바이러스 제거가 보고된 연구결과는 Table 2와 같다.

    마. 초저온처리법(Cryotherapy)

    극저온에서의 식물체 초저온동결보존은 대사활동을 방해하 여 유전적 변형 없이 장기 저장이 가능하다(Harding, 2004). 초저온처리법은 액체질소(-196°C)에 짧은 시간 노출시켜 경정 조직 안에 감염된 바이러스를 선택적으로 제거하는 새로운 방 법이다(Wang & Valkonen, 2009). 초저온처리법은 조직배양이 가능하고 초저온기술이 확립되어 있어야 적용할 수 있다. 생 장점 채취 후 캡슐화(encapsulation)-탈수화(dehydration)-유리화 (vitrification) 과정을 거치는 초저온처리법은 경정조직이 냉동 될 때 덜 분화되고 핵-세포질 비율이 높으며 유리수가 적은 세포만이 생존이 가능하다고 알려져 있다(Feng et al., 2012;Wang et al., 2009;Wang & Valkonen, 2009). 그러므로 냉 동 보존 후 정단분열조직의 최상위 부분에 있는 세포들 및 어 린 엽원기는 생존하지만 정단분열조직의 아래 부분과 오래된 엽원기의 세포는 사멸된다. 따라서 초저온처리법을 통해 바이 러스가 감염된 부분은 죽고 바이러스가 없는 부분은 식물체로 생존하게 된다(Smith et al., 2017). 경정조직의 초저온처리법 은 다른 전통적인 방법인 경정배양이나 열처리법보다 효율적인 것으로 확인되었다(Wang et al., 2009;Wang & Valkonen, 2009). 그러나 ASGV는 초저온처리법만으로는 제거하기 어려 웠고, 열처리한 후 경정조직의 초저온처리법을 병행하였을 때 2-4주간의 열처리 기간에 따라 20-100%가 제거되었다(Zhao et al., 2018). 또한 ASGV에 감염된 ‘후지’ 등 4품종을 대상으로 4주 동안 열처리(36°C, 주간/32°C, 야간)한 후 1.5 mm 크기의 경정조직을 초저온 처리하였을 때 신초 재생률은 33-76%였고 ASGV의 제거율은 30-100%였다. 그러나 열처리 후 경정배양 만 하였을 때는 초저온처리법에 비해 신초 재생률은 63-90% 로 높았지만 ASGV의 제거율은 7-38%로 낮았다. 이러한 결 과들을 비교했을 때 바이러스 제거 시에는 단독처리보다 열처 리를 기반으로 다양한 방법들을 병행하는 것이 더 효과적임을 알 수 있었다. 초저온처리법과 병행한 방법으로 바이러스를 제 거한 연구 사례들을 Table 3에 정리하였다.

    4. 효과적인 바이러스 제거를 위한 중요 요인

    가. 바이러스 종류

    식물체 내에서 바이러스 종류에 따라 바이러스가 분포하는 범위는 다르다. ASGV와 Grapevine rupestris stem pittingassociated virus (GRSPaV), RBDV 등은 전통적인 방법인 열처리나 경정배양으로 제거하기 매우 어려운 바이러스로 알 려져 있다(Gribaudo et al., 2006;Hu et al., 2019;Maliogka et al., 2009;Wang et al., 2008). 또한 ASGV는 고온에 강 해 바이러스를 제거하기 위한 처리 기간이 ACLSV 보다 더 길다(Wang et al., 2010). Wang et al.(2016)은 사과 ‘Gala’ 의 신초 크기별(0.3-0.4 mm)로 2-4주 동안 경정배양 후 바이 러스 진단 결과, ASPV의 제거율은 20-100%였으나 ASGV는 신초 크기에 상관없이 제거율이 0%였다고 보고하였다. Li et al.(2016)도 유사한 결과를 얻어 ASPV와 ASGV가 감염된 사 과 왜성대목 M.9과 M.26을 대상으로 경정배양 단독처리와 경 정배양과 초저온처리법을 복합처리한 결과 ASGV는 처리방법 과 경정조직의 크기와 상관없이 제거할 수 없었다. 그러나 ASPV는 엽원기 2-3매를 포함한 0.5 mm 크기를 이용한 경정 배양에서는 10-100%의 제거율을 나타냈다. 또한 경정배양과 초저온처리법을 복합처리에서는 경정조직을 1.0-1.5 mm로 크 게 배양해도 ASPV의 제거율은 모두 80%로 높게 나타났다. 이는 바이러스 immunolocalization 연구에서 도출된 결과와 같 이 ASPV는 생장점의 윗부분과 1-2번 엽원기에 존재하지 않 았지만, ASGV는 생장점의 몇 개의 최상층 세포를 제외하고 생장점과 1-6번 엽원기에 존재하기 때문에 바이러스 제거 효 율이 다른 것으로 판단되었다. 또한 생장점 세포까지 침입하 는 GRSPaV는 생장점 배양 또는 기내·기외 열처리로 제거하 기 어렵다(Gribaudo et al., 2006). Maliogka et al.(2009)은 GLRaV-Pr과 GRSPaV에 감염된 포도 ‘Mantilaria’의 기내 식 물체를 6주간 열처리한 후 0.1-0.2 mm 크기로 생장점 배양한 결과, 5%의 재생률을 나타내었고, 재생된 식물체 모두 GLRaV-Pr는 제거되었지만 GRSPaV는 모두 제거되지 않았다. 0.5 cm 크기의 경정배양에서도 GLRaV-Pr와 GRSPaV의 제거 율은 각각 92.4%, 39.6%로 GRSPaV 보다 GLRaV-Pr의 제 거가 더 용이하였다. 꽃가루로 전염되는 RBDV도 정단분열조 직의 가장 분화된 세포를 제외한 엽원기와 생장점 조직에 효 과적으로 침입하여 경정배양만으로 제거하기 어렵다(Wang et al., 2008). RBDV에 감염된 나무딸기(raspberry) 식물체를 대 상으로 하여 열처리 후 경정조직의 초저온처리법을 통해 33- 35%의 제거 효율을 확인하였다. 이와 같이 여러 연구를 통해 제거하기 어려운 바이러스는 초저온처리법이 효과적임을 알 수 있었다.

    나. 열처리 온도 및 지속기간

    높은 온도는 식물에 스트레스를 유발하며 스트레스 지속 기 간이 길수록 바이러스 제거가 용이하다(Wahid et al., 2007). 그러나 높은 온도와 열처리 기간은 경정조직의 생존율과 재생 률을 감소시키는 문제가 있다(Hu et al., 2015;Wang et al., 2008;Zhao et al., 2018). Lizárraga et al.(2017)은 ACLSV 와 ApMV가 감염된 사과와 배를 25-40°C까지 매일 1°C 올 려 18일 동안 열처리를 한 후 경정배양을 하여 생존율과 바이 러스 제거율을 조사하였다. 신초 생존율은 품종별로 46-100% 였고, ApMV와 ACLSV의 제거율은 각각 100%와 57-100% 였다. 배 ‘Fengshui’에서 주간에는 42°C, 야간에는 34°C로 55 일 동안 열처리 후 경정배양하여 ASGV, ACLSV, ASPV를 진단한 결과, 20-57%의 생존율과 100%의 제거율을 확인하였 다(Tan et al., 2010). 또한 열처리 기간이 10일에서 50일로 증가함에 따라 ACLSV 및 ASPV의 바이러스 제거 효율이 높 았다. 복숭아와 같은 온대작물은 급격한 온도 상승에 민감하 며 단계적으로 증가하는 온도를 처리하는 열처리법이 사용되 어야 한다(Verma et al., 2005). Manganaris et al.(2003)은 PPV와 PNRSV에 감염된 복숭아‘Arm King’의 포트 식물체를 28°C부터 35°C까지 1일 1°C씩 올려 1주일 동안 처리하였다. 그리고 35°C에서 새로운 잎이 날 때까지 2주 동안 열처리한 후 경정배양을 한 결과 재생률은 37.8%, PPV와 PNRSV 제 거율은 각각 82.4%와 81.4%였다. 높은 온도에 대한 스트레스 를 완화하기 위해 주간/야간 온도를 교대로 사용하는 열처리 방법이 이용되었다. 이 방법은 열처리 동안 경정조직에 대한 높은 온도의 부정적인 영향을 완화시키고 열처리된 경정조직 생존 및 성장을 증가시켜 바이러스 제거 효율을 향상시키는 것으로 보고되었다. 예를 들어, Knapp et al.(1995)에 따르면, 신초 생존율은 38°C의 일정한 온도보다 38°C/36°C(주간/야간) 의 변온처리로 30일 동안 열처리된 사과의 경정조직에서 훨씬 더 높은 것으로 확인되었다. Skiada et al.(2009)은 GLRaV-1 과 GRSPaV가 감염된 포도 ‘Agiorgitiko’ 기내 식물체를 40°C/37°C(주간/야간)에서 6주 동안 열처리한 후 경정배양을 수행하였다. 그 결과 신초 생존율은 53%였고, GLRaV-1과 GRSPaV의 제거율은 각각 91%, 68%였다. 따라서 과수 품종 및 바이러스 종류에 따라 열처리 온도 및 지속 기간의 조건 확립이 바이러스 제거를 더 효과적으로 제거할 수 있는 중요 한 요인으로 작용하는 것으로 판단된다.

    다. 경정조직의 크기

    과수 바이러스는 감염된 경정조직에서 주로 엽원기와 정단 분열조직 아래로 갈수록 바이러스 분포도가 올라가고 위로 갈 수록 감염이 되어 있지 않다(White, 1934). 식물체의 재생률은 배양한 경정의 크기에 비례하나, 바이러스 제거는 그에 반비 례하여 경정의 크기가 클수록 제거 효율은 낮아진다(Faccioli & Marani, 1998). ASPV와 ASGV가 감염된 사과 M.9과 M.26 식물체에서 엽원기를 2개 포함한 0.2 mm 크기로 경정배 양 하였을 때 신초가 재생되지 않았고, 엽원기 4개를 포함한 1.0 mm로 경정조직을 크게 하였을 때는 신초의 재생률은 90% 이상으로 높아졌으나 바이러스가 제거된 식물체를 얻을 수 없 었다(Li et al., 2016). Zhao et al.(2018)은 사과 ‘Gala’ 식물 체를 열처리와 초저온처리법을 병행하여 경정조직 크기(엽원 기 2-3매 또는 4-5매를 포한한 1.5 mm, 엽원기 5-6매를 포함 한 2 mm)에 따른 신초 재생률과 ASGV 제거율을 조사하였다. 그 결과 재생률은 11.1-49.5%로 크기가 작을수록 낮았으나, ASGV 제거율은 엽원기 2-3매 또는 4-5매를 포한한 1.5 mm 크기의 경정조직에서는 100%, 엽원기 5-6매를 포함한 2 mm 크기의 경정조직에는 73%로 경정조직의 크기가 작을수록 바 이러스 제거율은 높았다. 또한 포도 ‘Napoleon’에서 열처리한 후 경정조직 크기를 0.5-3.0 mm로 배양한 결과 GLRaV-3과 GFLV가 72-100% 제거되었으며 재생률은 53-80%였다(Valero et al., 2003). 이와 같이 경정배양은 매우 작은 경정조직을 사 용했을 때 바이러스 제거 효과가 높지만 재생률은 낮아지므로 과종 및 바이러스 종류에 따라 효과적인 경정조직 크기의 조 건 확립이 필요하다(Li et al., 2016;Wang et al., 2016).

    라. 항바이러스제 농도

    항바이러스제 사용은 기내배양 시 신초의 생존율, 재생률 및 바이러스 제거율에 따라 항바이러스제 종류와 농도를 결정할 수 있으며, 적절한 지속 기간과 과수 품종 및 바이러스 종류 에 맞추어 최적화 되어야 한다(Paunovic et al., 2007). 항바 이러스제는 고농도에서 식물체에 식물독성(phytotoxicity)과 같 은 약해를 줄 수 있을 뿐만 아니라 엽록소 분해, 선단 괴사 및 재생이 저해되는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 증상 은 배양 후 15일부터 그 영향이 없어지는 것으로 보고되었다 (El-Dougdoug et al., 2010). Cho et al.(2016)의 연구에서 ASGV에 감염된 배 ‘만수’의 기내 식물체에 ribavirin을 20mg/ L와 40mg/L으로 2주간 처리하였을 때 ASGV 제거율은 각각 80%, 100%였고, 4주와 8주간 처리에서는 모두 100%의 높은 바이러스 제거율을 확인하였다. Hu et al.(2018)은 GRSPaV에 감염된 포도 ‘거봉’에 ribavirin 15, 25 mg/L를 5, 25, 45, 65, 85일 동안 처리한 후 바이러스 검출 여부를 조사하였다. 처리 5일부터 바이러스 농도가 감소하였으며 65, 85일 처리에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 그러나 농도가 높을수록 처리기 간이 길수록 바이러스 제거율은 좋았지만, ribavirin 처리 25일 부터 식물체가 고사하거나 식물독성 증상이 나타났다. 이와 같 이 항바이러스제 처리 시 고농도 및 오랜 기간 처리할 경우 바이러스 제거율은 높지만 신초 생존율이 낮아지고 식물독성 이 나타나므로 적절한 농도와 지속기간이 중요한 조건으로 작 용함을 알 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 과수 바이러스 제거 에 대한 화학적 처리법의 기작 및 조건들은 아직까지 완전히 확립되지 않았으므로 다양한 조건의 추가 연구가 필요하다.

    결 론

    과수작물은 전반적으로 수체 내에 바이러스 농도가 비교적 낮고 불균일하게 분포하며 잠복 감염되어 있는 경우가 대부분 이므로 바이러스의 피해를 크게 인식하지 못하고 있는 실정이 다. 본 논문에서 경제적으로 중요한 과수작물을 중심으로 바 이러스 및 바이로이드를 제거하기 위해 다양한 열처리 기술을 바탕으로 한 방법들을 정리하였다. 그러나 ASGV와 같이 경 정조직의 생장점에도 존재한다고 알려져 있는 바이러스를 제 거하기 위한 간단하고 효율적인 방법들의 연구가 더 필요하다. 특히 ASGV와 같이 제거율이 낮은 바이러스는 경정조직 열처 리 및 초저온처리법을 통해 효과적으로 제거할 수 있었다. 국 제적으로 초저온처리법은 다른 무병화 기술과 비교하여 최근 연구되었지만 바이러스 제거를 위해 다양한 과수에 적용하기 어려운 기술이기 때문에 이용 빈도도 낮다. 따라서 바이러스 제거를 위한 간단하고 효율적인 방법의 지속적인 개발과 휴면 아 경정배양법과 한냉처리와 병행한 항바이러스제 처리 기술 과 같은 새로운 방법들의 개발이 지속적으로 필요하다.

    적 요

    바이러스병은 과실 수량과 품질 저하로 인해 경제적 손실이 발생하고, 과수나무가 바이러스에 한번 감염되면 치료할 수 없 다. 바이러스 피해는 바이러스와 기주간의 특이성, 품종의 감 수성 및 바이러스의 병원성에 따라 다르다. 따라서 바이러스 피해를 예방하기 위한 근본적인 방법은 바이러스 무병주를 재 식하는 것이다. 과수나무에서 바이러스를 제거하는 방법은 경정 배양과 병행한 열처리법, 한냉처리법, 화학적 처리법 및 초저온 처리법으로 다양하다. 본 리뷰에서는 과수 바이러스병과 바이 러스 제거를 위해 현재까지 연구된 방법들을 기술하였다. 최 근에는 바이러스 동정과 진단에 차세대염기서열 분석 기술을 적용함에 따라 다수의 과수작물에서 새로운 바이러스가 보고 되고 있다. 따라서 금후에는 현재의 기술들을 적용하여 새로 운 바이러스 및 과종에 최적화된 바이러스 제거 방법을 확립 하기 위한 연구가 필요하다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    본 연구는 농촌진흥청 연구과제(과제번호: PJ01448101)의 지 원에 의해 이루어진 것임.

    Figure

    KSIA-32-4-327_F1.gif

    Visual symptoms of Apple chlorotic leafspot virus. A, An apple leaf chlorotic leafspot; B, Abnormally small apple (cv. Hongro) fruit; C, Peach leaf mosaics.

    KSIA-32-4-327_F2.gif

    Apple scar skin viroid symptoms (scar, spots, and dapple skin).

    KSIA-32-4-327_F3.gif

    Visual symptoms of Grapevine leafroll-associated virus-3. A, A red grapevine cultivar; B, A white grapevine cultivar.

    Table

    In vivo or in vitro thermotherapy followed by shoot tip culture for virus eradication.

    Chemotherapy followed by thermotherapy for virus eradication.

    Thermotherapy followed by shoot tip cryotherapy for virus eradication.

    Reference

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