서 론

유채(Brassica napus L.)는 십자화과(Brassicaceae)에 속하는 두해살이풀로 BC 2300여 년 전부터 재배된 유지작물이다(Kim et al., 2015). 국내 유채는 주로 지역 축제와 연계한 경관용 작물로 활용되어 많이 재배되고 있을 뿐만 아니라 기름, 겨울 철 나물과 같은 식용으로의 소비가 증가하고 있어 농지면적이 점차 확대되고 있는 실정이다(Lee et al., 2017). 또한 건강에 대한 소비자의 관심이 지속적으로 늘어나면서 고급 식용유인 유채유(油)에 대한 수요가 크게 증가하여 안정적인 종실 수량 및 품질 확보가 중요한 요인이 되었다.

유채 균핵병(Sclerotinia stem rot)은 토양 및 공기 전염을 하는 병원균(Sclerotinia sclerotiorum)으로 인해 발생하는 가장 대표적인 질병 중 하나이다(Kwon and Choi, 2015). 매년 유 채 재배 포장에서 균핵병 발생은 평균 5~30% 정도이며, 심할 경우 유채유의 품질 저하 및 최대 80%의 수량 손실을 야기한 다(Wang et al., 2014). 병 감염 시기는 봄철 개화기 꽃이 피 고 꽃잎이 질 때 균주의 자낭포자의 발아가 시작되면서 처음 발생한다(Zhou et al., 2014). 한편 균핵병이 발생한 포장에서 의 연작은 병원균의 토양 내 밀도 및 균핵 형성 증가로 인해 병 방제에 어려움이 있다(Lee et al., 2011a).

최근 동계작물인 유채의 봄 파종이 가능하게 되면서 벼나 콩과 작기를 형성한 이모작 재배 농가가 증가하고 있다. 하지 만 벼와 콩의 주요 병해인 키다리병 및 탄저병 방제에 사용되 는 약제는 균핵병 방제 약제의 유효성분과 같아 저항성 균주 의 출현이 우려되는 상황이다(Lee et al., 2011b). 특히, 동일 한 약제의 지속적인 사용은 약제에 대한 병원균의 저항성을 증가시켜 최종적으로 약효의 감소를 초래하기 때문에 주의가 필요하다(Kim, 2000).

현재, 국내 유채 재배 시 사용가능한 균핵병 방제 약제로는 Boscalid, Carbendazim-diethofencarb, Fludioxonil 등 3가지 약 제가 등록되어 있다. 각각의 살균제의 경우 FRAC(Fungicide Resistance Action Committee)에서 분류한 작용 기작에 따라 서로 다른 특성이 있다. 먼저, Boscalid 약제는 미토콘드리아 의 전자전달계 숙신산 탈수소효소 복합체 II의 유비퀴논 부위 (Q-site)에 결합하여 곰팡이의 호흡을 억제하는 작용으로 전통 적인 살균제의 작용과는 다르다(Wang et al., 2015). Carbendazim-diethofencarb 약제는 carbamate계 화합물의 혼합 살균제로 침투이행성 및 잔류성이 우수하여 균사의 침입 및 진 전을 억제하는 효과가 있다(Lee and Boo, 2018). Fludioxonil 은 phenylpyrrole계 약제로 병원성 곰팡이의 신호전달 체계를 방해하여 병원균의 생장을 억제한다(Antonio et al., 2003). 최 근 유채 재배가 증가하는 가운데 균핵병은 중요한 곰팡이성 병으로 부상하고 있다. 그러나 현재 등록되어 사용되는 살균 제가 3종 밖에 없는 관계로 포장에서 동일한 살균제의 연속적 인 사용이 우려되는 상황이다.

따라서, 본 연구에서는 국내 6개 지역에서 균핵병 균주를 수집하여 분리·동정하였고, 지역별 균주를 대상으로 3종의 등 록 약제에 대하여 저항성 여부 검정 및 살균제 저항성 균주의 유전적 변이 유무를 조사하였다.

재료 및 방법

병원균의 분리 및 배양

유채는 벼와 콩과작물 이모작 재배를 하는 6개 지역(무안, 나주, 영암, 부산, 제주, 당진)에서 균핵병에 감염된 식물체를 수집하여 병원균을 분리하였다. 대상 병원균 이외에 다른 부 생균을 제거하기 위하여 병징을 나타내는 부위 절편을 분리하 여 70% Ethanol, 1% Sodium hypochloride에 표면 살균 후 멸균수로 3회 세척하여 사용하였다. 분리한 균주의 배양을 위 해 물한천(WA) 배지에 올려놓고 약 48시간 동안 25°C에서 배 양한 후, 병든 조직으로부터 자라나온 균사를 떼어내어 다시 Potato dextrose agar(PDA, BD Co., Sparks, MD) 배지에 치 상하였다. 병원균은 25°C의 암 조건에서 약 72시간 동안 배양 한 후 균총의 선단에서 균사를 떼어내어 실험에 사용하였다.

분리한 균사 절편을 다시 PDA배지에 접종하여 동일한 조 건에서 4일 간 배양한 후 직경 6 mm의 균사 조각을 평균 2~3회 반복 이식하여 병원균을 순수 분리하였다. 균주의 병원 성 상실을 막기 위해 Cryotube (지름: 12 mm, 높이: 48 mm, Nunc Co. Ltd)에 20% Glycerol을 1 ml 넣고 균사 조각을 4~5개 넣어 초저온 냉동고(DFU-017, GMS)에 동결 보존하여 장기간 사용하였다.

실험약제

본 실험에는 현재 국내 유채 균핵병 방제에 등록된 3종의 살균제 Boscalid(a.i. 49.3%, WG), Carbendazim-diethofencarb (a.i. 50(25+25)%, WP), Fludioxonil(a.i. 20%, SC) 등을 사 용하였다. 실험에 사용한 3가지 약제는 FRAC에서 분류한 약 제의 작용에 따라 구분되며 Boscalid는 C2, Carbendazimdiethofencarb는 B1, B2, Fludioxonil은 E2 그룹에 속한다 (FRAC code list, 2020).

약제저항성 검정

벼 또는 콩과 유채의 이모작 재배가 가능한 6개 지역에서 수집한 Sclerotinia sclerotiorum 균주의 살균제에 대한 저항성 을 평가를 실시하였다. 실험에 사용한 3종의 살균제는 0.1, 1, 10, 100, 1000 ppm 5가지 농도로 제조하기 위해 멸균수를 이 용하여 희석하였다. 또한 약제별 유효성분 함량을 고려하여 PDA 배지에 첨가하였으며, 기존 배양된 균핵병 병원균주를 cork borer(직경 6 mm)로 균사 절편을 만들어 약제 농도별 PDA 배지에 접종하였다. 이후 25°C 암실조건 BOD 인큐베이 터(VS-1203P1, 비전)에서 약 120시간 배양 후 무처리 대조군 (0 ppm) 균사가 완전히 자란시점을 기준으로 약제처리구의 균 총 직경을 측정하였다. 살균제 효과는 살균제를 첨가하지 않 은 대조군의 균총 직경과 비교하여 균사 생장에 대한 억제율 (%)을 다음과 같은 공식으로 계산하였다.

(1)

시험 약제에 대한 병원균의 균사 생장을 50% 억제하는 농 도인 EC₅₀(Effective concentration inhibiting mycelial growth by 50%)값은 Sigmaplot 8.02(Antro, SPSS UK, Ltd) 프로그 램을 이용하여 분석하였다.

또한 약 4주 후 농도에 따른 시험 약제 배지에 형성된 검 은색 불규칙한 타원형 모양의 균핵의 수를 확인하여 지역별로 수집한 균핵병 균주에 대한 저항성 측정의 지표가 될 수 있는 지 분석하였다.

Genomic DNA 분리 및 PCR

지역별로 수집한 균주를 대상으로 약제 배지에 접종하여 25°C 암실에서 5일 간 BOD 인큐베이터(VS-1203P1, 비전)에 서 배양한 후 SolGent사(Korea)의 Genomic DNA Prep Kit For Fungi를 사용하여 제조사의 방법대로 genomic DNA를 추출하였다. 균주의 genomic DNA는 boscalid 약제 감수성 및 저항성으로 확인된 균주의 균사를 채취하여 분리하였다. 분 리 균주의 분자생물학적 동정을 위한 PCR primers는 universal primer로 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′)와 ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′) (White et al., 1990), specific primer로 SSFWD (5′- GCTGCTCTTCGGGGGCTTGTATGC-3′)와 SSREV (5′- TGACATGGACTCAATACCAAGCTG-3′) (Freeman et al., 2002)를 사용하였고, 병원균 동정을 위해 증폭시켰다. PCR 반 응은 AccuPower^® PCR PreMix(Bioneer Co., Korea)를 이용 하여 94°C 30초, 53°C 30초, 72°C 1분을 35 cycles 조건으 로 수행하였다. PCR 반응 후 증폭 산물은 1.0% agarose gel 을 이용하여 전기영동하고 Power Gel Extraction Kit (Dyne Bio Inc., Korea)를 이용하여 순수 정제하였다.

S. sclerotiorum SdhB(SS1G_04384) 유전자는 GenBank에 등록된 서열을 기반으로 해당 유전자를 증폭시킬 수 있는 PCR primer(Table 1)를 사용하여 지역별로 수집한 Boscalid 약제 감수성 및 저항성을 지닌 균핵병 균주를 대상으로 PCR 증폭을 실시하였다(Wang et al., 2015). PCR 반응은 initial preheat를 94°C 5분 실시 후, 94°C 30초, 52°C 30 초, 72°C 1분 30초를 35 cycles를 수행하고, final extension을 72°C에 서 10분 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel 에서 전기영동하였다.

약제 저항성 유전자의 염기서열 분석

본 연구에서 사용된 3가지 종류의 시험 약제 중 Boscalid 약제에 저항성이 의심되는 지역의 균핵병 균주 유전자 염기서 열 분석을 실시하였다. SdhB 유전자의 PCR 증폭 산물의 결 과는 전기영동을 통하여 확인하였고, 염기서열을 분석하기 위 해 마크로젠(Macrogen, Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의 뢰하였다. 염기서열 분석은 DNA Star(version 5.01, DNA Star Inc., Madison, USA)을 이용하였고, 유전자서열의 정렬은 DNA Star 내 MegAlign 프로그램(version 5.05)을 이용하여 Boscalid 약제 감수성 및 저항성 균주에 대한 SdhB 유전자의 염기서열을 비교 분석하였다.

통계분석

본 연구의 결과는 SPSS version 20 software (IBM, Chicago, IL, USA)를 이용하여 95% 유의수준에서 Duncan의 다중범위 검정으로 시료간의 유의성을 검정하였고, 각 데이터 는 3반복의 평균값으로 나타내었다.

결과 및 고찰

병원균의 수집 및 분리 결과

지역별로 수집한 균핵병 균주에 대한 분자생물학적 동정을 위하여 universal primer(ITS)와 specific primer(SSFWD, SSREV)를 모두 사용하였다. 이후에 PCR 증폭하여 분석한 결 과, 분리균의 ITS 영역과 specific primer를 활용한 PCR 산 물의 염기서열 모두 Sclerotinia sclerotiorum와 98% 이상의 매우 높은 상동성을 나타내어 수집한 균주가 균핵병균임을 확 인하였다.

약제 종류에 따른 유채 균핵병 균주의 균사생장 억제효과

지역별로 수집한 감염 식물체로부터 균핵병 균주를 분리, 배 양하여 약제 종류 및 농도에 따른 저항성 검정을 실시하였다. 현재 국내 등록되어 사용가능한 유채 균핵병 살균제인 Boscalid, Carbendazim-diethofencarb, Fludioxonil 약제를 대 상으로 균사 생장에 대한 억제율로 약제저항성을 검정한 결과 는 Fig. 1과 같다. 먼저 Carbendazim-diethofencarb + PDA 배지에서 균주의 균사 생장은 0.1 ppm 농도의 경우, 부산에서 수집한 균주의 균사 생장 억제율은 13.3%로 가장 낮았으며, 제주에서 수집한 균주는 41.9%로 가장 높게 나타나 지역별로 차이가 있었다(Fig. 1A). 1 ppm의 농도에서는 모든 지역에서 최소 96.1% 이상의 억제율을 보였으며, 약제배지의 농도가 높 아짐에 따라 균사 생장 억제율이 거의 100%로 나타났다(Fig. 1A). 다음으로 Fludioxonil + PDA 배지에서 균사 생장은 0.1 ppm 농도에서 최소 94.2%이상의 억제율을 보였으며, 1 ppm 이상의 농도에서는 모두 100%의 억제율로 우수한 방제 효과 를 보였다(Fig. 1B). 반면 Boscalid + PDA 배지에서 균주의 균사 생장은 앞선 두 약제에 비해 균사 생장 억제가 뚜렷하지 않았으며(Fig. 2), 90% 이상의 억제율을 보이기 시작한 약제 농도는 10 ppm이었다(Fig. 1C). 또한 1000 ppm의 높은 약제 농도에서도 균사의 생장을 100%까지 억제하지 못했고, 나주 의 경우 87.2%로 가장 낮았다(Fig. 1C).

추가적으로 시험 약제 농도별 PDA 배지에서 균핵병 균주 의 균사 생장을 50% 억제하는 농도(EC₅₀)를 분석한 결과, Fludioxonil, Carbendazim-diethofencarb, Boscalid순이었으며, 그 값은 각각 0.06, 0.16, 0.43 ppm으로 나타나 Boscalid 약 제가 다른 두가지 약제에 비해 EC₅₀의 수치가 더 높아 균핵 병 균주의 균사 생장 억제 효과가 가장 낮음을 확인할 수 있 었다. 비록 현재 보스칼리드 약제의 EC₅₀ 값이 저항성을 지표 로 사용될 만큼 높지 않지만 단일 약제의 지속적인 사용은 균 주의 저항성 증가의 영향을 미칠 것으로 예상된다.

지역별 수집 균핵병 균주별 균핵 형성 평가

Mikaberidze and McDonald(2015)는 약제저항성을 갖는 병 원균의 fitness cost(적응력 부담치)를 조사하여 저항성 여부에 대한 다양한 측정 지표를 제시하였다. 그 중에서도 균주의 균 핵 형성 능력은 약제에 대한 저항성이 높을수록 병원성이 높 다고 판단할 수 있어 효과적인 지표가 된다(Kim et al., 2019).

본 연구에서는 지역별 수집한 균주의 약제저항성 여부를 확 인하기 위해 약제배지 종류 및 농도별로 형성된 균핵의 수를 측정하였다(Fig. 3). 먼저 Carbendazim-diethofencarb 약제배지 의 경우, 약제가 첨가되지 않은 농도에서 균핵의 수가 모든 지역에서 20개 이상 생성되었다(Fig. 3A). 또한, 0.1 ppm 농도 의 배지에서는 무처리 배지에 비해 약 50% 이상 감소된 수치 를 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 처리 농도가 점점 증가함에 따라 형성된 균핵의 수가 유의적으로 감소하는 경향을 보였으 나, 부산 지역의 경우 0.1과 1 ppm 농도의 배지에서 유의한 차이를 확인할 수 없었다(Fig. 3A). 다음으로 Fludioxonil 약 제배지의 경우, 수집한 모든 지역의 0 ppm 농도의 배지에서 균핵의 형성을 확인할 수 있었으나, 0.1 ppm 농도를 처리한 배지에서 균핵의 형성이 크게 감소되어 1 ppm 농도에서는 균 핵의 형성을 확인할 수 없었다(Fig. 3B). 반면 Boscalid 약제 배지의 경우, 무처리 배지에서 형성된 균핵의 수가 대체적으 로 많았으나, 당진에서 수집한 균주는 0.1 ppm 농도의 배지에 서 오히려 형성된 균핵의 수가 4개 이상 많았다(Fig. 3C). 또 한, 앞선 두 약제배지에서 형성된 균핵의 수와 비교해 볼 때, 1 ppm 농도를 처리한 배지에서 최대 11.3개의 균핵이 형성되어 Carbendazim-diethofencarb(5.6개)과 Fludioxonil(0개) 약제배지와 차이가 존재하였다. 특히, 무안과 부산에서 수집한 균주는 1 ppm 농도를 처리한 배지에서 가장 낮은 수의 균핵이 형성되었 다(Fig. 3C). 처리 농도에 따른 균핵 형성의 유의성은 나주와 부산을 제외한 지역에서 불규칙하게 존재하였다(Fig. 3C).

약제배지의 종류와 농도에 따른 형성된 균핵의 수를 종합적 으로 평가하였을 때, Carbendazim-diethofencarb 및 Fludioxonil 약제배지는 처리 농도가 증가함에 따라 지역별로 수집한 균주 의 균핵 형성이 유의하게 감소하는 경향을 보였다. 한편 Boscalid 약제배지는 0.1 ppm 이상의 농도에서 균핵의 수가 앞선 두 종류의 약제배지에 비해 적게 감소되었으며, 당진에 서 수집한 균주의 경우 배지 농도가 높아짐에도 불구하고 오 히려 균핵의 수가 증가하여 약제에 대한 저항성이 높은 것으 로 나타났다.

숙신산 탈수소효소 유전자(Sdh B) 염기서열 분석

Boscalid 약제는 숙신산 탈수소효소 억제제(SDHI) 계열에 속하는 살균제로, SDHI의 표적 부위는 숙신산 탈수소효소 복 합체이다. 미토콘드리아막 결합단백질 중 하나인 숙신산 탈수 소효소는 TCA 회로에서 숙신산을 푸마르산으로 생성하는 반 응을 촉매하는 효소로(Hägerhäll, 1997), 미토콘드리아 복합체 ∥의 유비퀴논 결합부위(Q-site)에 특이적으로 결합하여 곰팡 이의 호흡을 억제한다(Avenot and Michailides, 2010). SDH 복합체는 4개의 소단위체(SdhA, SdhB, SdhC, SdhD)로 구성 되어 있으며, 박테리아 및 진핵생물의 미토콘드리아에 존재한 다(Yin et al., 2011). 하지만 대부분의 경우 SDHI 살균제에 대한 내성은 SdhB 소단위체의 세번째 시스테인이 풍부한 클 러스터에 위치한 고도로 보존된 히스티딘에 돌연변이가 생겨 발생하는 것으로 보고되고 있어(Wang et al., 2015), 본 연구 에서도 boscalid 내성 관련 유전자를 SdhB로 target하여 실험 을 수행하였다.

따라서 SdhB 유전자의 표준 염기서열과 지역별로 수집한 균주의 SdhB 유전자 염기서열을 분석한 결과, 무안과 부산지 역에서 수집한 균주는 기존 감수성(표준 염기서열)과 일치하 였으나, 나주, 영암, 제주, 당진에서 수집한 균주의 경우 32번 째 염기가 C에서 T로 치환된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 점 돌연변이(point mutation)의 발생은 해당 아미노산이 GCA(Alanine)에서 GTA(Valine)으로 대체되어 균주의 내성 획 득 원인 중 하나로 추측되었다(Fig. 4). 하지만 유전자 염기서 열 분석은 감수성 및 저항성 균주 사이의 차이를 증명하는 조 사지표 중 하나이기 때문에 유전적 변이 분석이외에도 해당지 역에서 저항성 발생 원인에 대한 추가적인 조사가 필요할 것 으로 사료된다.

적 요

본 연구는 지역별로 수집한 유채 균핵병 균주에 대해 등록 된 3종의 약제를 사용하여 저항성 검정을 실시하였고, 저항성 발생 가능성이 있는 약제의 작용 기작과 관련한 유전자를 분 석하여 변이 유무를 확인하였다.