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호박은Cucurbita속에 속하는 아메리칸 대륙 원산의 1년생 덩굴성 초본으로 약 27종이 알려져 있으며, C. moschata, C. maxima, C. pepo가 Cucurbita속에서 가장 많이 재배되고 있다 (Paris, 2016).

Cucurbita속의 유전체 크기는 약 500 Mb(2n = 2x = 40)으로 C. moschata, C. maxima, C. pepo의 유전체가 해독되어 있다 (Arumuganathan and Earle, 1991;Eteras et al., 2012;Paris, 2016;Sun et al., 2017;Montero-Pau et al., 2018). 또한 호 박은 생리학적, 형태학적 및 생태학적으로 다양하기 때문에 유 전자원 확보 및 분류가 중요하다(Loy, 2004). 과거에는 형태적, 생화학적 특성을 기반으로 다양성을 평가하였으며 환경의 영 향을 크게 받아, 유전적으로 가까운 근연종 간에 적용이 어려 워 다양성 평가가 제한적이었다(Chen and Nelson, 2004;Jung et al., 2015). 최근 소비자의 요구와 기후 변화로 인해 새로운 품종 개발을 위한 유전자원의 특성 평가가 요구되고 있 다(Kang et al., 2021).

최근 분자 유전학의 발전으로 식물 종의 다양성을 유전체 수 준에서 구별할 수 있게 되었으며, Kompetitive allele speciic PCR(KASP) assay와 같은 기법을 사용하여 특정 영역의 SNP 를 확인하는 대규모 대용량 분석 및 효율적인 유전적 다양성 분석이 가능해졌다(Graves et al., 2016).

본 연구는 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보존하고 있는 호박 유전자원의 생육 특성을 조사하였으며, 종자산업진흥센터 에서 제공하는 KASP 마커를 이용하여 C. moschata, C. maxima, C. pepo와 같이 주로 재배되는 호박 재배종을 계통학 적으로 분류하고 KASP 마커의 정확성을 평가하였다.

재료 및 방법

실험재료

농업유전자원센터에서 보유중인 30개 국가에서 수집된 199 점의 호박 유전자원을 본 연구에 활용하였다(Table 1).

생육 특성 조사

본 연구에서 사용한 호박 유전자원 199점의 특성 조사는 농 업유전자원센터에서 제시한 기준에 따라서 수행되었다. 조사 항목은 총 14개로서 초장(plant height; PH), 절간장(internode length; IL), 회반(silver leaf; SL), 결각(lobed leaflet; LL), 과중(fruit weight; FWE), 과장(fruit length; FL), 과폭(fruit width; FW), 화흔부(blossom end; BE), 과피색(fruit skin color; FSC), 과육 두께(content width; CW), 과형(fruit shape; FS), 흰가루병 저항성(resistance to powdery mildew; RPM), ZYMV 저항성(resistance to Zucchini Yellow Mosaic Virus; RZ), 저장성(fruit shelf life; FSL)이다. 그리고 특성이 분리하는 경우에는 농업유전자원센터의 유전자원 기초 특성 조사 기준에 따라 우점 개체의 생육 특성을 기록하였다.

Genomic DNA 추출

정식한 호박 유전자원의 잎을 채취한 뒤, Cetyl trimethylammonium bromide(CTAB) 방법(Doyle and Dyole, 1987)을 이용하여 genomic DNA(gDNA)를 분리하였다. 분리 된 gDNA는 1% agarose gel에 전기영동하여 순도를 확인한 후, 5 ng/μL로 희석하여 실험에 사용하였다.

KASP 마커 적용 및 분석

호박 유전자원 gDNA는 종자산업진흥센터에서 기술이전 받 은 KASP 마커 C. moschata용 35개, C. maxima용 36개, C. pepo용 22개를 임의 선발하여 적용하였다.

각 마커의 Polymorphism Information Content(PIC) value에 대한 분석을 위해 PolyPICker(https://www.genecalculators.net/pqchwe- polypicker.html)을 이용하였고, 각 마커에 대한 P IC v al ue 는 다음 공식을 이용하여 계산하였다(Botstein et al., 1980).

통계분석

호박 유전자원 199점의 형질을 이용한 주성분 분석 (Principal Component Analysis, PCA) 및 유의차 검정은 R 소프트웨어(http:www.r-project.org)에서 제공하는 prcomp 명령 어와 SPSS ver. 22를 이용하였으며, 각 자원에서 형질의 분리 가 일어난 경우에는 형질 값들의 평균으로 대체 분석하였다.

결과 및 고찰

호박 유전자원의 생육 특성 조사 및 주성분 분석

본 연구에서 호박 유전자원 199점의 14개 형질에 대한 생 육 특성을 조사한 결과는 Tables 2, 3, Figs. 1, 2, 3과 같다. C. moschata에서, 초장(PH)은 4~9까지 분포하였으며, 7인 자 원이 30점(46.2%)으로 가장 높은 비율을 나타냈다. 회반(SL) 은 0~8에 걸쳐 있고, 대부분 1~3의 값을 가졌다. 결각(LL)의 경우, 대부분 3 이하에 분포하였고, 2에서 37점(56.9%)으로 가장 높은 비율을 나타냈다. 과실의 무게는 496 g부터 4,948 g 까지 다양했으며, 과실의 길이 또한 2.7 cm에서 47.1 cm까지 자원 간 차이가 컸다. 과피 색(FSC)은 살색이 19점(29.2%) 으로 가장 많았고 과형(FS)에서는 가로 타원형, 세로 타원형, 원형이 대부분을 차지했으며, 저장성(FSL)은 6인 자원이 13 점(20%)으로 가장 많았다. 흰가루병 저항성(RPM)에 대해서 10점은 중도 저항성을, 55점은 감수성을 나타낸 반면, ZYMV 저항성(RZ)에 대해서는 6점이 저항성을, 18점이 중 도저항성을, 34점이 감수성을 나타냈다. C. maxima에서, 초 장은 6에서 9점으로 가장 높은 비율(28.1%)을 나타냈고, 1 점을 제외한 31점에서 회반이 나타나지 않았다. 결각이 약한 자원이 대부분이었으며, 과중(506 g~5,389 g)과 과장(6.7 cm~ 22.5 cm)에서 다양성이 크게 나타났다. 과피 색은 연두색이 13점(40.6%)으로, 과형은 가로 타원형이 17점(53.1%)로 가장 많았다. 저장성은 1~8까지 다양하게 분포하였고, 5에서 7점 (21.9%)으로 가장 높은 비율을 나타냈다. 흰가루병 저항성에 대해 중도감수성 5점, 감수성 27점으로 나타났으며, ZYMV 저항성에 대해 저항성 2점, 중도감수성 1점, 감수성 26점으로 나타났다. C. pepo에서는 초장이 1~9까지 모두 분포했지만 1에서 16점(23.5%)으로 가장 많았고, 회반이 나타나지 않은 자원이 41점(60.3%)으로 가장 많았다. 결각은 2~7의 중간 정도로 골고루 분포하였고, 과중이 112 g~3,294 g, 과장이 4.0 cm~40.2 cm로 자원 간의 차이가 크게 나타났다. 과피 색 은 노란색(25점, 36.8%), 과형은 세로 타원형(28점, 41.2%) 의 비율이 가장 높았다. 대체로 저장성은 긴 것으로 나타났 으며, 10인 자원이 13점(19.1%)으로 가장 많았다. 흰가루병 저항성의 경우 9점이 중도저항성을, 59점이 감수성을 나타냈 으며, ZYMV 저항성에 대해서는 6점이 저항성을, 4점이 중 도저항성을, 57점이 감수성을 나타냈다.

호박 유전자원 199점의 14개 형질에 대한 주성분 분석을 수행한 결과를 Fig. 4와 Tabl e 4에 나타내었다. 본 연구에 사 용된 199점의 호박 유전자원은 30개 국가에서 수집한 자원으 로, C. moschata와 C. maxima, C. pepo 모두 아시아 지역 에서 수집된 자원이 약 59%로 월등히 많았다. 이는 아시아 원산 자원들의 수집, 도입, 분양이 활발했기 때문으로 보이며, 아프리카 대륙은 유전자원 관리 기관을 운영하는 국가가 매우 적기 때문에 아프리카 대륙 원산 자원이 없었을 것이라고 판 단된다(Lee et al., 2020).

3.7로 설정된 중심원을 벗어나는 유전자원은 총 14자원 (K145179, K180784, 180881, K180889, K180918, K100314, K146924, K146831, K021087, K151620, K261135, K275109, K156650, K162041)이었으며, 대부분의 유전자원이 중심원에 포함되어 있어 생육 특성에 따른 균형 있는 분포를 확인할 수 있었다. 또한 주성분 분석을 통한 제 1주성분(PC1)의 고유값 (eigenvalue)은 1.624로 전체 분산에 대하여 15.5%의 기여도가 있는 것으로 분석되었으며, 제 2주성분(PC2), 제 3주성분(PC3) 의 고유값은 각각 1.379, 1.217로 전체 분산에 대하여 각각 11.19%, 8.7%의 기여도를 나타내고 있다. 전체 분산에 대하여 35.4%의 기여도를 나타낸 PC1부터 PC3까지의 특성 간 상관 관계를 분석한 결과, PC1은 -0.331(과실의 골)부터 0.511(절간 장)까지 상관계수가 분포하였으며, 과실의 골과 흰가루병 저항 성사이에는 -0.3 이하의 높은 음의 상관관계를 나타냈다. PC2 는 -0.430(과중)부터 0.164(초장)까지 상관계수가 분포하였으며, 과중, 과육 두께와 흰가루병 저항성사이에서 -0.3 이하로 비교 적 편중되어 있었다(Table 4).

KASP 마커를 활용한 다양성 분석

C. moschata 92점은 5그룹, C. maxima 34점은 5그룹, C. pepo 73점은 4그룹으로 분류되어 다양성을 보이는 것을 확인 했다 (Fig. 5).

각 마커들의 P IC v al ue를 확인해봤을 때, C. moschata는 0.50(Table 5), C. maxima는 평균 0.43(Table 6), C. pepo는 평균 0.45(Table 7)의 값을 보였다. 따라서 C. moschata의 자 원들에서 유전적 다양성을 가장 정확히 판단할 수 있었다. 이 는 C. moschata의 검정 자원 수가 다른 자원들보다 많아 정 확도가 높아진 것으로 판단된다.

특성 조사를 통한 자원 분류 결과와 KASP 마커 분석을 통 한 자원 분류 결과를 비교했을 때, 분류되는 그룹들에 대한 일치도가 낮았다. 이는 현재 개발되어 있는 KASP 마커 세트 가 자원을 구분하여 유전적 다양성을 평가하는 데에는 효과적 이지만 형질과의 연관성이 낮은 마커이기 때문이라고 판단된 다. 형질과 연관된 추가적인 KASP 마커 세트가 개발된다면, 자원 구분뿐만 아니라 자원들의 형질 예측에도 도움이 될 것 이라고 생각된다.

호박은 유전적으로 가까운 근연종 간 다양성 평가가 어려운 작물 중 하나이다. 다양한 특성을 지닌 호박 유전자원의 유전 적 다양성을 평가하고 분류하는 작업은 상당한 시간과 많은 노동력이 소요된다. 그러나, 본 연구 결과를 활용하면, 적합한 육종 소재를 발굴하고 신속히 도입할 수 있어 비용과 노동력 을 절감할 수 있을 것이라고 기대된다.

적 요

세계적으로 널리 재배되는 호박 중, 199점의 C. moschata, C. maxima와 C. pepo 호박 유전자원을 대상으로 14가지의 생육 특성을 파악하고 PCA 분석을 수행하였다.

199점의 호박 유전자원에 대해 각 염색체당 1개 이상의 마 커를 임의로 선발하여 자원 분류를 진행하였다. 그 결과, C. moschata 92점은 5그룹, C. maxima 34점은 5그룹, C. pepo 73점은 4그룹으로 분류되는 경향을 보였으며, 이를 통해 유전 자원의 근연 관계를 파악하고 종자산업진흥센터에서 제공받은 KASP 마커를 활용하여 유전적 다양성을 확인할 수 있었다.