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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agriculture Vol.35 No.4 pp.278-286
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2023.35.4.278

Environmental Risk Assessment of Herbicide Resistant Transgenic Rapeseed (Brassica napus L.) : Responses to Cyprinus carpio fed on herbicide resistant transgenic rapeseed

Sung-Dug Oh*, Kyunglyung Baek*, Seok-Ki Min**, Joon Ki Hong*, Doh-Won Yun*, Seong-Kon Lee*, Ancheol Chang*†
*Department of Agricultural Biotechnology, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Jeonju 54874, Korea
**Korea Testing & Research Institute, Hwasun 58141, Korea

‡These authors equally contributed to this study as first author.


† Corresponding author (Phone) +82-63-238-4711 (E-mail) abychan@korea.kr
October 25, 2023 November 9, 2023 November 10, 2023

Abstract


Herbicide-resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed) was developed by inserting phosphinothricin acetyltransferase (PAT, bar), a modified gene from the soil bacterium Streptomyces hygroscopicus, into the genome of a conventional variety of rapeseed (Youngsan). The TG rapeseed used for the test was confirmed to express the PAT gene by polymerase chain reaction (PCR) and immunostrip. Feeding tests were conducted with Cyprinus carpio to evaluate the environmental risk of TG rapeseed, including the herbicide resistant gene. C. carpio was fed 100% ground rape suspension, TG rapeseed, or non-genetically modified (GM) counterpart rapeseed (Youngsan). As a result, the feeding test showed no significant differences in the cumulative immobility or abnormal response between C. carpio samples fed on TG rapeseed and non-GM counterpart rapeseed. The 48 h-LC50 values of the TG rapeseed and the non-GM counterpart rapeseed were 3,376 mg/L (95 % confidence limits: 3,169 - 3,596 mg/L) and 2,682 mg/L (95 % confidence limits: 2,267 – 3,123 mg/L), respectively. The rape NOEC (no observed effect concentration) value for C. carpio was suggested to be 625 mg/L. Based on these results, there was no significant difference in the toxicity for non-target organisms (C. carpio) between the TG rapeseed and non- GM counterparts.


Cyprinus carpio , Herbicide resistant transgenic rapeseed , Environmental risk assessment

제초제저항성 형질전환 유채의 환경 영향 평가: 제초제저항성 형질전환 유채의 급이가 잉어(Cyprinus carpio)에 미치는 영향

오성덕*, 백경령*, 민석기**, 홍준기*, 윤도원*, 이성곤*, 장안철*†
*농촌진흥청 국립농업과학원 생명자원부
**한국화학융합시험연구원

초록

    서 언

    국내에서 유채(Brassica napus L.)는 전국적으로 재배가 가 능한 식물이지만 주로 남부지역과 제주도에서 많이 재배되고 있다(Kim et al. 2005; Mun et al. 2010). 유채는 십자화과 근연종과 교잡이 가능한 것으로 알려져있다(Sohn et al. 2022). 유채의 원산지는 스칸디나비아반도, 시베리아, 코카서스지방이 며 유채의 국내 도입 시기는 중국 명나라 때로 추정하고 있다. 국내에서 유채는 주로 기름을 추출하여 사용하거나 가축의 청 예사료용으로 이용하기 위해 재배되고 있고, 가정에서는 봄철 겉절이로 이용하기 위해 소량으로 재배되고 있다. 또한, 유채 박은 유기질 비료, 봄철채소, 사료용, 관상용, 밀원 등으로 다 양하게 쓰이고 있다(Kim et al. 2005; Kim et al. 2018;Mun et al. 2010).

    유전자변형(genetically modified, GM) 작물의 개발과 이용 은 지속적으로 증가하고 있다. 유전자변형작물은 2019년 29개 국에서 1억 9,040만 헥타르의 면적에서 재배되었다(James. 2020). 또한, 2022년 국내에 수입 승인된 식품용, 사료용 유전 자변형생물체는 약 1,105만 톤(42.6억 달러) 규모로, 2021년 1,115만 톤(34.5억 달러) 대비 10만 톤가량 감소하였으나, 수 입금액은 42.6억 달러로 2년 연속 큰 폭으로 증가하였다 (KBCH. 2022).

    GM 작물 중 유채는 콩, 옥수수, 면화에 이어 전세계적으로 네번째로 많이 재배되는 작물이다. 1997년 처음 재배된 GM 유채는 전세계 재배 면적이 해마다 증가하여 2022년 기준으 로 1,010만 헥타르에서 재배되어 전체 GM 작물의 5%를 차 지하였고 전세계 유채 재배면적인 3,760만 헥타르의 27%를 차지하고 있다(KBCH. 2022). 유전자 변형 유채는 캐나다, 미 국, 호주, 칠레 등에서 재배되고 있다. 아직 국내에는 식용 및 사료용으로 14종의 이벤트가 수입 승인되었다(KBCH. 2022). 국내에서 개발되어 상업화된 GM 유채는 없으나, GM 유채에 대한 다양한 연구는 지속적으로 진행되고 있다. 바이오연료, 기능성 물질 증진 및 생산 등 다양한 특성을 가진 GM 유채 들을 포함한 십자화과 작물이 개발중이며, 그 중 제초제 저항 성 GM유채(Herbicide-resistant transgenic rapeseed, TG 유채) 는 배추에서 유래한 조기개화 유전자인 BrAGL20와 선발마커 로 bar 유전자를 영산유채에 도입하여 개발하였다(Hong et al. 2013;Sohn et al. 2016;Lee et al. 2019).

    국내에도 유채와 교잡 가능한 다양한 배추, 순무 등 재배종 과 갓 등 야생종 십자화과 식물이 다수 분포하고 있으며, 이 들 십자화과 작물들은 타가수분율이 높고 대부분 교잡 가능하 여 GM 유채의 도입형질이 전달될 가능성이 높을 것으로 추 정된다(Sohn et al. 2021). GM유채는 전세계적으로 비의도적 및 의도적 환경 유출로 인해 잡초화 및 유전자 이동 등으로 지속적으로 문제가 되고 있다. 국내에서도 미승인된 GM유채 의 유통과 비의도적 재배 사고가 발생하고 있으며, 따라서 미 승인된 GM유채가 유출되지 않도록 예방해야할 뿐만 아니라 GM유채의 안전성 평가와 안전 관리 연구가 수행되어야 한다 (Lee et al. 2019;Lee 2020).

    필수적으로 요구되는 GM작물의 안전성 평가는 크게 두가 지로 구분할 수 있다. 첫번째로 GMO에 도입된 유전자들에 의한 농업 환경생물종의 영향과 잡초화 가능성 및 농업환경 생태계 영향 등에 대한 환경위해성 평가를 수행하여 외부환경 에 노출 즉, 농경지에 재배되기 이전에 농업환경에 미치는 잠 재적 위해성을 알아보아야한다. 두번째로 영양 성분 분석, 알 레르기 및 독성 평가 등의 식품안전성 평가가 이루어져야 한 다(Oh et al. 2014a;Lee et al. 2015;Oh et al. 2020). GM작물의 환경위해성 평가 항목에서 일반적인 평가 대상인 나비목, 노린재목, 딱정벌레목 등의 재배지의 곤충상 조사 이 외에 물벼룩, 잉어, 미꾸리 등의 수서환경생물종에 대한 평가 도 수행되어야 한다. 수서환경 생물종 중 어류에 대한 환경 생물 독성시험을 평가하기 위한 시험생물종 선택에 있어서 실 험 방법론 및 생태학적 문제뿐만 아니라 시험생물종 공급과 분석 비용 등 현실적인 문제와 생물종 적합성(다양한 독성물 질의 독성 평가 성적 확보 유무, 위해물질에 대한 감수성, 광 범위한 서식 지역, 단기간 생활사 독성시험 가능)을 고려하여 잉어(Cyprinus carpio), 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus), 제브라피쉬(Brachydanio rerio), 무지개송어(Oncorhyunchus mykiss), 물벼룩(Daphnia magna), 지렁이(Eisenia fetida) 등이 일반적으로 이용되어져 왔다(Versteeg et al. 1997;Kim et al. 2010). 본 실험에서는 제초제 저항성 GM유채에 대한 수서 환경위해성 평가를 분석하기 위하여 잉어(C. carpio)를 시험종 으로 선정하였다

    본 연구에서는 제초제 저항성(글리포시네이트 내성) 유전자 가 영산유채에 형질전환된 제초제 저항성 GM유채가 잉어에 미치는 급성 독성 여부를 분석하기 위하여 제초제 저항성유전 자인 Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 의 도입 유무 와 PAT단백질 발현을 확인한 후, 모품종 유채인 영산유채와 함께 환경위해성 평가 항목 중 수생 생물종인 잉어에 미치는 영향을 조사분석하였다. 본 실험을 통해 얻어진 결과는 국내 개발 GM 유채의 안전성 평가와 관리를 위한 심사 자료뿐만 아니라, GM 유채의 농업환경 생물종에 대한 위해성 평가 지 침 마련을 위한 기초 자료로 활용할 계획이다.

    재료 및 방법

    실험 재료

    본 실험에 이용한 제초제 저항성 GM 유채(TG유채)는 아그 로박테리움(Agrobacterium) 형질전환법을 사용하여 모품종인 영산유채에 배추에서 유래된 조기개화 유전자 BrAGL20와 제 초제 저항성 유전자 Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 를 도입하여 개발한 것이다. 제초제 저항성 유전자의 전신 발 현을 위해 CaMV p35 프로모터를 이용하였고, 제초제저항성 유전자인 PAT는 글루포시네이트(glufosinate) 제초제(바스타)에 대한 저항성을 지니고 있다(Hong et al. 2013;Sohn et al. 2016).

    국립농업과학원 GMO (Genetically modified organisms) 격 리 포장(2018년, 전라북도 전주시, RDA-가AB-2013-041)에서 모품종인 영산(Youngsan)과 제초제 저항성 GM유채를 재배 및 육성하였으며, 잎, 줄기와 꽃을 수확하여 동결건조기(FD8518, IlsinBioBase, Yangju, Korea)를 이용하여 건조한 후, 분쇄기 (PM100, Retsch, Hann, Germany)를 이용하여 분말화하였다. 분쇄된 시료는 600 μm 표준망체(Chunggye sang gong sa, Seoul, Korea)를 이용하여 분쇄된 시료를 선별하고, 잉어의 사육 용수에 현탁하여 잉어의 급성독성 분석용 시료로 사용 하였다.

    게놈 DNA 추출 및 polymerase chain reaction (PCR) 검정

    영산과 제초제 저항성 GM유채 식물체와 종자의 시료 각 1 g씩을 막자사발을 이용하여 분말화한 후, DNeasy Plant kit (Qiagen, Valencia, USA)을 사용하여 영산유채와 제초제 저항 성 GM유채의 Genomic DNA를 추출하였다. NanoDrop ND- 1000 (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, NC, USA) 를 사용하여 추출된 Genomic DNA를 정량 측정 및 분석하였 다. 정량분석된 시료들 중에서 260/280 nm의 수치가 1.8 - 2.0 사이인 Genomic DNA 시료를 PCR(Polymerase chain reaction) 실험에 이용하였다. 제초제 저항성 GM유채에 도입 된 T-DNA의 유전정보를 기반으로 PAT (Phosphinothricin acetyltransferase, bar) 유전자 검정용 프라이머를 제작하였다 (Table 1). PCR 분석을 위하여 각 식물체의 Genomic DNA 20 ng에 프라이머 20 pM, 2X Hottaq PCR master mix 10 μL (Cellsafe, Yongin, Korea)을 첨가한 후 최종 반응 용량을 20 μL로 하였다. PCR 반응조건은 94°C 5분 후, 94°C 30초, 58°C 30초, 72°C 30초의 조건에서 30 사이클로 증폭한 후, 72°C에서 5분간 반응하였고, C1000TM Thermal cycler (Biorad, foster, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 합성된 각 검 정 유전자들의 PCR 산물은 1 % 한천겔에서 100 V로 28분 간 전기영동한 후 분석하였다.

    제초제 저항성 GM유채의 목적 단백질 발현 분석

    bar 유전자의 발현 검정을 위하여 immunostrip 검정 (lateral strip test)을 실시하였다. 영산유채와 GM유채의 시료에 추출액을 넣고 분쇄하여 단백질을 용출하고, bar 유전자의 단 백질 발현을 Trait LL Test Strip (Strategic Diagnostics Inc, Newark, USA)을 이용하여 immunostrip 검정하였다.

    잉어(C. carpio) 배양 조건

    급성독성분석용 생물종인 잉어(C. carpio)는 오창양어장 (Ochang, Korea)에서 구입한 후, 한국화학융합시험연구원 (Hwasun, Korea)에서 사육 및 배양된 것을 사용하였다. 잉어 는 20 L 용량의 장방형 유리 수조에서 수온 20 ~ 24°C, 암조 건 8시간(24:00 ~ ~ 08:00), 광조건 16시간(08:00 ~ 24:00) 조 도 300 ~ 600 Lux의 환경에서 배양하였으며, 먹이로는 탑밀 (제일사료, 한국)을 오전에 1회 1 g씩, 매일 공급하였다. 잉어 사육실의 온도와 배양수조의 수온은 자동온도측정기로 매 30 분마다 측정하였고, 시험에 영향을 있을 정도의 사육실 온도 와 배양수조의 수온 변화가 없음을 확인하였다. 잉어의 배양 에 사용된 시험 용수는 수돗물을 전처리필터 (1.0 μm)와 세균 제거 필터 (0.2 μm)로 통과시킨 후, 저수조에서 48시간 이상 폭기시킨 후 사용하였다. 시험 용수 수질은 (재)한국화학융합 시험연구원에서 환경부 고시 먹는물 수질공정시험기준에 따라 분석하였으며(TAK-2018-184933, 2019-01-08, Annex 2), 수 질 분석 결과 시험에 영향을 주는 요인은 없었다.

    잉어에 대한 시료 처리조건

    영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 시료에 대한 예비시 험 결과 100, 500, 1,000, 2,500, 5,000 mg/L의 시험농도(설 정농도)에서 각각 0, 0, 20, 40, 100%의 치사 개체가 관찰되 었다. 본 시험의 농도는 0, 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L (설정농도)로 설정하였으며, 시험 물질의 처리 농도별로 3반복으로 수행하였다. 시험 용액 처리후 3, 24, 48, 72 및 96시간 마다 시험 어종인 잉어에 미치는 영향들을 측정하였다. 시험 용액의 제조는 시험물질 0, 3.13, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 g을 정확히 측정하여 20 L의 수조에 넣고 시험용액이 10 L가 되도록 시험용수를 추가한 후 완전히 현탁될 때까지 교반 시킨 후에 시험용액으로 사용하였다. 무처리구인 음성대조구 는 시험용수인 수돗물을 사용하였으며, 양성대조군 물질로 3, 5-dichlorophenol (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)을 사용하였 다. 잉어 처리시에는 0.06, 0.08, 0.12, 0.16 및 0.23 mg/L의 설정농도(nominal concentration)로 적용하였다(Bae et al. 2018). 잉어의 노출 실험은 원통형 유리 수조(용량 20 L, 38 cm H × 28 cm φ)에 시험용액을 10 L을 처리하여 수행하였 으며, 처리군별로 10마리씩 3반복으로 처리하였다. 시험개시 24시간 전부터 시험 종료 시까지 잉어의 먹이 공급을 중단하 였고 시험 기간 동안 매 24시간 간격으로 약 1시간 동안 각 처리수조에 산소를 충분히 공급하여 주었다.

    급성 독성 분석을 위한 조사 항목

    제초제 저항성 GM유채와 영산(모품종)의 잉어에 대한 급성 독성을 확인하기 위하여 치사수 및 일반증상 관찰은 모든 시 험 수조에서 시험개시 3, 24, 48, 72 및 96시간 경과 후에 중독증상, 특이증상 및 치사 유무를 관찰하였으며, 치사의 판 정은 시험계를 유리막대로 건드렸을 때 움직임이 없거나 아가 미 호흡이 중단된 경우 치사로 간주하였다. 급성 독성 실험은 농촌진흥청 고시 제2019-5호 (2019-03-21) [별표 13]의 13-1- 1. 담수어류급성독성시험에 따라 수행되었으며, 본 시험 중 상 기 기준에 규정되지 않은 경우는 한국화학융합시험연구원(화 순)의 표준작업지침서에 따라 시험을 실시하였다. 시험 기간 중 모든 잉어 사육 수조에 대하여 수온, pH와 DO (dissolved oxygen)를 매일 1회 측정하였다. pH와 DO 및 수온은 WTW 사의 Multi 9430 (WTW, Weilheim, Germany)를 이용하여 측정하였다. 시험 종료후 잉어의 체중과 전장을 측정하였다. 반수치사농도(Lethal concentration 50, LC50)산출은 시험 결과 를 바탕으로 CETIS (Version 1.9.3.0, Tidepool Scientific Software, Mckinleyville, USA) 프로그램을 이용하여 계산하였 다. 시험물질 처리 후 48시간 및 96시간 LC50 (95% 신뢰한 계)은 Probit method와 Trimmed Spearman-Krber method를 적용하여, LC50을 산출하였다. 무영향농도(NOEC, no observed effect concentration)는 중독 증상이 없고 치사 체가 발생하지 않는 최고 시험농도로 표시하였다.

    결과 및 고찰

    제초제저항성 GM유채의 분자생물학적 분석

    잉어 급성 독성 평가에 사용된 제초제 저항성 GM유채의 시료에 대한 제초제 저항성 유전자의 도입을 검정하기 위하여 bar 유전자의 PCR 분석 결과 GM 유채에서만 455 bp 크기 의 PCR 산물이 보였으며 영산유채에서는 미검출되었다. 또한, 유채의 내재 유전자인 actin 유전자 분석에서는 영산과 제초 제 저항성 GM유채 모두에서 515bp 크기의 PCR 산물이 검 출되었다. PCR 분석 결과, 본 실험의 잉어 급성 독성 평가에 사용된 제초제 저항성 GM유채에 bar 유전자가 도입되었고, 도입된 유전자가 안정적으로 식물체에서 유지되고 있음을 확 인하였다(Fig. 1).

    제초제 저항성 GM유채에서 PAT 단백질의 발현을 확인하기 위하여 PAT 항체를 이용한 immunostrip 분석을 실시하였다. 잉어 급성독성 실험에 사용된 제초제 저항성 GM유채와 영산 유채의 시료들을 PAT immunostrip을 이용하여 PAT 단백질 발현을 분석한 결과, PAT 단백질은 제초제 저항성 GM유채에 서만 특이적으로 검출되었고, 모품종인 영산유채에서는 PAT 단백질이 검출되지 않았음을 확인하였다(Fig. 2).

    시료처리용 시험용수의 수질변화 검정

    영산유채와 제초제 저항성 GM 유채의 잉어 급성 독성 시 험 처리 기간 동안 모든 처리구의 수조에 대하여 수온, pH 및 DO 등 시험 용액의 수질 검사를 1일 1회씩 실시하였다. 영산유채와 제초제 저항성 GM 유채에 대한 잉어 급성 독성 평가 처리한 직후 시험용수 pH는 음성대조구(무처리군)에서 7.50 ± 0.01 (7.50 ~ 7.51) 수준이었다. 영산유채와 제초제 저항 성 GM유채를 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L의 농 도로 처리한 후 각 농도별 처리구의 pH를 측정한 결과, 영산 유채 처리구의 pH는 6.64 ± 0.01 ~ 7.14 ± 0.01로 측정되었으며, 제초제 저항성 GM유채에서는 6.73 ± 0.02 ~ 7.50 ± 0.01로 측정 되었다. 두 유채 품종의 시료 처리 농도가 높아짐에 따라 pH 도 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 잉어 급성 독성 평가 처 리 직후의 DO는 음성대조구에서 8.24 ± 0.01 (8.22 ~ 8.26)이 였으며 영산 시료는 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L 의 농도로 처리한 후의 용존산소량은 8.18 ± 0.01 ~ 8.23 ± 0.02 로 측정되었다. 또한 제초제 저항성 GM유채의 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L 처리구에서는 8.16 ± 0.02 ~ 8.23 ± 0.02 측정되었으며 2,500 mg/L 처리구의 24시간에서 영 산유채와 제초제 저항성 GM유채간의 p값이 0.04으로 분석되 었으나, 2,500 mg/L 처리구의 24시간을 제외하고 영산과 제초 제 저항성 GM 유채 간의 통계적인 유의적 차이는 없었다 (Table 3). 이와 같이 음성대조구에 비해 영산 유채와 제초제 저항성 GM유채 처리구에서 DO값이 감소한 이유는 처리구의 시료가 유기물이며, 대상 수서 생물체인 잉어의 호흡 등의 생 리작용과 유기물 분해 작용 등의 영향을 받은 것으로 사료된 다. 수온은 영산유채와 제초제 저항성 GM유채에 대하여 각각 23.3 ± 0.2°C (23.1 ~ 23.5°C)와 23.3 ± 0.1°C (23.0 ~ 23.5°C)로 일정하게 유지되었다. 환경생물 독성시험 방법과 기준(농촌진 흥청 고시 제 2019-5호)에서 제시된 담수어류독성평가 시험 방법의 적정 수온인 20 ~ 25°C 수준 내에서 시험 용수의 수온 이 유지되었다(Table 4). 본 실험에서 사용된 잉어 시험 용수 의 DO, 온도, pH 등은 잉어 급성 독성 실험의 영향 요소로 작용하지 않았음을 확인하였다.

    영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 처리 농도별 잉어 치사 개체 분석

    담수어류의 대표적인 환경생물 독성 시험종인 잉어는 급성 독성 평가를 위해서는 일반적으로 48 및 96 시간 후의 치사 개체에 대한 평가가 수행된다(Bae et al. 2018). 이 실험을 통 해, 영산과 제초제 저항성 GM 유채의 각 처리 농도(0, 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L)와 처리시간(24, 48, 72, 96시간)에 따른 잉어에 대한 일반중독증상 및 치사 개체수를 조사하였다. 영산유채 처리구에서 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 m/L의 시험농도에서 잉어 급성독성시험을 실시한 결과, 48시간 경과시 313, 625 mg/L처리구에서는 치사 개체가 없었 으나, 1,250, 2,500 mg/L 처리구에서 48시간 경과시 각각의 농도에서 3.3, 33.3%의 치사 개체가 관찰되었으며, 96시간 경 과시 313, 625 mg/L처리구에서는 치사 개체가 없었으나, 1,250, 2,500 mg/L처리구에서 16.6, 56.6 %의 치사가 관찰되 었다. 5,000 mg/L처리구에서는 48시간, 96시간 후에 모두 100 % 치사로 관찰되었다. 제초제 저항성 GM유채 처리구에 서 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg/L의 시험농도에서 잉어 급성 독성 시험을 실시한 결과, 48시간 경과시 313, 625, 1,250 mg/L처리구에서는 치사 개체가 없었으나, 2,500 mg/L처리 농도에서 6.6%의 치사 개체가 관찰되었다. 96시간 경과시 313, 625 mg/L 처리구에 1,250, 2,500 mg/L처리구에 서 13.3, 23.3%의 치사 개체가 관찰되었다. 48시간과 96시간 경과시에 5,000 mg/L처리구에서는 모두 100% 치사됨을 확인 하였다. 처리 기간 중 음성대조군(0 mg/L), 영산과 제초제 저 항성 GM유채의 313, 625 mg/L처리구에서는 특이 증상 및 일반중독증상은 관찰되지 않았다. 그러나, 영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 1,250 mg/L이상의 처리 농도 조건에서 일 반중독증상인 아가미 호흡이 중단된 개체와 치사 개체가 관찰 되었다(Table 5). 영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 각 시 험농도에서 잉어 치사 개체수의 t-test 검정결과 24시간후의 2,500 mg/L처리구에서는 p값이 0.07으로 영산 유채와 제초제 저항성 GM유채간의 치사 개체수에서 통계적인 유의차는 없 었다. 48시간 처리후의 영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 p값은 1,250 mg/L처리구에서 0.42였으며, 72시간 처리후의 영 산유채와 제초제 저항성 GM유채간의 p값은 1,250, 2,500 mg/L처리구에서 각각 0.22, 0.07 로 분석되었다. 또한, 96시간 처리후의 영산유채와 제초제 저항성 GM유채간의 p값은 1,250 mg/L처리구에서 0.66 이였으며, 모든 처리농도에서 영산유채 와 제초제 저항성 GM유채간의 치사 개체수에는 통계적으로 유의적인 차이가 없었다(p > 0.05). 실험 결과를 종합하면, 모 품종인 영산과 제초제 저항성 GM유채의 치사 개체수에는 통 계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 분석되었다. 이와 같은 결과는 국내 개발된 비타민 A강화벼, 병저항성 GM벼 및 가 뭄저항성 GM벼의 잉어 급성독성 결과에서도 유사한 경향을 보였다(Moon et al. 2013;Oh et al. 2013;Oh et al. 2015). 또한, 전반적으로 유기물인 영산유채와 제초제 저항성 GM유채 시료의 처리 시간과 농도가 증가함에 따른 치사 개 체수는 유사한 경향을 보였으며, 제초제 저항성 GM유채의 처 리가 잉어의 일반 중독에 미치는 영향은 영산유채와 차이가 없음을 확인하였다. 영산 유채와 제초제 저항성 GM유채의 96 시간 처리 실험 종료 후에 잉어의 체중 및 전장을 분석한 결 과, 영산유채에서는 0.44 ± 0.04 g 및 3.1 ± 0.1 cm, 제초제 저항성 GM유채는 0.42 ± 0.03 g 및 3.0 ± 0.1 cm 로 측정되 었고, 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 6).

    영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 급이에 의한 잉어에 대한 급성독성

    영산 유채와 제초제 저항성 GM유채의 잉어 급성 독성시험 을 수행한 결과, 48시간-LC50은 영산유채 2,682 mg/L, 제초제 저항성 GM유채에서는 3,376 mg/L로 분석되었으며, 96시간- LC50은 영산유채 2,103 mg/L (95% 신뢰한계: 1,801 - 2,459 mg/L), 제초제 저항성 GM유채는 2,654 mg/L (95% 신뢰한계 : 2,267 - 3,123 mg/L)로 제초제 저항성 GM유채는 영산에 비 해 다소 낮은 독성을 보였으나, 95 % 신뢰한계 구간 내의 차 이로 유의성은 없는 것으로 판단되었다(Table 7). 무영향농도 (NOEC)는 영산유채와 제초제 저항성 GM유채의 두 품종에서 625 mg/L으로 확인되었다(Table 5).

    이는 글루포시네이트(glufosinate) 제초제저항성 유전자인 PAT가 제초제저항성 GM유채의 잉어에 미치는 영향은 차이가 없음을 나타내며, PAT에 의한 잉어에 부정적인 영향을 미치지 않음을 시사한다.

    본 실험의 어류에 대한 영향 평가는 Jeong et al. (2022)이 보고한 국내의 담수 환경에서 최고 탁도 128 mg/L 보다 다 소 높은 625 mg/L 수준에서는 96시간 급성 독성 평가에 따 른 이상 증상이나 치사 개체가 발견되지 않았다. Jeong et al. 2022에 따르면 GM작물에 대한 어류의 위해성 평가시 아가미, 신장 등의 이상 유무 검정을 포함한 조직학적 검사와 혈액학 적 평가 요소 등 또한 포함되어야 할 것으로 사료되고 더 나 아가 다양한 시험물질의 노출된 환경조건에 의한 독성영향에 대한 규명이 필요하다(Jeong et al. 2022).

    본 연구를 통해 PAT 유전자가 포함된 제초제 저항성 GM유 채가 모품종인 영산유채와 시험 조건에서 수서환경생물종인 잉어에 미치는 영향에 차이가 없음을 확인하였고, 이는 모품 종인 영산과 제초제 저항성 GM 유채가 농경지, 수로, 하천 등의 환경에 방출되었을 때 수서 생물체인 잉어에 미치는 생 물학적인 영향이 동일하다고 판단할 수 있다. 또한 본 실험에 서 적용되었던 생물종의 급성독성 영향뿐만 아니라 국내 개발 GM유채 환경위해성 평가를 위해서는 농업환경생물종의 생식, 유전독성 영향 분석 및 농업생태영향 평가를 통한 안전성평가 기준과 평가 가이드라인을 구축하여야 하며, 본 실험 결과는 이를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

    적 요

    1. 본 연구는 제초제저항성 유전자를 영산유채에 도입시킨 제초제저항성 GM유채의 환경위해성 평가에 대한 기초 자료 를 제공하고자 제초제저항성 GM유채에 도입된 유전자의 발 현을 검증하였고 어류 생물종인 잉어에 미치는 영향을 모품종 인 영산 유채와 비교 분석하였다.

    2. 제초제저항성 GM유채에 도입된 PAT의 PCR 검정 결과, 제초제저항성 GM유채에서만 PAT유전자가 검출되었다.

    3. 모품종인 영산유채와 제초제저항성 GM유채의 잉어에 대 한 급성독성시험을 수행한 결과, 영산유채는 96시간- LC50은 2,103 mg/L (95% 신뢰한계: 1,801 - 2,459 mg/L), 무영향농 도는 625 mg/L이였으며, 제초제저항성 GM유채의 96시간- LC50은 2,654 mg/L (95% 신뢰한계: 2,267 - 3,123 mg/L), 무영향 농도(NOEC)는 625 mg/L로 분석되었다. 잉어의 급성 독성 시험기간 중 영산유채와 제초제저항성 GM유채 간의 체 중, 전장, 수온, DO 및 pH에 대한 유의적인 차이는 없었으며, 잉어의 급성독성에 영향을 미칠 수 있는 요인은 발생하지 않 았으며, 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다.

    4. 본 연구의 결과는 영산유채와 제초제저항성 GM유채가 시험 조건에서 수서환경생물종인 잉어에 미치는 영향에 차이 가 없음을 확인하였고, 이는 non-GM인 모품종 영산과 제초제 저항성 GM 유채가 외부 환경에 방출되었을 때 수서 생물체 인 잉어에 미치는 생물학적인 영향이 동일하다고 판단할 수 있다. 또한 본 실험에서 적용되었던 국내 개발 GM유채 환경 위해성 평가를 위해서는 농업환경생물종의 생식, 유전독성 분 석 및 농업생태영향 평가를 통한 안전성평가 기준과 평가 가 이드라인을 구축하여야 하며, 본 실험 결과는 이를 위한 기초 자료로 활용 가치가 있을 것이다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    본 연구는 농촌진흥청 연구개발사업(과제번호:PJ016726, PJ014235)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

    Figure

    KSIA-35-4-278_F1.gif

    Confirmation of the T-DNA genes on the Herbicideresistant transgenic rapeseed and non-genetically modified rapeseed (Youngsan). M, 100bp plus DNA ladder; N, nongenetically modified rapeseed (Youngsan); TG rapeseed, Herbicide-resistant transgenic rapeseed.

    KSIA-35-4-278_F2.gif

    Confirmation of genes expression for the Herbicideresistant transgenic rapeseed by using immunostrip tests for the PAT (Phosphinothricin acetyltransferase) detection. N, non-genetically modified rapeseed (Youngsan); TG rapeseed, Herbicide-resistant transgenic rapeseed.

    Table

    Primer list and sequence used for Polymerase chain reaction (PCR) analysis.

    <i>bar</i>; Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) gene.

    Changes in pH during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    N.A., not applicable.
    <sup>z</sup> Mean ± Standard deviation

    Changes in DO (dissolved oxygen) during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    N.A., not applicable.
    <sup>z</sup> Mean ± Standard deviation

    Changes in the water temperature (°C) during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    N.A., not applicable.
    <sup>z</sup> Mean ± Standard deviation

    Cumulative mortality of Cyprinus carpio in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    Body weight and total length of Cyprinus carpio after 96 hours in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    yTest water
    zMean ± Standard deviation

    LC50 (lethal concentration 50) values of Cyprinus carpio after 48 and 96 hours in the non-genetically modified rapeseed (Youngsan) and Herbicide resistant transgenic rapeseed (TG rapeseed).

    z95 % confidence interval.

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