서 언
토마토 점무늬병(Gray leaf spot)은 Stemphylium 속의 몇 가지 종이 일으키는 곰팡이 병으로(Huang and Tsai, 2017;Lian et al., 2022;Scott and Gardner, 2007), 미국(Hendrix and Frazier, 1949), 중국(Su et al., 2019), 대만(Huang and Tsai, 2017), 인도(Devi et al., 2021), 말레이시아(Nasehi et al., 2012), 이스라엘(Rotem et al., 1966), 브라질(Miranda et al., 2010), 아르헨티나(Franco et al., 2017), 베네수엘라 (Cedeño and Carrero, 1997) 등 전 세계적으로 토마토 생산에 피해를 주는 중요한 병이다. 국내에는 Stemphylium lycopersici 와 S. solani가 병원균으로 보고되어 있다(Min et al., 1995;Kim et al., 1999). 주로 기후가 온난하고 상대습도가 높은 토 마토 재배 지역에서 발병하며, 중국과 인도에서는 특히 온실 재배에서 병 발생이 증가하여 생산성이 크게 감소한 바 있다 (Devi et al., 2021;Su et al., 2019).
토마토 점무늬병은 주로 토마토의 오래된 잎부터 발병이 시 작하며, 잎의 양면에 발생한 작은 검은색 반점이 점차 확대되 면서 회갈색으로 바뀌고 병반 주변이 황화 된다. 최종적으로 는 반점의 중앙이 부스러지고 잎은 말라서 떨어진다(Su et al., 2019). 또한 과실에는 직접적인 영향을 주진 않지만, 잎에 피 해를 주기 때문에 과실의 수량과 품질이 감소하게 된다(Yang et al., 2022).
점무늬병균은 포자가 바람과 물에 의해 전파되고, 토양, 식 물체 잔해, 잡초에서 오랜 기간 생존할 수 있다. 또한 화학적 방제가 어렵기 때문에 점무늬병에 저항성을 갖는 토마토를 육 종하는 것이 가장 효율적이고 경제적인 방제법으로 알려져 있 다(Su et al., 2019). 토마토 점무늬병 저항성 유전자(Sm)는 토마토의 11번 염색체에 존재하는 단일 불완전 우성 유전자 (single incompletely dominant gene)로 토마토 야생종인 Solanum pimpinellifolium에서 확인되었으며(Andrus et al., 1942;Hendrix and Frazier, 1949), 현재까지 점무늬병을 일으 키는 Stemphylium 속에 대한 저항성이 유지되기 때문에 전 세계적으로 점무늬병 저항성 토마토 품종 육성에 이용되고 있 다(Parlevliet, 2002;Yang et al., 2022).
국내에서는 최근 상대적으로 온난하고 상대습도가 높은 토 마토 시설재배지에서 문제가 되고 있다. 점무늬병 저항성 토 마토 품종 육성을 위해 국내에서 분리한 점무늬병 균주에 대 한 저항성 유전자(Sm) 연관 마커를 개발하고 고도화하는 연구 들이 수행되고 있으나, 국내 분리 균주에 대한 토마토 유전자 원의 대량 저항성 평가 연구는 부족한 실정이다(Park et al., 2020). 따라서 본 연구는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 서 보존하고 있는 223개의 토마토 유전자원을 대상으로 국내 에서 분리된 점무늬병균(S. lycopersici)에 대한 저항성 자원을 선발하기 위해, 국내에서 분리된 점무늬병 균주를 분양받아 생 물검정을 수행하고, 분자마커를 이용하여 점무늬병 저항성 유 전자(Sm)의 유전형을 분석하였다.
재료 및 방법
식물 재료
토마토 점무늬병 저항성 검정을 위해 농촌진흥청 국립농업 과학원 농업유전자원센터에서 보존하고 있는 토마토 유전자 원 중 S. lycopersicum 154자원, S. pimpinellifolium 52자원, S. peruvianum 12자원, S. habrochaites 4자원, S. corneliomulleri 1자원을 포함한 총 223자원을 분양받아 실험하였다. 실험에 사용 된 자원의 원산지는 33개국으로, 불가리아, 페루, 중국, 에콰도르, 한국, 미국, 멕시코 등을 원산으로 한다(Table 1). 대조품종으로는 점무늬병 감수성 품종인 ‘Moneymaker’를 사용하였다(Yang et al., 2017). 각각의 토마토 종자는 50공 플러그트레이에 원예용 상토를 채우고 자원당 8립씩 파종하여 유리온실에서 22~28°C 온도 조건 으로 약 2주간 육묘하였으며, 육묘한 묘는 화분에 옮겨 심었다. 옮겨심기 후 식물체의 5~6번째 신초가 전개될 때, 하위 1~2번째 가지를 잎이 붙어있는 채로 채취하여 병원균 접종에 사용하였다.
병원균 배양 및 접종원 준비
시험균주는 국립농업과학원 작물보호과에서 보존하고 있는 S. lycopersici NC21-955 균주를 분양받아 실험에 사용하였다. 해당 균주는 전북 김제시 소재 토마토 하우스에서 채집한 병 든 토마토 시료에서 순수 분리한 균주로 균학적 특성과 DNA 염기서열 분석에 의해 동정이 완료된 균주이다(Fig 2). 접종원 준비를 위하여 V8 juice agar (V8A) 배지 중앙에 균총을 옮 겨 28°C 배양기에서 명(near-ultra violet, 12시간)/암(12시간) 조건으로 5일간 배양하였다. 멸균수를 각 플레이트에 붓고, 스 크래퍼로 긁어 포자를 회수하고, 4겹의 거즈로 거른 후, hemocytometer를 사용하여 5 × 104 conidia/ml 농도의 포자현 탁액을 만들어 접종에 사용하였다.
병원균 접종
밀폐용기 바닥에 멸균수를 적신 와이프올을 넣어 상대습도 를 90% 이상 유지하게 하고, 바닥에서 5 cm 위로 플라스틱 깔판을 놓아 토마토의 잎이 붙어 있는 분리된 가지 4개를 앞 면이 위를 향하게 치상하였다. 각 가지마다 상위 3개의 잎에 마이크로피펫을 사용하여 포자현탁액 5 μl를 각 잎에 떨어뜨 려 접종하였고, 대조구는 같은 방법으로 멸균수를 처리하였다. 접종 후에는 25°C 생장상에서 밀폐용기 뚜껑을 닫아 2주간 습 실 처리하였다.
발병도 조사
S. lycopersici 접종 2주 후 접종된 토마토 잎에서 반점 생 성 유무, 병반의 형태, 병반의 크기 확장 정도를 기준으로 발 병도를 조사하였다. 발병도는 총 5단계의 발병지수(Disease index)로 나타내었으며, 무발병은 0, 갈색의 작은 반점이 형성 되고 반점 주변이 황화 된 것은 1, 반점이 움푹 파이고 부정 형의 진한 갈색으로 병반이 확장하는 것은 2, 병반의 가운데 가 회색으로 변하고 병반이 합쳐져 확대된 것은 3, 잎 전체가 어두운 갈색 또는 검은색으로 변한 것은 4로 발병지수를 설정 하였다(Fig. 1). 자원당 4~8개체를 반복으로 하여 실험하였고, 발병도의 평균을 계산하여 평균 ± 표준오차로 표기하였다. 자 원의 평균 발병도가 0 이상 1.0 미만은 저항성, 1.0 이상 2.0 미만은 중도저항성, 2.0 이상은 4.0 이하는 감수성으로 판단하 였다.
DNA 추출
각 유전자원당 2개체에서 3~4엽기 유묘의 상위 1~2번째 본 엽을 채취하여 2 ml Safe-Lock tube에 tungsten carbide bead 2개를 함께 넣고 TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 마쇄하였다. 이후 DNA 추출 키트 (DaBeadTM Genomic DNA Prep Kit For Plant, BIOFACT, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 마쇄 한 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA 는 microplate reader (Infinite® 200 pro, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 260nm에서 정량하고 최종 농도가 20ng/ μl가 되도록 희석하였다.
Hybridization Probe Melting(HPM) 분석
분석 분자마커는 ㈜부농종묘에서 개발하여 특허 등록 및 한국농업기술진흥원으로 기술 이전된 Hybridization Probe Melting(HPM)용 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하였으 며, primer 염기서열은 forward primer(SmD_F5): 5'- AGTGACACTACACAATTGATATTTCAC-3', reverse primer (SmD_R5): 5'-GTAATGGCTTCTGGTGTGCATACATCT-3'이 고, SNP 확인을 위해 사용된 probe(SmD_P1)의 염기서열은 5'- CATAAATGTGTCATTCGTGTTT-3'과 같다. PCR을 수행 하기 위한 반응액은 genomic DNA (20 ng/μl) 1.5 μl, 50 μM SYTOTM 9 green fluorescent nucleic acid stain (InvitrogenTM, Oregon, USA) 0.52 μl, HS prime LP premix 2X (GeNet Bio, Deajeon, Korea) 7.5 μl, triple distilled water (TDW) 3.88 μl, 각각 10 pmol의 forward primer 0.1 μl, reverse primer 0.5 μl, probe 1 μl를 혼합하여 총 부피 15 μl 로 만들어 사용하였다. HPM 분석 기기는 LightCycler® 96 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하였으며, PCR 반응은 95°C에서 10분간 pre-denaturation을 진행하였고, 95°C에서 20초간 denaturation, 56°C에서 20초간 annealing, 72°C에서 20초간 extention 과정을 총 45 cycle로 수행하였다. 최종적으로 생산된 PCR products는 40°C에서 85°C까지 초 당 0.25°C 간격으로 SYTOTM 9 형광값을 측정하여 melting curve graph를 작성하였다. Melting curve를 분석하기 위해 LightCycler® 96의 software version 1.1.0.1320을 이용하였다. 유전자형은 3개의 그룹, 동형접합형 저항성 R(RR), 이형접합 형 저항성 H(RS), 동형접합형 감수성 S(SS)으로 구분하여 분 류하였다.
결과 및 고찰
국립농업과학원 농업유전자원센터로부터 분양받은 토마토 223자원의 점무늬병에 대한 저항성을 검정하고자 토마토 잎에 점무늬병균(S. lycopersici)을 접종한 후 2주간 병징을 관찰한 결과, 고도저항성 자원의 잎은 병징이 없이 깨끗했다. 반면에 감수성 대조품종 ‘Moneymaker’와 감수성 자원의 접종엽은 갈 색의 작은 반점이 나타나며 주변이 황화 되기 시작했고, 이후 반점이 움푹 파이고 테두리의 갈색 병반이 확장하며 점차 병 반의 중심부는 회색으로 변하였으며, 부정형의 병반이 합쳐져 심할 경우 잎 전체가 진한 갈색 또는 검은색으로 변하였다 (Fig. 1). 잎 병반의 표면을 현미경으로 관찰한 결과 분생포자 경(conidiophore)과 분생포자(conidia)를 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 병반에서 분리한 균을 PDA 배지에 옮겨 28°C 생장상에 서 암조건으로 7일간 배양하여 배양적 특성을 관찰한 결과 회 백색의 균사체와 어두운 올리브색 콜로니를 형성하였고, 색소 는 연황색을 나타내었다(Fig. 2B). 또한 병반에서 분리한 균을 V8A 배지에 옮겨 균학적 특성을 관찰한 결과 배지에 형성된 분생포자경은 직선형으로, 여러 개의 격막이 있고, 정단부위에 분생포자를 형성하였다(Fig. 2C). 분생포자는 장타원형이며 선 단부가 둥글거나 뾰족하였고, 횡경막과 종경막을 관찰할 수 있 었다(Fig. 2D). 이러한 결과는 Choi et al. (2016)의 연구결과 와 일치하며, 이를 통해 병반에서 분리된 병원균의 배양적, 균 학적 특성이 S. lycopersici와 일치함을 확인하였다.
점무늬병균(S. lycopersici) 접종 2주 후 토마토 자원의 발병 도 분포를 조사한 결과, 총 223자원 중 발병지수가 0 이상 1.0 미만으로 저항성인 자원은 22자원(9.9%), 1.0 이상 2.0 미 만으로 중도저항성인 자원은 65자원(29.1%), 2.0 이상 4.0 이 하로 감수성인 자원은 136자원(61%)이었다. 또한 감수성 136 자원 중 발병지수가 2.0 이상 3.0 미만이 73자원으로 비율이 가장 높았으며, 3.0 이상 4.0 미만이 61자원, 4.0인 자원이 2 자원이었다(Fig. 3). 대조품종 ‘Moneymaker’의 발병도 평균은 3.5로 감수성으로 판정되었으며, 이는 해당 품종이 점무늬병에 감수성이었다는 이전 연구결과와 일치하였다(Yang et al., 2017). 토마토 자원의 종별 점무늬병 발병도 분포를 살펴보면 S. lycopersicum은 총 154자원 중 21자원이 저항성, 51자원이 중도저항성이었으며, S. pimpinellifolium은 총 52자원 중 저항 성 자원은 없고, 11자원이 중도저항성이었다. 그 밖에도 S. peruvianum은 총 12자원 중 저항성이 1자원, 중도저항성이 1 자원이었으며, S. habrochaites은 총 4자원 중 중도저항성이 2 자원, S. corneliomulleri는 저항성, 중도저항성 자원이 존재하 지 않았다(Table 2).
저항성 22자원의 종 분포는 S. peruvianum 1자원을 제외하 고 모두 S. lycopersicum이었다. 원산지는 중국이 6자원으로 가장 많았으며, 우즈베키스탄은 2자원, 한국 등 11개국은 각각 1자원씩 구성되었다. 자원구분으로는 육성품종이 10자원, 육성 계통이 2자원으로 대부분의 비중을 차지하였고, 야생근연종과 재래종은 각각 1자원이었다(Table 3). 중도저항성 자원의 경우 육성 품종과 육성 계통의 비중이 야생근연종과 재래종의 비중 보다 더 컸다. 반면에 감수성 자원은 야생근연종 또는 재래종 의 비중이 높았으며, 발병도가 높아질수록 이는 더욱 심화되 었다(데이터 미제시). 이러한 결과는 토마토 육종 과정 중 많 은 육성품종 또는 육성계통에 점무늬병 저항성 유전자(Sm)가 도입되었기 때문에(Park et al., 2020) 상대적으로 야생근연종 과 재래종에 비해 점무늬병 저항성인 자원의 비율이 높은 것 으로 판단된다. 또한 S. lycopersicum의 저항성 자원(Table 3) 과, 중도저항성 자원 대부분이 육성품종 또는 육성계통이고, 감수성 자원에서는 야생근연종 또는 재래종의 비중이 높았던 결과(데이터 미제시)도 이러한 이유로 사료된다.
Yang et al. (2022)에 따르면 토마토의 Sm 유전자는 병저항 성 단백질 NBS-LRR (nucleotide-binding site-leucine-rich repeat)을 암호화하여 점무늬병에 저항성을 부여한다고 보고하 였다. 생물검정 결과에서 저항성으로 판단된 토마토 22자원과 대조품종 ‘Moneymaker’의 점무늬병 저항성 유전자(Sm) 유전 형을 HPM 기법으로 Melting curve를 분석한 결과, 유전자원 22자원 중 20자원은 저항성 유전자가 동형접합형 저항성(RR) 이었다(Table 3). 대조품종 ‘Moneymaker’는 기존에 알려진 것 과 같이 동형접합형 감수성(SS)으로(Yang et al., 2022), 본 실험의 생물검정 결과와 유전형이 일치하였다. 나머지 2자원 (K243796, K254199)의 경우 유전형 구분이 확실치 않아 해당 자원들에 대해서는 유전형을 재분석할 필요가 있다.
점무늬병 발병률이 0%인 3자원(IT33172, IT173869, IT203255)의 과실특성을 조사한 결과 IT33172는 미숙과색은 녹색, 성숙과색은 진한 빨간색의 둥근형 과실이며, 과고 4.7 cm, 과폭 5.6 cm, 생과중 91.6 g, 당도 4.0°brix이었다. IT173869는 미숙과 색이 녹색, 성숙과 색은 빨간색의 세로가 긴 둥근형의 과실이며, 과폭 2.7 cm, 당도 6.3°brix이었다. IT203255는 미숙과색은 밝은 녹색, 성숙과색은 빨간색의 둥근 형 과실이며, 과고 4.8 cm, 과폭 5.1 cm, 생과중 71.8 g, 당도 3.8°brix이었다(Fig. 4). Hanson et al. (2016)에 따르면 효과 적인 병저항성 토마토 품종 육성을 위한 유전자원 또는 계통 선발 방법으로, 신속한 병저항성 평가가 가능하고 환경적 변 이를 줄일 수 있으며, 해충이나 다른 병에 의한 병징과 혼동 을 피할 수 있는 온실 유묘 검정법, 품종이 출시될 지역의 자 연적인 발병 조건하의 포장에 토마토를 재식하여 병저항성을 평가하는 포장 검정법, 토마토의 병저항성 유전자와 연관된 마 커를 이용하여 실험실에서 신속, 대량 병저항성 평가가 가능 한 marker-assisted selection (MAS) 방법을 제시하였다. 또한 효과적인 병저항성 토마토 육종을 위해서는 최근 농업인의 수 요에 따라 여러 가지 병에 복합저항성을 가지고 원예적 형질 이 우수한 계통을 구축하는 것이 중요하다고 하였다. 최근에 는 이상기상에 대응하기 위해 내재해성 품종 육성 또한 활발 히 진행되고 있다(Jeong et al., 2022). 따라서 본 연구에서 생물검정 및 저항성 유전자의 유전형 분석을 통해 평가된 점 무늬병 저항성 토마토 자원들에 대해서도 추후에 온실 검정과 포장 검정을 통해 병저항성 자원 선발을 고도화할 필요가 있 으며, 추가적으로 토마토 재배에 문제가 되는 병해인 토마토 황화잎말림바이러스(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 토마토반점위조바이러스(tomato spotted wilt virus, TSWV), 풋마름병 등에 대한 복합저항성 평가, 고온에서도 정상적인 착 과 및 과실비대가 가능한지를 판단하는 고온 내성 평가, 수량, 과실특성 등의 원예적 형질에 대한 평가도 필요할 것으로 사 료된다.
본 연구에서 토마토 잎을 이용한 점무늬병 저항성 생물검정 결과, 총 토마토 223자원 중 점무늬병에 저항성으로 판정된 22자원과 중도저항성으로 판정된 65자원을 선발하였다. 또한 저항성으로 판정된 22자원은 HPM 분석을 통해 점무늬병 저 항성 유전자(Sm)의 유전형을 확인하였다. 본 연구에서 선발된 자원은 향후 토마토의 점무늬병 저항성 품종 육성과 유전형 분석 연구 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
적 요
본 연구는 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 보존하고 있는 223개의 토마토 유전자원을 대상으로 국내에서 분리된 점무늬병 균주에 대한 저항성 자원을 선발하기 위해, 생물검정 과 점무늬병 저항성 유전자(Sm)의 유전형 분석을 수행하였다.
Stemphylium lycopersici 접종 2주 후 토마토 잎에서 발병도 (0-4)를 조사한 결과, 발병도가 0 이상 1.0 미만인 22자원이 저항성으로 판정되었고, 발병도가 1.0 이상 2.0 미만인 65자원 은 중도저항성으로 판정되었다.
저항성으로 판정된 22자원은 Hybridization Probe Melting(HPM) 분석을 통해 점무늬병 저항성 유전자(Sm)의 유 전형을 확인한 결과, 22자원 중 20자원이 동형접합형 저항성 이었다.
본 연구에서 선발된 자원은 향후 토마토의 점무늬병 저항성 품종 육성과 유전형 분석 연구 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
