서 언

복숭아는 과피가 연하며 호흡급등형 과실로서 수확직후부터 과실의 연화가 급격하게 진행되기 때문에, 복숭아 과실은 성숙이 진행되면서 쉽게 무르게 되고 보구력이 빠르게 저하되어 수확이나 유통 과정에서 상품성을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 유통기간을 단축시킨다. 또한 복숭아는 국내에서 유통기간이 길지 않고, 수확 이후에도 냉각이나 저온 유통 등의 유통기간 연장을 위한 적극적인 수확 후 관리 기술을 적용하기 쉽지 않기 때문에, 국내의 복숭아 유통과정에 적용할 수 있는 유통기간 연장을 위한 수확후관리 기술의 개발도 거의 없는 실정이다(Lee et al., 2017).

복숭아는 전형적인 호흡급등형 과실로 성숙 과정에서 호흡과 에틸렌 발생량이 급증하고, 에틸렌의 발생은 성숙과 관련된 생화학적 변화와 연화를 진행시키며 이로 인해 상품성과 저장성이 저하된다(Tonutti et al., 1991;Mathooko et al., 2001;Ruperti et al., 2001;Rasori et al., 2002;Choi, 2005). 칼슘은 과실 경도 유지와 관련된 물질로서, 칼슘 처리에 의해 과실의 연화를 지연시키고 호흡을 억제하여 성숙의 진행을 조절하는 것으로 알려져 있다(Bangerth et al., 1972;Chéour et al., 1990). 따라서, 다양한 작물을 대상으로 과실의 품질을 유지하고 저장성을 높이기 위한 수확 전후의 칼슘 처리에 관한 연구들이 진행되어 왔다. 수확 전이나 수확 후 칼슘 처리는 복숭아 과실의 보구력을 향상시키는 것으로 보고되었으며 (Manganaris et al., 2005, 2006, 2007), 국내에서도 ‘대월’ 및 ’백도’ 복숭아 품종에서 칼슘 처리에 의해 경도 저하가 억제되었다고 하였다(Kim et al., 2006;Park et al., 2010). 딸기, 나무딸 기 및 블루베리에서도 칼슘이 과실 품질 및 저장성을 높이기 위한 연구에 사용되었다(Chéour et al., 1990;Hanson et al., 1993;Montealegre and Valdes, 1993;Wójcik and Lewandowski, 2003;Angeletti et al., 2010;Ahn et al., 2014).

키토산은 갑각류 껍질을 정제한 키틴을 탈아세틸화하여 만든 고분자 천연화합물(Rege and Block, 1999;Shahidi et al., 1999)로 채소나 과실의 표피에 천연 항균 피막을 형성하여 증산과 호흡을 억제하며 저장성을 향상시키는 효과를 나타낸다(El-Ghaouth et al., 2000;Bautista-Banos et al., 2006). 복숭아를 포함한 배, 키위의 저장실험에서 수확 후에 키토산을 코팅 처리하면 경도를 유지하고, 에틸렌 발생과 호흡을 억제하는 효과가 있다고 보고되어 있다(Du et al., 1997). 키토산 처리가 딸기의 품질과 부패에 미치는 영향에 관한 연구에서 경도 유지 및 잿빛곰팡이병 발생 억제와 표피의 광택 유지 효과가 나타났다고 보고하였으며(Hwang and Ku, 2004), 칼슘과 키토산의 혼합 처리에서 키토산의 단독 처리보다 혼합 처리구에서 저장기간 동안 경도 유지에 효과적이었다고 보고하였다(Hernández-Muñoz et al., 2006, 2008).

과실의 연화가 진행되면 품질 변화와 보구력 저하를 유발하며, 이에 관여하는 효소들은 pectin lyase(PL), pectin methylesterase (PME), polygalacturonase(PG), cellulase, α-, β-galactosidase, β-glucosidase, α-mannosidase 및 β-xylosidase 등이 있다(Lee et al., 2019;Lee et al., 2020). 또한 효소활성 조절에 관여하는 유전자의 발현과 연관된 연구도 진행되고 있으나 국내에서는 연구가 매우 미진한 상황이다(Lee et al., 2020). 본 연구에서는 복숭아 과실의 수확 전후 칼슘과 키토산의 단용 및 혼용 처리가 과실의 보구력 향상에 미치는 영향을 유전자 발현 수준에서 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 시험 포장 및 식물재료

본 연구는 경상북도 경산시 남산면에 위치한 복숭아 과수원 (위도: 35.7799, 경도: 128.8437)에서 개심자연형(재식거리: 5.0 m×5.0 m)으로 관리하는 7년생의 중생종 ‘금홍’(무모계)과 주요 품종인 ‘마도카’(유모계) 복숭아를 대상으로 진행하였다. 시험구 처리는 ‘금홍’과 ‘마도카’를 대상으로 각 처리당 1주를 1반복으로 완전임의 배치하고 3반복 처리하였다. 관행적으로 재배되는 동일한 조건에서 칼슘과 키토산을 단용 및 혼용 처리한 후 생육단계에 따라 수확 적기에 과실의 착색 정도, 크기 등을 고려하였고, 당도와 적정산도(Table 1, Lee et al., 2019) 등을 확인한 후 수확하여 실험을 수행하였다.

2. 칼슘 및 키토산 처리

칼슘제로는 구연산칼슘, 염화칼슘, 질산칼슘, GH-Ca, OSCa, 키토산을 제조사의 제품 권장 농도로 단용 및 혼용처리 하였으며, 처리된 칼슘에 대한 정보는 Table 2에 나타내었다. 단용 처리는 구연산칼슘, 염화칼슘, 질산칼슘, GH-Ca, OS-Ca, 키토산을 각각 단용으로 수체에 분무하였으며, 혼용 처리는 키토산과 염화칼슘을 혼합하여 수체에 분무하였다. 1주를 1반복으로 하여 3반복 처리하였다. 수체 살포 처리는 과실 생육의 제3기가 시작되는 시기인 만개일을 기준으로 ‘마도카’는 만개 후 84일, ‘금홍’은 만개 후 82일인 7월 6일부터 시작하여 각 각 1차 처리 후 7일 간격으로 4회 살포한 후 ‘마도카’는 7월 27일(만개 후 105일), ‘금홍’은 8월 8일(만개 후 115일)에 수확하였다. 복숭아에서 세포벽 분해와 관련된 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 수체 처리 후 수확하여 시료를 채취한 수확 전처리와 수체 처리가 안된 과실을 수확하여 칼슘제를 바로 분무 처리한 후 24시간이 지난 후에 시료를 채취한 수확 후 처리로 구분하였다. 채취한 시료는 즉시 액체질소에 급속 냉동한 후 –80°C에 보관하였다.

3. RNA 분리 및 real-time PCR 분석

복숭아 수확 전 수체에 처리한 경우와 수확 후 분무처리한 복숭아 과실에서 RNA를 분리하였다. 각 처리별로 과실의 과피와 과육이 1:1의 비율로 포함되도록 채취한 시료는 액체질소를 충분히 유지하여 동결시키고 –80°C에 보관하였다. RNA 분리는 Chang et al.(1993)과 Hu et al.(2002)의 방법을 수정하여 사용하였다. 각 처리 별 시료는 액체질소를 이용하여 충 분히 마쇄한 후 50mL 코닝 튜브에 넣어 다음 단계로 진행하였다. Chang et al.(1993) 논문의 1차 추출 단계에서 Hu et al.(2002) 논문의 washing buffer를 첨가하였으며, 1, 2차 추출 단계의 원심분리(Union32R, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Korea) 조건은 3,200rpm, 30분으로 바꾸고, 2- mercaptoethanol의 넣는 양을 수정하여 첨가하고, RNA 추출 과정을 진행하였다.

분리한 RNA(500ng)는 역전사효소(GoScript^TM, Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 정량적 real-time PCR 반응은 SYBR Premix Ex Taq^TM(TaKaRa Bio Inc., Japan) 제조사의 방법을 따라 20 μL 반응액을 조제하여 사용하였고, 유전자증폭기(CFX96^TM Real-Time System, BioRad, USA)를 이용하였다. 반응 조건은 95°C에서 30초 후, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초 반응을 40회 반복하였다. 발현 분석은 증폭 량에 따른 형광 강도를 각 cycle 마다 측정하였고, 각각의 프라이머에 의한 발현 값은 복숭아 actin 유전자의 발현 값에 비례하여 상대적으로 계산하였다. 유전자 분석은 각각 3 반복으로 실시하였으며, 실험에 이용한 프라이머 염기서열은 Table 3에 나타내었다.

4. 통계처리

통계분석은 SPSS 프로그램(IBM SPSS Statistics 20, SPSS Inc., USA)으로 분산분석을 실시하였고, 실험처리 평균치 간의 유의성은 Duncan’s multiple ranges test (p<0.05)으로 검정하였다.

결과 및 고찰

복숭아 ‘금홍’과 ‘마도카’ 과실을 수확 전과 수확 후로 구분하여 칼슘과 키토산을 처리한 후, quantitative real-time PCR 을 이용하여 pectin lyase(PL), polygalacturonase(PG), pectin methylesterase(PME) 유전자의 발현양상을 분석하였다.

‘금홍’에서 PL 유전자는 수확 전후 칼슘과 키토산 처리에 의해 무처리구에 비해 유전자 발현이 억제되는 경향이었다. 수확 전 처리의 구연산칼슘 단용 처리구에서 유전자 발현이 가장 낮았으며, 나머지 처리구에서는 키토산+염화칼슘 혼용 처리구, 키토산, 질산칼슘 단용 처리구 순으로 낮은 발현 양상을 나타내었다. 수확 후 처리의 모든 처리구에서 PL 유전자 발현은 무처리구와 비슷하거나 약간 억제되는 경향으로, 질산칼슘 단용 처리구에서 유전자 발현량이 가장 낮았으며, 키토산+염 화칼슘 혼용 처리구, 키토산, 구연산칼슘, 염화칼슘 단용 처리구에서 낮은 경향이었다(Fig. 1). ‘마도카’에서는 수확 전 처리와 수확 후 처리의 모든 처리구에서 무처리구 보다 높게 발현하는 양상을 나타내었다(Fig. 1).

PG 유전자의 발현은 ‘금홍’에서는 수확 전 처리구에서는 무처리구와 발현 양상이 비슷하거나 억제되는 경향이었으며, 키토산 단용 처리구에서 발현량이 가장 낮았으며, GH-Ca, 질산 칼슘, 구연산칼슘 단용 처리구에서도 낮은 경향이었다(Fig. 2). 수확 후 처리에서도 무처리구에 비해 모든 처리구에서 PG 유전자 발현이 억제되는 경향이었다. 특히 질산칼슘, 키토산, GH-Ca, 구연산칼슘 단용 처리구에서 PG 유전자의 발현량이 많이 억제되는 경향이었다. ‘마도카’에서는 수확 전 처리에서 모든 처리구의 PG 유전자 발현이 억제되는 경향으로, 구연산 칼슘 단용 처리구에서 가장 발현량이 낮았으며, OS-Ca 단용 처리구, 키토산+염화칼슘 혼용 처리구, 질산칼슘 단용 처리구에서 낮은 발현량을 나타내었다. 그러나, 수확 후 처리에서는 OS-Ca 단용 처리구를 제외한 나머지 처리구에서 무처리구보다 PG 유전자 발현이 유도되는 경향이었다.

PME 유전자의 발현 양상은 ‘금홍’에서는 수확 전 처리에서 키토산+염화칼슘 혼용 처리구와 GH-Ca, 질산칼슘, 키토산 단용 처리구에서 유전자의 발현이 강하게 억제되는 경향이었고, 수확 후 처리에서는 무처리구와 비슷한 발현 양상을 나타내거나 약간 억제되는 경향이었으며, 질산칼슘, 키토산, 구연산칼슘 단용 처리구에서 PME 유전자 발현이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 3). ‘마도카’에서는 수확 전후 처리구 모두에서 무 처리구에 비해 PME 유전자의 발현량이 억제되는 경향이었다. 수확 전 처리에서는 모든 처리구에서 PME 유전자의 발현 양상이 비슷하게 나타났으며, 키토산+염화칼슘 혼용 처리구에서 발현이 가장 많이 억제되었으며, 염화칼슘, 키토산 단용 처리구에서도 많이 억제되는 경향이었다. 수확 후 처리에서는 질산칼슘 단용 처리구에서 발현량이 가장 많이 억제되었으며, 구연산칼슘, 키토산 단용 처리구, 키토산+염화칼슘 혼용 처리구 등의 순서로 PME 유전자의 발현이 억제되는 경향이었다. 전체적으로 유전자의 발현이 억제되는 양상으로 볼 때, 수확 전의 처리에서는 키토산, 구연산칼슘 단용 처리와 키토산+염화 칼슘 혼용 처리구에서 칼슘제 처리효과가 좋았으며, 수확 후의 처리에서는 질산칼슘 단용 처리가 가장 효과적이었다. Lee et al.(2019)에 의하면 복숭아 과실의 경도 유지에는 키토산+ 염화칼슘 혼용 처리구와 키토산, 구연산칼슘, 질산칼슘 단용 처리구에서 효과가 좋았다고 하였으며, 본 연구의 결과와 비슷한 결과를 나타내었다.

중생종 복숭아 품종인 ‘금홍’과 ‘마도카’를 대상으로 칼슘과 키토산의 단용 및 혼용 처리에 따른 복숭아 과실의 경도 변화 억제, 호흡량 및 에틸렌 감소로 보구력이 향상되는 효과가 있으며, 처리에 의한 과실의 품질 변화도 없음이 이전 보고에서 확인되었다(Lee et al., 2019). 딸기, 망고, 파파야, 다래 등의 과실에 수확 전후 칼슘, 키토산 단용 처리, 또는 칼슘-키토산의 혼용 처리가 저장기간 동안 과실의 경도 저하 억제에 효과적이라고 보고되어 있다(Chien et al., 2007;Mahmud et al., 2008;Ahn et al., 2014;Shin et al., 2016). 이러한 효과는 과실의 연화와 관련된 효소의 활성화와 관련이 있으며, 과실의 연화에 관여하는 PL 효소는 β-elimination mechanism에 의해 펙틴 중합체를 직접 분해하며 4,5-unsaturated oligogalacturonides 를 형성한다(Yadav et al., 2009). PG 효소는 펙틴산과 갈락 투론산의 α-1,4-글리코사이드 결합을 가수 분해함으로써 중요한 역할을 하며(Verma et al., 2017), PME 효소는 펙틴 기질에 작용하는 펙티나아제 효소로 펙틴과 유리된 카르복실기 및 메탄올의 메틸에스테르화를 촉매한다. 고분자의 에스테르 펙틴으로부터 메탄올을 제거하고 PG효소에 의해 이후 가수분해 되어 카르복실그룹 옆의 글리코시드 결합을 분해하여 에스테르펙틴으로 전환시킨다(Verma et al., 2017).

비호흡급등형인 오렌지 과실에 질산칼슘의 분무 처리는 오렌지 과피의 칼슘의 함량을 증가시키며, 세포벽 분해 효소 유전자(PG, PE 및 Cx)의 발현을 현저하게 억제하여 부피과와 열과의 발생을 줄일 수 있다고 보고하였다(Huai et al., 2022). 비호흡급등형과실인 포도 생육기간의 염화칼슘 처리는 포도 과실의 칼슘 함량을 증가시켜 과피의 열과의 발생을 억제하고, 여러 유전자들 중에서 PME 등은 칼슘 처리에 의한 영향이 없었으나 PG1, PG2, EXP6(expansin), 유전자와 큐티클 생합성과 관련된 CER9(ECERIFERUM9), CYP15(Cytochrome P450 monooxygenase/hydroxylase) 유전자의 발현을 억제하였다고 보고하였다(Martinsa et al., 2020). 다른 비호흡급등형 과실인 딸기에서도 수확 후 염화칼슘과 옥신의 혼용 처리에 의해 세포벽 변형과 관련된 PG1, PL, endoglucanase(EG1)의 유전자 발현이 모두 낮은 수준으로 발현되었다고 보고하였다 (Figueroa et al., 2012). 복숭아는 전형적인 호흡급등형 과실로 성숙 과정에서 에틸렌이 발생하여 성숙과 관련된 생화학적 변 화를 유발하는데, 본 연구에서도 기존에 보고된다른 연구결 과와 마찬가지로 ‘금홍’과 ‘마도카’ 복숭아 품종에서 칼슘 처리에 의해 PL, PG, PME 유전자의 발현이 억제되는 경향을 나타내었다. 이에 본 연구와 다른 연구 결과를 종합해 보면 수확 전이나 수확 후의 칼슘과 키토산 등의 처리는 과실의 연화와 관련된 유전자의 발현을 억제하며 이는 성숙기에 복숭아 과실의 연화를 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

본 연구에서는 ‘금홍’과 ‘마도카’ 과실에 수확 전과 후에 칼슘과 키토산을 단용 및 혼용 처리하고 세포벽 분해와 관련된 유전자들의 발현 양상을 분석하여 칼슘과 키토산 처리에 의해 과실의 연화와 관련된 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 복숭아 과실에 처리한 칼슘과 키토산은 과실의 연화에 관여하는 유전자의 발현을 억제하여 과실의 연화를 촉진하는 효소활성을 낮춤으로써 세포벽의 붕괴와 펙틴화합물의 분해를 억제하고 과실의 연화를 억제하는 것으로 생각된다.

이러한 연구 결과는 재배적 수단에 의해 보구력과 저장성을 증진시킬 수 있는 기술 개발에 중요한 정보로 활용될 수 있을 것으로 생각되며, 경도의 저하를 지연시키고 유통기간을 연장하는 데에 기여할 것으로 여겨진다. 또한 국내 시장에서의 복숭아 소비 확대는 물론 해외로의 복숭아 과실의 수출 확대도 촉진하여 국내의 복숭아 산업발전에 기여할 것으로 기대된다.

적 요

본 연구에서는 칼슘(구연산칼슘, 염화칼슘, 질산칼슘, GHCa, OS-Ca)과 키토산의 단용 및 혼용 처리에 의한 ‘금홍’과 ‘마도카’ 복숭아 과실의 보구력에 대한 효과를 확인하고자 세포벽 연화에 관련된 유전자들의 발현을 확인하였다.