11.곤충병원성.pdf682.1KB

 최근 농가기술 개발 및 보급으로 시설 재배 생산에 따른 해충 발생이 우려되고 있다. 그 중 진딧물은 농작물에 큰 피해를 주는 전형적인 해충으로 작물재배 기간 중 단위생식으로 번식하고 세대기간이 짧아 밀도 증가가 매우 빠르며 식물의 바이러스를 매개하는 등 저항성 발현이 빠른 특징을 가지고 있다(Kim et al., 2011; Jung et al., 2006). 최근까지 해충 방제는 주로 화학적 방제기술이 다른 기술에 비해 경제적이라는 이유로 전 세계적으로 사용되고 있으나, 여러 가지 환경문제를 유발하고 있다(Kim et al., 1996).

 경제가 성장함에 따라 천연가치자원이 부각되어 생리활성 물질 기능성에 대한 관심이 증가하고 있으며 특히, 항산화 활성에 관한 연구가 활발히 진행 중이다(Konyahoglu et al., 2005; Lee & Park., 2006; Jang et al., 2008).

 천연가치자원 중 동충하초를 포함하는 곤충 병원성 균주(Enthomopathogenic fungi)는 기주인 곤충의 외피에 곰팡이의 분생포자가 부착되어 발아한 후 외피를 관통하여 곤충의 내부에서 증식하여 곤충(기주)을 죽이는 균을 말한다(Shan and Pell, 2003). 곤충 병원성 균주를 이용한 친환경 방제 기술이 개발 되어 생물학적 방제 기술로서 자연생태계에서 해충의 밀도를 자연적으로 감소시키는 역할을 하며 현재까지 100여 속 800여 종으로 알려져 있다(Jung et al., 2006; Song et al., 1993; Roberts, 1989; Hajek and Leger, 1994). 그 중 완전 세대를 형성하며 자낭균문(Aascomycota)에 속하는 진균으로는 Cordyceps속, Shimizuomyces속, Torrubiella속 등 3속이 알려져 있고 불완전균문(Deuteromycota)에 속하는 곤충병원성 균주는 백강균(Beauveria bassiana), 적강균(Isaira fumosorosea)으로 알려져 있다(Kobayasi, 1982; Nam et al., 1999).

 이 중 백강균(Beauveria bassiana)은 곤충에 굳음병을 일으키는 균으로 곤충표피를 통하여 내부로 침입하여 곤충의 면역작용을 차단하거나 독성물질을 분비하여 기주를 치사시킨다(Jung et al., 2005; Biodochka & Khachatourians 1991; Pendland et al., 1993). 그리고 수분, 온도 등 외부조건들이 갖춰지게 되면 곤충의 큐티클 층을 다시 뚫고 밖으로 나와 분생포자를 생산하여 바람이나 물 등의 주변 환경을 이용하여 부근의 다른 곤충을 감염시키게 된다(Lee and Park, 2006).

 곤충 병원성 균주는 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있기 때문에 최근에는 신기능성 생물소재나 생리활성물질을 개발하기 위한 연구를 한 바 있으며 의약품 및 생물 농약의 생산에 큰 역할로 기여할 것이다(Jung et al., 2005; Roberts, 1989; Kwon et al., 2000).

 따라서 본 연구는 곤충 병원성 균주(Entomopathogenic fungi) Beauveria bassiana 배양액의 천연 생리활성 물질로서 이용 가능성을 알아보고 각각의 균주 배양액에 대한 성분 분석과 항산화, 항염, 항암의 효능을 밝혀 신기능성 물질 개발 및 약리효과에 대한 기초자료로 사용하고자 수행되었다.

재료 및 방법

공시재료

 본 공시균주는 농촌진흥청으로부터 곤충병원성 진균(Entomopathogenic fungi) Beauveria bassiana을 분양받아 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 3일, 5일, 10일, 15일별로 진탕배양 (25℃, 200rpm)한 배양액을 사용하였다.

실험방법

이화학적 특성

· 유리당 분석

 시료의 유리당은 high performance liquid chromatography(HPLC)를 이용하여 측정하였으며, 유리당 분석 조건은 Table 1과 같다.

Table 1. Operating condition for analysis of free sugar composition by HPLC.

· 유기산 분석

시료의 유기산 분석은 HPLC를 이용하여 측정하였으며, 분석조건은 Table 2와 같다. 

Table 2. Operating condition for analysis for organic acid composition by HPLC.

· 아미노산 분석

 HPLC Agilent 1200LC를 이용하여 아미노산을 분석하였다. FL Detector는 Emission 450 nm, Excitation 340 nm (OPA), Emission 305 nm, Excitation 266 nm (FMOC)로 UV Detector는 338 nm를 이용하였다. 아미노산 표준용액은 Amino acids 17종을 사용하였다. Column은 C18 colum (4.6mm× 150 mm, 5 um), 이동상으로 Mobile phase A는 20mM Sodium phosphate monobasic, pH 7.8, Mobile phase B는 3DW/ Acetonitrile / Methanol (10 : 45 : 45 v/v%)조건으로 분석하였다. 사용한 반응시약은 A : Borate buffer (agilent 5061-3339), B : OPA reagent (agilent 5061-3335), C : FMOC solution (agilent 5061-3337)으로 아미노산을 분석하였다.

· 무기성분

 무기성분 중 음이온은 IonPac AS20 Anion-Exchange Column, 양이온은 IonPac CS12A를 참조하여 정량하였고 그 외의 실험 조건은 Table 3과 같다.

Table 3. Operating condition of inductively coupled plasma for analysis of minerals.

항산화활성 검정

· Total Polyphenol 함량 측정

 시료 추출액의 총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdate와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 Folin-Denis법으로 측정하였다(Shen et al., 2009). 96 well plate에 시료추출액 50 μl와 1 M Folin-ciocalteau phenol reagent(Sigma Co. USA) 50 μl을 넣고 6분간 반응시킨 후, 2% Na₂CO₃(Sigma Co. USA) 포화용액 100 μl을 넣고 30분간 반응시키고 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 총 폴리페놀 함량은 Gallic acid(Sigma Co. USA)를 이용하여 작성한 표준검량곡선으로부터 함량을 구하였다.

· Total Flavonoid 함량 측정

 시료추출액의 총 플라보노이드 함량 측정은 96 well plate에 시료추출액 20 μl, 1차 증류수 100 μl, 5% NaCO₂(Sigma Co. USA) 용액 10 μl의 순으로 넣고 6분간 반응 시켜주었다. 반응 후 10% AlCl₃6H₂O(Sigma Co. USA) 용액 20 μl를 넣고 5분간 반응시켜주었다. 마지막으로 1M NaOH(Sigma Co. USA) 40 μl를 넣고 15분 반응 시켜준 후 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 화합물은 Catechin(Sigma Co. USA)을 이용하여 작성한 표준검량곡선으로부터 함량을 구하였다.

· DPPH radical 소거능

 시료 추출액의 항산화 활성은 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)의 발색정도로 측정하였다(Choi et al., 1993). 지질과 산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 free radical을 소거함으로써 항산화제로 작용하는 물질은 free radical인 DPPH를 hydrazine 형태로 환원시키는 능력을 조사하여 검색하였다. DPPH는 비교적 안정한 radical로 보라색을 띠는데, 항산화 활성을 갖는 성분을 만나면 색이 소실된다. 0.5 mg/ml 농도의 약물을 96 well plate의 각 well에 100 μl씩 분주하고, 다시 여기에 150 μm DPPH(59.145 mg·μl^-1 in MeOH)(Sigma Co. USA)용액 150 μl를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 30분간 반응 시키고 518nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Ascorbic acid (Sigma Co. USA)를 사용하였다.

· SOD 활성 검정

 시료 추출액의 SOD 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Rockvile, USA)를 사용하였다. 96 well plate를 이용하여 각각의 시료 20 μl씩 분주한 후 WST working solution, Dilution buffer, Enzyme working solution를 넣고 37℃에서 20분간 incubation한 후 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Ascorbic acid(Sigma Co. USA)를 사용하였다.

· ABTS free radical 소거능

 시료 추출액의 ABTS 활성은 TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity) 분석법으로 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothizoline-6-sulphonate)(ABTS+)의 색을 띤 양이온 라디칼의 감소에 근거하였다(Re et al., 1999). 7.4 mM의 ABTS시약과 2.6 mM PBS(phosphate buffered saline)를 증류수에 녹인 용액의 흡광도가 0.8이 되도록 희석한 후, 시료 추출액과 ABTS시약을 혼합한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

항암활성검정

· Cell Cytotoxicity 검정

 곤충 병원성 균주 배양액이 암세포성장의 억제효과가 있는지의 여부를 확인하기 위해 세포들을 96 well plate에 10⁴~10⁵cells/well 의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO₂가 공급되는 항온 세포 배양기에서 8시간 이상 배양하였다. 균주 배양액을 세포배양액 200 μl에 각각 250 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml 씩을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포의 독성은 Cell Counting Kit-8TM(CCK-8, Donjindo, Janpan)시약을 이용하여 분석하였다. 각 배양액에 CCK-8 용액 10 μl씩을 넣은 후 1~4시간 반응하고, 수용액에 녹아있는 tetrazolium salt(WST-8,[2-(2[methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt])의 양을 microplate reader기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Doxorubicin(Sigma Co. USA)을 사용하였다.

통계분석

 실험결과는 SAS(Satistic Analysis System)을 이용하여 통계처리 하였으며, Mean±S.D를 구하였다. 실험군 간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 Duncan’s multiple range test로 변이간의 차이를 검증하였다.

결과 및 고찰

이화학적 특성

유리당 함량

 유리당을 HPLC에 의해 분리 정량하여 얻은 결과는 Table 4과 같다. B. bassiana 균주 배양액의 유리당 분석 결과는 Glucose > Maltose > Fructose 순으로 나타났다. Glucose 함량은 배양 기간이 길어질수록 15.2 g·L^-1(3일) 7.0 g·L^-1(15일)로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, Maltose는 배양 3일에서 10일로 기간이 길어질수록 0.2 g·L^-1 0.8 g·L^-1로 함량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. Fructose 함량은 배양 3일시 0.3 g·L^-1, 배양 5일 시 0.1 g·L^-1으로 감소하였으나 10일, 15일에는 검출되지 않았다.

Table 4. Free sugar composition at culture medium of Beauveria bassiana.

 본 실험 결과 Glucose 함량이 배양기간이 길어질수록 감소하는 것을 확인 할 수 있었고, Glucose가 균주 배양액의 주요 유리당 성분인 것으로 생각되며 Fructose 함량은 다른 성분보다 낮거나 검량되지 않았다. 또한 같은 균주의 배양액이라도 배양기간에 따라 유리당 성분의 함량 차이가 있다는 것을 알 수 있었다.

유기산 분석

 유기산은 Citric acid, Malic acid, Formic acid, Lactic acid, Acetic acid, Succinic acid로 총 6종류가 동정되었으며 B. bassiana 균주 배양액은 3일 배양 시 Citric acid (276.4mg·L^-1) > Malic acid (27.4mg·L^-1) > Formic acid (15.4mg·L^-1) > Lactic acid (9.9mg·L^-1) > Acetic acid (4.4mg·L^-1) > Succinic acid (0.7 mg·L^-1)순으로 나타났으며, Critic acid 함량은 배양기간이 길어질수록 276.1 mg·L^-1(3일) 9.5 mg·L^-1(15일)으로 감소하였고 Table 5에서 보는 바와 같이 15일 배양액의 경우 Citric acid 함량이 급격히 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. Citric acid 외의 측정된 유기산 성분들은 배양 기간에 관계없이 함량이 측정되었다.

Table 5. Organic acid at culture medium of Beuveria bassiana.

아미노산 조성

 Beauveria bassiana 균주 배양액의 아미노산을 HPLC에 의해 분리 정량하여 얻은 값을 Table 6에 나타내었다. B. bassiana 균주 배양액의 아미노산 함량 결과, Glutamate를 포함한 총 16종으로 나타났다. 아미노산 함량의 상위 추출 성분은 Glutamate (987.0 pmo·μl^-1), Alanine (252.2 pmo·μl^-1), Isoleucine(237.6 pmo·μl^-1), Tyrosine (201.4 pmo·μl^-1)으로 분석되었다.

Table 6. Amino acid composition of culture medium in Beauveria bassiana.

 Glutamate 성분은 배양 3일 시 987.0 pmo·μl^-1으로 가장 많이 함유되어 있었으며 5일 배양 시 10.3 pmo·μl^-1, 10일 시 5.5 pmo·μl^-1으로 배양기간이 길어질수록 함량이 감소하는 것을 확인 할 수 있었나 Glutamate를 제외한 아미노산 15종은 배양 3일에만 함유되어 있었으며 5일, 10일, 15일에는 검출되지 않았다. 아미노산 중 Glutamine과 Proline함량이 각각 10.5 pmo·μl^-1, 10.9 pmo·μl^-1으로 가장 낮게 검출되었다.

 Jung et. al (2005)은 B. bassiana에 감염된 백강잠(B. corpus)에서 분석된 17종의 아미노산 중 Alanine 성분이 높은 경향을 나타내어 본 실험 결과와 유사하게 나왔다.

무기성분

 곤충 병원성 균주 B. bassiana 3일 배양액에서는 K(94.8mg·L^-1), Mg (1.6mg·L^-1), Ca(5.2mg·L^-1), Cl (61.2mg·L^-1), SO₄ (11.5 mg·L^-1), NO₃(2.8 mg·L^-1), PO₄ (49.4 mgL^-1)이 다량 함유되어 있었고, Na (179.4 mgL^-1), F (16.9 mgL^-1)은 배양 15일 시에 많은 양이 함유되어 있었다. 무기성분 분석 결과 Na이 다량 함유되어 있었으며 NO₃ 함량이 극소량 함유되어 있는 것을 확인 할 수 있었다.

Table 7. Contents of mineral in Beauveria bassiana.

항산화활성 검정

총 폴리페놀 함량

 Beauveria bassiana 배양 기간별 총 폴리페놀(ppm/DW) 함량이 높은 경향이 있는 상위 추출물은 B. bassiana 15일 배양액(6.51 ± 0.04 ppm GAE/DW)이었다(Table 8).

Table 8. Total polyphenol contents from Beauveria bassiana by cultural periods.

 또한 B. bassiana 배양액은 배양기간이 길어지더라도 총 폴리페놀 함량에 대해서는 차이가 없었다. Lee et. al. (2009)이 Cordyceps militaris의 균사체와 배양액의 총 페놀 함량은 각각 41.24 μg·g^-1, 67.24 μg·g^-1이였고 Paecilomyces tenuipes의 균사체 함량은 24.74 μg·g^-1, 배양액 함량은 26.86 μg·g^-1으로 나타나 균사체에서 보다는 배양액의 총 페놀 함량이 높다고 보고한 바와 같이 배양액의 온도, 시간, 기간 등을 다양화하여 최적의 폴리페놀 추출 조건을 확립할 필요가 있다고 사료된다.

총 플라보노이드 함량

 총 플라보노이드(ppm/ DW) 함량 분석 결과는 Table 9과 같이 B. bassiana 15일 배양액(1.19 ± 0.06 ppm CE/DW)의 함량이 높은 상위 추출물에 해당되었다.

Table 9. Comparison of total flavonoid contents from Beauveria bassiana.

 B. bassiana 3일 배양액(1.09 ± 0.06 ppm CE/DW), 15일 배양액(1.10 ± 0.06 ppm CE/DW)함량이 높게 나왔으며 그 이외의 배양기간에 따른 플라보노이드 함량은 차이가 없었다.

DPPH free radical 소거능

 곤충 병원성 균주 3종의 배양액 DPPH free radical 소거능을 측정하여 IC₅₀값을 구하였다(Fig. 1). 통계적으로 B. bassiana 균주 배양액은 배양 15일(263.4 ± 13.3 μg·ml^-1) > 10일(295.8 ± 6.8 μg·ml^-1) > 5일(359.3 ± 18.1 μg·ml^-1) > 3일 (461.9 ± 23.9 μg·ml−^-1)순으로 배양기간이 길어질수록 높은 활성을 보였다. B. bassiana 균주 배양액의 활성은 합성 항산화제인 Ascorbic acid의 IC₅₀값인 63.6 ± 3.0 μg·ml^-1을 기준으로 상위 그룹을 확인하였으나 다른 작물의 DPPH 항산화 활성결과와 비교 시 높은 활성을 확인 할 수 없었다. 그러나 Lee et al. (2009)이 B. bassiana 균주를 포함한 곤충 병원성 균주 20종의 DPPH 항산화 활성 결과 모두 21.8% 이상의 항산화활성을 나타내는 보고와 같이 곤충 병원성 균주의 천연 항산화제로서의 역할을 기대할 수 있으며 이에 대한 구체적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 1. Distribution of DPPH free radical from Beauveria bassiana.

SOD 유사 활성 검정

 곤충 병원성 균주 배양액이 SOD와 유사활성을 나타내는지 알아보기 위해 IC₅₀값으로 확인한 결과 Fig. 2와 같이 B. bassiana 균주 배양액은 배양 15일(93.7 ± 16.6 μg·ml^-1) > 10일(96.5 ± 10.5 μg·ml^-1) > 5일(98.8 ± 12.0 μg·ml^-1) > 3일(99.8 ± 3.8 μg·ml^-1)순으로 배양기간이 길어질수록 SOD 활성이 높아졌으며 DPPH와 항산화 활성 경향이 동일한 것을 확인 할 수 있었다. 또한 SOD 실험 결과 B. bassiana 균주 배양액의 활성이 대조구인 Ascorbic acid (54.2 ± 3.5 μg·ml^-1)보다는 높은 활성을 확인할 수 없었으나, 천연항산화제 및 생리활성을 기대해 볼 수 있다.

Fig. 2. Distribution of SOD activities from Beauveria bassiana.

ABTS free radical 소거능

 ABTS 소거능을 통하여 곤충 병원성 균주의 배양 기간별 항산화 활성을 재검증하였다. 곤충 병원성 균주 배양액의 ABTS free radical 소거능을 측정하여 IC50값을 구하였다(Fig. 3). B. bassiana 균주 배양액의 활성은 99.7 ± 1.2 156.9 ± 2.9 μg·ml^-1범위로 배양 3일 시 107.9 ± 1.4 μg·ml^-1에서 배양 5일 시 99.7 ± 1.2 μg·ml^-1이 되었을 때, ABTS 활성이 높아졌으나 10일, 15일로 배양기간이 길어질수록 각각 156.8 ± 2.9 μg·ml^-1, 139.4 ± 1.6 μg·ml^-1로 활성이 다시 낮아지는 것을 알 수 있었다.

Fig. 3. Distribution of ABTS free radical from Beauveria bassiana.

항암활성 검정

 곤충 병원성 균주 Beauveria bassiana 배양액을 암세포에 적용하여 항암효과가 있는 시료를 스크리닝 하였다

 통계적으로 인간 폐암세포인 A549 celll lines에 대하여 곤충 병원성 균주 배양액의 항암활성을 검정한 결과, B. bassiana 5일 배양액(163.8 ± 4.1 μg·ml−^-1)이 높은 항암 활성을 나타냈다. 인간 간암세포인 HepG2 cell lines에 대하여 항암활성을 검정한 결과, B. bassiana 10일 배양액(127.8 ± 2.3 μg·ml−^-1)이 높은 항암 활성을 나타냈다. 인간 유방암세포인 MCF-7 cell lines에 검정한 결과, B. bassiana 5일 배양액(129.1 ± 6.8 μg·ml−^-1)으로 가장 높은 활성을 나타났다.

 세포내에서 낮은 농도의 산화 스트레스는 세포의 성장과 생존에 관여하는 정도의 역할을 하지만 높은 농도는 세포의 성장을 억제할 뿐 아니라 독성으로 작용하여 세포의 생존에 큰 영향을 준다. 이는 암세포에서의 항산화 효소(antioxidant enzyme)의 level이 정상세포의 비해 현저히 낮게 나타나는 것으로 알 수 있는데 이는 항산화 효소가 암세포를 치료하는데 중요한 요소라는 것을 알 수 있다(Huang et al., 2000; Fang et al., 2003a; Fang et al., 2003b).

 본 연구 결과 A549, HepG2, MCF-7 cell lines에서 높은 항암활성을 보인 곤충 병원성 균주 배양액은 표 8에서 보는바와 같이 HepG2 cell lines에서는 B. bassiana 10일 배양액, MCF-7, A549 cell lines에는 B. bassiana 5일 배양액의 활성이 높게 나타났으나 대조구인 doxorubicin보다 낮은 활성이 나타났다.