최근
세계적으로 건강에 대한 관심이 높아지고, 고령화에 따 른 노화 억제와 질병치료에 영향을 미치는 기능성 물질에 대 한 관심이 증가되고 있다. 따라서, 세계 인구의 40% 이상이 주식으로 이용하는 쌀에서 약리 효능이 있는 기능성 물질이 생 합성 된다면 보다 많은 사람들이 혜택을 받게 될 것이다.
항산화 기능성 물질의 하나인 레스베라트롤(Resveratrol)은 금 속이온, 곰팡이, 노균병 등과 같은 비생물학적 혹은 생물학적 스트레스에 반응하여 식물체가 자체적으로 생산하는 파이토알 렉신(phytoalexin)으로서 폴리페놀계 물질이다(Adrian et al., 1996). 레스베라트롤은 자연계에 trans 및 cis 형태로 존재하며, 생리적 활성형은 trans-resveratrol이고 UV에 의해 cis-resveratrol로 전환되며, 대부분의 식물에서는 레스베라트롤과 피세 이드(piceid) 형태로 존재한다(Adrian et al., 1996; Jeandet et al., 1995; Langcake et al., 1979). 레스베라트롤은 퀘세틴 (quercetin)과의 길항작용에 의한 항산화 효과(Mikstacka et al., 2010), 수명 연장 효과(Guarente & Picard, 2005), 항암(Le Corre et al., 2004), 항염증(Hur et al., 2001; Leiro et al., 2004) 등 다양한 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이 러한 여러 가지 생리활성 기능이 있는 레스베라트롤 유전자를 작물에 도입하려는 형질전환 연구들이 진행 되었으며, 그 중 담배(Fischer et al., 1997), 토마토(Morelli et al., 2006), 상추 (Liu et al., 2006) 등에서 레스베라트롤이 확인 되었다. 벼를 포함한 대부분의 작물에는 레스베라트롤 합성 유전자(resveratrol synthase)를 보유하고 있지 않기 때문에 레스베라트롤이 합성되 지 않으며, 땅콩, 백합 등의 초본류에서는 UV, 병원균, 상처 등의 외부자극에 의하여 유도되며 대부분의 목본류에서는 상 시 발현된다.
최근 땅콩의 레스베라트롤 합성 유전자를 이용하여 세계 최 초로 레스베라트롤이 생합성 되는 벼 ‘익산 526호’가 개발 되 었으며(Baek et al., 2009; Baek et al., 2011), 레스베라트롤 생합성 벼(현미, 백미)는 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증 등과 같은 대사성 증후군의 예방 및 치료 효과가 있음을 보고하였다 (Baek et al., 2013; Baek et al., 2014). 따라서, 천연화합물인 레스베라트롤 생합성 벼를 이용한 상품 개발을 위해서는 우리 가 섭취하고 있는 쌀에서의 레스베라트롤 함량이 높을수록 기 능성 벼 품종으로 활용 가치가 크다고 할 수 있겠다.
식물의 종자는 알맞은 물, 산소, 온도가 주어지면 발아하며, 발아가 진행됨에 따라 생리활성이 증가되고 성분변화가 일어 나기 때문에 발아에 의한 영양소 이용성을 극대화 시키려는 연구가 많이 이뤄지고 있다. 최근 벼 종자 발아 시 품종의 종 류와 발아기간에 따라 항산화 활성과 항암 효능이 변화한다는 연구결과가 보고되었다(Kim et al., 2011; Kim et al., 2012). 또한, 땅콩(Wang et al., 2005), 대두(Kim et al., 2004), 메 밀(Kim et al., 2004), 보리(Sharma & Gujral, 2010), 및 퀴 노아(Qinoa)(Carciochi et al., 2014) 등 두류 및 곡물 종자 발아 처리에 따라 총 폴리페놀의 함량과 항산화 활성이 증가 된 연구결과가 보고되어 작물 종자의 기능성 물질 함량을 향 상시키기 위하여 발아단계에서 많은 처리가 적용되고 있다.
본 논문은 대사성 증후군 관련 약리적 효능이 보고된 익산 526 벼 종자의 발아처리를 통하여 레스베라트롤 함량을 증가 시켜, 기능성 건강식품, 의료용, 화장품용 등 산업화 소재로 이 용 범위를 확대하기 위하여 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
재료 준비
농촌진흥청 국립식량과학원 벼맥류부의 GMO 시험포장에서 재배된 익산 526과 동진벼를 현미로 도정하여 4℃에 보관하 였다. 발아는 페트리디쉬에 Whatman paper를 깔고, 식물생육 상(Dasol science co., LTD, Korea)을 이용하여 25°C와 30°C 조건에서 1, 3, 및 5일간 암상태에서 발아시켰다. RS (resveratrol synthase) 유전자 발현 분석을 위한 시료는 액체질 소를 이용하여 발아 현미를 마쇄 후 −80°C에 보관하였다. trans-resveratrol과 piceid 함량 분석을 위한 시료는 3일간 동 결건조 시킨 후 마쇄하였다.
액체크로마토그래피 (UPLC)를 이용한 resveratol 및 piceid 함량 분석
익산 526 발아현미 분말 300 mg을 2 ml 튜브에 넣고, 80% 메탄올 900 μl을 첨가 후 20분간 초음파 처리 한 후, 4°C 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상징액을 0.2 μm membrane filter (Genie2, Korea)로 여과하여 UPLC 분석을 수행하였다. UPLC 분석은 ACQUITY Ultra Performance LC (Waters, US)와 ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼(1.7 μm, 2.1 × 100 mm, Waters, US)을 이용하였다. 이동상 용매는 물 (A)과 acetonitrile (B)을 사용하였으며, 용매 구배 조건은 Table 1과 같다. 함량분석을 위해 추출액 1 μl를 주입 후 0.4 ml/ min 유속으로 UV 308 nm 파장에서 측정하여 레스베라트롤 함 량을 정량하였다.
Real–time PCR을 이용한 RS 유전자 발현 분석
RS 유전자 발현 분석을 위해서 Lee et al. (2008) 방법을 변형하여 익산 526 발아 현미에서 total RNA를 추출한 후 iScriptTM cDNA kit (Bio-rad, USA)를 이용하여 cDNA를 합 성 하였다. 합성한 cDNA와 iQTMSYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)와 특이 프라이머 (RSF: 5‘-GGACGTGCAA TTTTGGACCA-3’, RSR: 5‘-CCTTCTCCGGTGGTTTTGAGTC-3’) 를 혼합한 후 CFX96 Real-time PCR System (Bio-rad, USA)을 이용하여 95°C에서 3분을 반응시킨 후, 95°C에서 20 초, 61°C에서 15초, 72°C에서 20초간 40회 반복하고, 매회 신장 단계에서 SYBR/FAM channel로 형광량을 측정하였다. 측정된 형광량을 이용한 유전자 발현량 분석은 Actin mRNA 발현량을 이용하여 RS mRNA 발현량에 대한 상대적인 양을 조사하였다.
항산화 활성 분석
익산 526 현미의 발아기간에 따른 항산화 활성은 Jang et al. (2011) 방법에 따라 DPPH-라디칼 소거능을 측정하였다. 현미 추출은 1 g의 분말을 15ml 튜브에 넣고, 80% 메탄올 3ml을 첨가 후 20분간 초음파 처리 한 후, 4°C 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상징액을 0.2 μm membrane filter (Genie2, Korea)로 여과 하였다. 항산화 활성 측정은 이 추출 액과 0.2 mM DPPH 메탄올 용액을 1:1 섞은 후, 상온의 암 조건에서 30분간 반응 시켜, 분광 광도계를 이용하여 517 nm 에서 측정하였으며(Ultrospec 3300 pro, Amersham, USA), 계산식은 [1 − (실험구의 흡광도 / 대조구의 흡광도)] × 100을 이용하였다.
결과 및 고찰
익산 526 현미의 발아 온도와 일수에 따른 trans-resveratrol 및 piceid 함량 변화
익산 526 현미의 trans-resveratrol 및 piceid 함량을 증진하 는 최적의 발아 조건확립을 위해 Park & Lee (2010)의 결과 를 바탕으로 연구를 수행하였다. 익산 526과 동진벼 현미를 25°C와 30°C 암 조건에서 0, 1, 3, 및 5일간 발아시킨 결과, 2 개의 처리구 모두 발아 1일째 싹이 트고, 발아 3일째부터 초엽이 출현하여 정상적으로 생육하였다(Fig. 1). 25°C에서 0, 1, 3, 및 5일간 발아처리 했을 때, 익산 526은 동진벼에 존재 하지 않는 trans-resveratrol 함량이 각각 2.1, 2.3, 2.8, 3.6 μg/g 이였고, piceid 함량은 4.8, 4.3, 5.2, 16.6 μg/g였다(Figs. 2A, 2B). 30°C 조건에서는 trans-resveratrol 함량이 2.0, 2.5, 3.4, 4.1 μg/g 였으며, piceid 함량은 4.8, 4.3, 10.2, 27.7 μg/g 였 다(Figs. 2A, 2B). 두 조건에서 발아처리 일수의 증가에 따라 레스베라트롤 함량이 증가하였고, 두 조건 모두 발아 5일째 trans-resveratrol과 piceid 함량이 가장 높았다. 25°C와 30°C 에서 발아 1일째 trans-resveratrol과 piceid 함량의 증가 차이 는 거의 없었으나, 30°C 조건에서 발아 3일째와 5일째 trans-resveratrol과 piceid 함량은 25°C 발아조건과 비교하여 trans-resveratrol은 20% 이상, piceid는 70% 이상 증가하였다. 30°C에서 발아처리 일수에 따라 trans-resveratrol은 최고 2.1 배, piceid 함량은 최고 5.8배까지 증가하였으며, 특히 piceid 함량은 급격하게 증가하였다. Baek et al. (2013)은 익산 526 에서 당전이 효소의 활성에 의해 trans-resveratrol은 잎보다는 상대적으로 종자에 많고, piceid는 광합성 기관인 잎에 많이 존재한다고 보고하였는데, Fig. 1과 같이 30°C 조건에서 발아 5일째에 초엽의 더 활발한 신장이 높은 함량의 piceid가 축적 되는 비슷한 결과를 나타내었다. 또한, Wang et al. (2005)과 Kang et al. (2010)은 3, 6, 및 9일간 발아 처리한 땅콩의 레 스베라트롤 함량이 발아 일수에 따라 증가하고, 9일간 발아 처 리 땅콩 자엽에서 레스베라트롤 함량이 가장 높았다고 보고 하였다. 이상의 결과에서 익산 526 벼 종자의 발아 처리시 발아 일수 경과와 레스베라트롤 함량의 증가는 관련이 있으 며, 익산 526의 trans-resveratrol과 piceid 함량 증진을 위 한 최적의 조건은 30°C 조건에서 5일간 발아처리임을 확인 하였다.
익산 526 현미의 발아 온도와 일수에 따른 RS 유전자 발현량 변화
발아처리 후 익산 526 현미의 레스베라트롤 함량 변화와 RS 유전자 발현량 차이가 상호 연관이 있는지 확인하였다. 25°C와 30°C에서 발아된 익산 526 현미의 RS 유전자는 발아 일수가 증가할수록 RS 유전자의 발현수준도 동시에 증가하였 다. 두 조건에서 RS 유전자의 발현량은 5일째 가장 높게 나 타났으며, 25°C에서 최고 2.5배, 30°C에서 최고 14배까지 증 가하였고, 특히 30°C에서 발아시간이 경과할수록 RS 유전자 발현량은 급격하게 증가하였다(Fig. 3). 이것은 땅콩나물과 땅 콩의 레스베라트롤 함량이 UV, 상처, 제초제, 에틸렌, 초음파, 및 yeast 처리 등과 같은 외부자극에 의해 RS 유전자의 발현 이 증가함과 동시에 레스베라트롤 함량도 증가했다는 연구 결 과(Chung et al., 2001, Chung et al., 2003, Mohidul Hansan et al., 2013)와 상시 발현하는 35s promoter에 의해 조절되는 AhRS3 유전자 도입 형질전환 지황에서 저온, UV, 에틸렌, 및 제초제 처리에서 RS 유전자의 발현량과 레스베라트롤 함량이 동시에 증가했다는 Lim et al. (2005)의 결과와 유사하다. 또 한, 상시 발현하는 ubiquitin에 의해서 조절되는 PR10 (Kim et al., 2010)과 CBF4 (Joung et al., 2014) 유전자 도입 내 염성 형질전환 벼에서 고농도의 염 스트레스 조건에서 유전자 의 발현량이 증가하였다는 결과와도 유사하다. 이상의 결과를 종합하면, 상시 발현 ubiquitin 프로모터에 의해 조절되는 RS 유전자가 도입된 익산 526 벼 종자는 발아 처리라는 외부 환 경변화에 의해 RS 유전자의 발현량이 증가하였고, 그 결과 레 스베라트롤 함량이 증가하였다. 따라서, 발아 처리 후 익산 526 벼 종자에서 발아 처리시 발아 일수 경과는 레스베라트롤 함량의 증가와 관계가 있음을 의미한다.
익산 526의 발아처리에 의한 항산화 활성 변화
익산 526에 존재하는 레스베라트롤은 높은 항산화 활성을 갖는 물질이다. 따라서, 발아 후 증가한 레스베라트롤이 항산 화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 DPPH-라디칼 소거 능을 분석하였다. DPPH는 화학적으로 안정성을 가지는 자유 라디칼을 가지고 있으며, 항산화 활성을 확인하는데 사용되는 물질 중 하나이다. 보라색을 띠는 DPPH-라디칼이 항산화 물 질과 반응하면 옅은 노란색으로 변색하는 원리를 이용하여 DPPH-라디칼 소거능이 측정된다. 항산화 활성 분석을 위한 시 료 농도는 발아처리 전 동진벼와 익산 526 현미 추출물을 80% 메탄올로 1 : 50, 1 : 10, 1 : 5, 그리고 1 : 2로 희석하여 분석한 결과, 59.0%와 63.2% 항산화 활성을 나타내는 1 : 10 희석비율을 최적의 시료 농도로 결정하였다(Fig. 4A). 동진벼 와 익산 526 현미는 1:2로 희석한 농도에서 88.9%와 92.7% 로 positive control로 사용한 10 μg/mL의 ascorbic acid (92%)와 비슷한 항산화 활성을 나타내었다(Fig. 4A). 25°C에서 0, 1, 3, 및 5일간 발아처리 했을 때, 동진 현미의 항산화 활성은 각 각 59.0%, 53.7%, 58.1%, 61.6%였고, 익산 526 현미는 각 각 63.2%, 58.3%. 59.6%, 64.0%를 나타냈다. 30°C 조건에 서는 동진 현미의 항산화 활성 59.0%, 54.6%, 60.0%, 70.4% 였고, 익산 526 현미는 63.2%, 60.1%, 62.6%, 69.5% 나타냈 다. 결과적으로 30°C에서 발아 5일째에서만 동진벼와 익산 526 의 항산화 활성이 약 10%와 6% 증가하였는데(Figs. 4B, 4C), 이는 발아 후 큰눈벼, 하이아미, 홍진주(Kim et al., 2011) 및 퀴노아(Carciochi et al., 2014)의 항산화 활성이 약 5-10% 증가하였고, 일품벼(Kim et al., 2012)는 약 5% 증가했다는 연구결과와 유사하다. 반면 고아미벼는 항산화 활성이 발아 전 후 변화가 없었으며, 흑광과 화성벼는 약 5-10% 감소하였다 고 보고하였다(Kim et al., 2011). 이상의 결과를 종합하면 벼 종자는 품종에 따라 발아 전후 항산화 활성이 변화하며, 항산 화 활성의 증가와 감소는 발아 전과 비교하여 5-10% 수준이 였다. 따라서, 동진벼와 익산 526은 다른 품종에서 증가된 항 산화 활성 수준과 비슷하였고, 발아처리 후 익산 526의 레스 베라트롤 함량 증가는 항산화 활성에는 큰 영향을 미치지 않 았다.
본 연구결과는 비용이 적게들고 처리가 단순한 장점을 갖는 발아처리가 익산 526의 레스베라트롤(tasns-resveratrol 및 piceid) 함량을 증대 시키는데 매우 효과적이어서 익산 526을 이용한 기능성 식품, 화장품, 및 의약품 등 다양한 산업화 소 재로 이용 될 수 있을 것으로 평가된다.
적 요
산업적 가치가 있는 천연 레스베라트롤은 인체에 항산화 작 용, 심혈관질환 예방, 항염증 등의 효능이 있다. 레스베라트롤 생합성 벼(익산 526)를 이용하여 레스베라트롤 함량을 높이기 위해 현미의 발아온도(25°C, 30°C)와 처리일수(0, 1, 3 및 5 일)의 최적조건을 구명하고자 실험한 결과는 다음과 같다.
레스베라트롤 함량은 25°C와 30°C에서 발아 5일째 각각 1.7배와 2.1배로 가장 높게 나타났으며, piceid 함량은 3.5배와 1.4배 증가하였다. 25°C 발아조건과 비교하여 30°C에서 trans-resveratrol은 20% 이상, piceid는 70% 이상 증가하였다.
레스베라트롤 유전자 발현량도 25°C와 30°C에서 발아 5일 째 가장 높게 나타났으며, 30°C에서는 25°C와 비교하여 5.5배 증가하였다. 발아 전과 비교하여 25°C에서는 2.5배, 30°C에서 14배 증가하였다. 하지만, 익산 526의 레스베라트롤 함량 증가 는 항산화 활성에 큰 영향을 미치지 않았다.
따라서, 익산 526 현미를 이용하여 레스베라트롤 함량을 증 가시키기 위해서는 30°C에서 5일 동안 배양하는 것이 가장 효과적으로 향후 이를 산업적 소재로 이용 할 수 있는 기초자 료로 제공한다.
