오미자

(Schizandra chinensis Baillon)는 우리나라, 일본, 중 국 북부 등에 분포하는 낙엽성의 덩굴성 관목으로, 6~7월에 꽃 이 피고 과실은 8~9월에 붉게 성숙한다(Korea Medicinal Plant Association, 2001). 옛날부터 중국이나 일본에서 우리나 라 오미자를 제일로 여겨왔으며, 동의보감(東醫寶鑑)과 방약합 편(方藥合編)에 의하면 허로, 기침, 소갈에 효능이 있고, 폐, 신 장을 보호하는 기능이 있다고 하였다. 최근에는 건강한 식생활 에 대한 관심이 증가함에 따라 식품의 영양소 기능 이외에 생 리활성 기능이 추가되면서 오미자는 기능성 식품으로 인식되 어 재배면적도 증가하고 소비도 촉진되는 추세이다.

오미자의 영양학적으로 검토한 연구 결과를 보면, 과육에는 탄수화물이 많고 종자에는 조단백질과 조지방 함량이 높으며, 칼륨과 망간 함량이 높은 것으로 보고되어 있다(Lee et al., 1989). 이 외에도 오미자에는 schizandrins, gomisins 등의 리 그난과 triterpenoid, 지방산, 유기산 등이 함유되어 있는 것으 로 알려져 있다(Huang et al., 2008; Panossian & Wikman, 2008; Koo et al., 2011).

오미자의 기능성과 관련해서 많은 연구가 이루어지고 있는 데, 항산화능과 항유전독성 효과(Kim & Park, 2010), 인슐린 민감성 개선 효과(Kwon et al., 2011), 항염증 효과(Guo et al., 2008), 항균 효과(Lee et al., 2003) 등의 생리활성이 보고 되어 있다.

오미자는 주로 한약재로 건오미자나 생오미자 형태로 많이 이용되어 왔으나, 최근에는 다양한 가공식품 및 관련 제품이 생산되면서 청, 즙, 원액, 막걸리, 와인 등의 다양한 형태로 소 비되고 있다. 오미자를 가공 활용하는데 있어 기능성을 증진시 키기 위해서는 생리활성물질의 추출 수율을 증가시키기 위한 연구가 필요하다.

천연약재로부터 생리활성 물질을 추출하기 위해 다양한 추 출용매를 이용하고 있는데, 가장 일반적인 물 추출법은 다른 용매를 이용한 추출물과 추출수율 뿐 아니라 항산화활성 등 생리활성에 많은 차이가 있는 것으로 알려져 있으나(Sultana et al., 2009) 오미자의 추출용매별 효율이나 생리활성 간의 관 계를 검토한 연구보고는 비교적 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 오미자 추출물의 항산화, 항균, 항염 활성을 평가 하고 추출용매별 생리활성의 변화를 검토하고자 하였다.

재료 및 방법

시료의 추출

본 시험에 사용된 오미자 재료는 2009년 문경에서 생산된 것이었다. 물 추출은 시료에 중량대비 10배의 증류수를 가하 고 80℃ 수욕상에서 환류냉각하면서 3시간씩 2회 반복추출하 고, No. 6 정량여과지(Advantec Co., Tokyo, Japan)를 이용 하여 감압 여과하는 과정을 거친 후 감압농축기(EYELA N- 1000, Riakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea)하여 시 료로 사용하였다.

70% 에탄올과 99.9% 메탄올 추출은 시료에 중량대비 10배 의 용매를 가하고 교반추출(Jeio tech sk-71, Lab companion, Daejeon, Korea)하면서 16시간, 3시간 동안 2회 반복추출하고, No. 6 정량여과지(Advantec Co.)를 이용하여 감압 여과하였 다. 그 후에, 감압농축기를 사용하여 농축하였으며 동결건조 하여 시료로 사용하였다. 오미자의 각 용매별 추출 수율은 Table 1에 제시하였다.

총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Folin & Denis, 1912)에 따라 오미자 추출물 10 μL에 Folin reagent 10 μL 및 2% Na₂CO₃ 200 μL을 가하고 혼합한 다음 실온에서 30분간 정치시 킨 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma Co., St. Louis, USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출 하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 제시하였다.

DPPH 라디칼 소거능

각 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능은 Blois (Blois, 1958)의 방법을 변형하여 실험하였다. 농도별 시료 40 μl에 1.5 × 10⁻⁴M DPPH (Sigma Co.) 용 액 160 μL을 가하여 잘 혼합하고, 암소에서 30분간 방치 후 518 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가하 지 않은 대조군과 비교하여 라디칼의 제거활성으로 나타냈으 며 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 제시하였다.

ABTS 양이온 소거능

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)(Sigma Co.)와 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼 합하여 암소에 두면 ABTS 양이온이 생성되는데 추출물의 항 산화물질과 반응하여 양이온이 소거됨으로써 특유의 청록색이 탈색되며 이의 흡광도를 측정하여 항산화 능력을 측정할 수 있다(Re et al., 1999). 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM 과황 산칼륨을 혼합하여 암소에서 약 15시간 반응시킨 후 734 nm에 서 흡광도가 1.5가 되도록 희석하였다. 희석한 용액 300 μL에 농도별로 조제한 시료 20 μL를 첨가하여 잘 혼합하고 실온에 30분간 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 얻어내고, 결과 값은 시료를 첨 가하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼의 제거활성으로 나 타냈으며 양성대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다. ABTS의 탈색정도를 통해 라디칼의 제거활성을 알아낼 수 있다.

SOD 유사활성

Superoxide dismutase(SOD) 유사활성은 중성이나 알칼리 상 태에서 pyrogallol이 superoxide에 의해 자동산화되면서 갈색물 질이 생성되는 원리를 이용하여 pyrogallol의 자동산화를 억제 시키는 효과를 측정하였다(Marklund & Marklund, 1974). 시 료 20 μL에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer (50 mM tris + 10 mM EDTA, pH 8.5) 300 μL와 7.2 mM pyrogallol 20 μL를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1N HCl 10 μL 를 가하여 반응을 정지시켰다. 420 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군과 비교하여 저해활성으로 나타내었다. 양성 대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였으며 실험은 3회 반복 수행하여 평균값으로 제시하였다.

항균 활성

항균 활성 실험에 사용한 세균은 Gram 음성세균 2종, Escherichia coli (Korean Collection for Type Culture (KCTC) 1682, Daejeon, Korea)와 Salmonella typhimurium (KCTC 2515), Gram 양성세균 1종 Staphylococcus aureus (KCTC 3881)으로 총 3종이었고, 배지는 Brain Heart Infusion (BHI) broth (BD, Sparks, USA)를 사용하였다. 항균 활성 측정을 위해 각각의 균주를 broth 배지에 접종하고 37℃에서 18시간 전 배양하여 사용하였다. 전 배양시킨 균주를 600 nm에서 흡 광도가 0.5가 되도록 희석하고 이것을 배지에 1% 접종하였으 며, 오미자 추출물은 10 mg/mL로 처리하였다. 균주의 생육 저 해 곡선은 37℃에서 11시간 동안 배양하면서 cell density meter(Ultrospec 10, Biochrom Ltd., UK)로 측정하였다.

세포배양

실험에서 사용된 세포는 RAW 264.7 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)이었다. 실험에 사용한 배지는 10% fetal bovine serum (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 penicillin-streptomycin solution (100 units/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin)( Hyclone Laboratories, Inc., South Logan, UT)이 포함된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY)이었고, 37℃, 5% CO₂ 에서 배양되었다.

Nitric Oxide(NO) 측정

Raw 264.7 cell을 96well plate에 2 × 10⁵개/mL의 수로 200 μL씩 분주하여 24시간 배양한 후에 농도별 시료와 LPS (200 ng/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. NO의 생성 정도 는 Griess 분석 방법을 이용하여 측정하는데, 즉 96 well plate에 세포 배양 상등액과 Griess reagent를 1 : 1로 혼합하여 넣고 실온에서 20분 동안 반응 시킨 후 microplate reader (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 NaNO₂를 사용하 여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 NO 함량을 산출하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 제시하였다.

통계처리

실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었 고, 처리간의 차이는 ANOVA를 실시한 후 사후검정으로 Duncan’s multiple range test에 의하여 p<0.05 수준에서 유의 성을 검정하였다.

결과 및 고찰

추출물별 수율 및 총 폴리페놀 함량

오미자 추출물의 수율은 Table 1에 제시하였다. 물 추출물 의 수율은 17.7%이었고, 에탄올과 메탄올의 추출 수율은 각 각 32.9%, 36.6%으로 물보다 유기용매 추출에 의해서 수율 이 증가하였다. 총 폴리페놀 함량의 경우, 메탄올 추출물이 16.3 mg/g TAE으로 가장 높게 나타났고, 에탄올 추출물의 함량이 15.7 mg/g TAE으로 물 추출물(9.2 mg/g TAE)과 유 기용매 추출물 사이의 유의적인 차이가 있었다. Kim et al. (2009)이 물 추출보다 60% 에탄올로 추출하였을 때 폴리페놀 함량이 더 높다고 보고한 것과, Kwon & Park (2008)이 마 찬가지로 오미자의 70% 에탄올 추출물에서 물 추출물보다 폴 리페놀 함량이 증가했다고 보고한 것과 일치하는 경향이다. 식이 폴리페놀은 사람에게 있어서 중요한 항산화제 급원으로 항노화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있어(Graf et al., 2005), 오미자로부터 유용성분의 추출을 통 한 건강기능성 증진을 위해서는 유기용매 추출이 효율적인 것 으로 나타났다.

DPPH 및 ABTS·+ 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거능은 짙은 자색의 안정한 자유 라디칼인 DPPH가 항산화 물질에 의해 환원되면서 탈색되는 원리를 이 용하여 측정하는 방법으로 측정 방법이 비교적 간단하여 항산 화 물질의 항산화능 측정에 유용하다(Blois, 1958). ABTS 양 이온 소거 활성은 DPPH assay와 마찬가지로 인위적인 라디 칼을 제거하는 작용 기작이 공통적이며, DPPH 라디칼 제거능 과 유의적인 상관성을 보이는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2011).

오미자 추출물별 DPPH와 ABTS^·+ 라디칼 소거능을 측정한 결과를 Table 2에 제시하였다. DPPH 라디칼을 50% 저해하 는 농도인 IC₅₀이 물, 에탄올, 메탄올 추출물의 경우 각각 992.4, 399.7, 400.8 μg/mL으로 나타났고, ABTS 양이온 소거 능의 IC₅₀은 691.0, 432.8, 386.0 μg/mL 이었다. 이와 같이 오미자의 라디칼 소거능이 물 추출물보다 유기용매 추출물에 서 그 활성이 유의적으로 증가한 것은 유기용매 추출에 의해 서 폴리페놀 함량이 증가한 것과 일치하는 경향이다. Lee et al.(2011)의 보고를 비롯한 다수의 연구에서 폴리페놀 함량과 라디칼 소거능 사이에는 유의한 양의 상관관계가 존재하기 때 문에 유기용매 추출에 의한 오미자의 폴리페놀 함량의 증가 는 라디칼 소거능 증진에 바람직한 것으로 보인다. 한편 Jung et al.(2000)은 오미자 종자의 메탄올 추출물의 RC₅₀ (반응 한 시간 후 DPPH 라디칼이 50% 감소되는데 필요한 농도)이 33.2 μg/mL인 것으로 보고하여, 오미자 열매 전체 를 시료로 사용한 본 연구의 결과보다 라디칼 소거능이 우수 하였다.

SOD 유사 활성

SOD는 체내 산화적 손상을 야기할 수 있는 활성산소를 산 소로 전환시키는 효소로, SOD 유사 활성이란 SOD와 같이 활성산소의 반응성을 억제하여 생체를 산화적 손상으로부터 보호할 수 있는 것을 의미한다(Han & Kim, 1994). 주로 phytochemical의 저분자 물질이 SOD 유사 물질로써 산채류, 한약재 등에서 그 활성이 평가되었다(Park, 2002; Lee et al., 2011). 10 mg/mL의 농도로 SOD 활성의 측정값을 알 아본 결과(Fig. 1), 메탄올 추출물(65.9%) > 에탄올 추출물 (63.0%) > 물 추출물(49.2%)의 순으로 활성이 좋은 것으로 나 타나, 물 추출물보다 유기용매 추출물에서 SOD 유사 활성이 유의하게 28, 34% 증가하였다.

항균 활성도

오미자 3가지 추출물의 병원균 3종(E. coli, St. aureus, S. typhimurium)에 대한 항균 활성도를 측정한 결과는 Fig. 2에 제시하였다. E. coli 에 대한 오미자의 생육 저해 활성은 물, 에탄올, 메탄올 추출물 순으로 각각 38.9, 70.0, 73.9% 이었 다. St. aureus 에 대해서는 물, 에탄올, 메탄올 추출물 순으로 그 생육 저해 활성이 각각 58.4, 80.3, 77.5% 이었으며 S. typhimurium에 대해서는 각각 64.5, 83.6, 85.6% 저해하였다. 이것은 오미자 물 추출물에서도 항균 활성이 우수하나 유기용 매 추출에 의해서 항균 활성이 유의적으로 증가한 것을 보여 주었다. 또한 그람 음성균(E. coli, S. typhimurium)과 그람 양 성균(St. aureus) 모두에 대해 항균활성을 나타냈다. 오미자에 는 다량의 유기산이 존재하여 유기산에 의한 pH의 저하로 미 생물의 생육이 억제되는 것으로 알려져 있다(Park et al., 1992). 그러나 유기산 이외에 Lee et al.(2003)은 오미자로부 터 정유성분을 추출하여 항균활성을 측정하였고 Lee et al.(2001)도 오미자로부터 정유성분과 gomisin C로 추정되는 리그난 계통의 화합물을 분리하였다. 본 연구 결과로부터 오 미자를 유기용매로 추출함으로써 유기산 이외에 다른 항균 활 성 보유 성분의 추출이 증진된 것으로 사료된다.

NO 생성 저해능

LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 용매별 오미자 추출 물의 NO 생성에 대한 저해능을 Fig. 3에 제시하였다. 대조군 에 비해서 에탄올 추출물과 메탄올 추출물은 NO 생성을 각각 27.8%, 26.5% 저해시킨 반면 물 추출물은 35.7% 저해시켜 유기용매보다 물 추출물에서 NO 생성 저해능이 유의적으로 증가하였다. Oh et al. (2010)은 오미자의 주요 리그난 성분인 gomisin J, gomisin N, schisandrin C의 항염증 효과를 보고 하였다. 또한 오미자 물 추출물이 RBL2H3 세포에서 알러지 관련 사이토카인의 생성을 억제시켰음도 보고되어 있다(Chung et al., 2012).

적 요

본 연구에서는 오미자 추출물이 보유하고 있는 것으로 알려 진 항산화, 항균, 항염증 활성의 용매별 추출에 따른 변화를 구명하고 관련 기초자료를 제공하고자 하였다. 오미자를 물과 70% 에탄올, 99.9% 메탄올로 추출한 후, 폴리페놀 함량, 라디 칼 소거능, SOD 유사활성, 항균활성, NO 생성 저해능을 평 가하였다. 그 결과, 오미자 물 추출물의 폴리페놀 함량은 9.2 mg/g이었고 에탄올과 메탄올 추출에 의해서 각각 70.7%, 77.2% 증가하였다. DPPH 라디칼 소거능은 에탄올 추출물에 서 IC₅₀이 399.7 μg/mL으로 항산화능이 가장 높았고, 메탄올 추출물(400.8 μg/mL), 물 추출물(992.4 μg/mL)의 순으로 나타 났다. 이를 통해, 물 추출물보다 유기용매 추출물의 폴리페놀 함량이 높음에 따라 소거활성이 증가하여, 폴리페놀 함량과 라 디칼 소거활성은 연관성이 있음을 확인하였다. 병원균 3종 E. coli, S. typhimurium, St. aureus에 대한 항균 활성은 물 추출 물의 경우 38.9~64.5%인 반면 유기용매 추출물에서는 70.0 ~ 85.6%로 증가하였다. 반면에 NO 생성에 대해서는 물 추출물이 대조군에 비해 35.7% 저해시켰으나 에탄올과 메탄 올 추출에 의해서 각각 22.1%, 25.7% 감소하였다. 결론적으로 오미자의 유기용매(에탄올, 메탄올) 추출물은 물 추출물에 비 하여 라디칼 소거능과 SOD 유사 활성, 항균 활성이 우수하였 다. 반면에 항염증능은 유기용매 추출물에 비해 물 추출물이 우수한 활성을 보였다. 본 실험결과는 오미자 추출물을 건강 기능식품 개발 소재나 가공식품으로 활용할 때 주요 대상으로 하는 건강기능성을 증진시키는데 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.