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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.26 No.1 pp.41-47
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2014.26.1.41

Development of a Novel Sap Extraction Buffer for Simultaneous Detection of Pepper Viruses using VC/RT-PCR

Ju-Yeon Yoon, Gug-Seoun Choi*, In-Sook Cho*, Seung-Kook Choi*
Department of Horticulture and Land Scape, Seoul Women’s Univ., Seoul, 139-774, Korea
*Virology Unit, Department of Horticultural Environment, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Suwon, 441-440, Korea
Corresponding Author : (Phone) +82-31-290-6236 viroid73@gmail.com
August 12, 2013 December 18, 2013 December 18, 2013

Abstract


고추바이러스들의 동시 검출을 위한 새로운 즙액 추출 용액의 개발

윤 주연, 최 국선*, 조 인숙*, 최 승국*
서울여자대학교 원예생명조경학과
*농촌진흥청 국립원예특작과학원 원예특작환경과

초록

Virion-captured reverse transcription polymerase chain reaction (VC/RT-PCR) is able to detect plant viruses without extraction of total nucleic acids from infected plant species. Novel extraction buffers were developed and optimized for the efficient diagnosis of pepper-infecting viruses using VC/ RT-PCR analysis. The most optimal extraction buffer to detect Tomato spotted wilt virus (TSWV), Pepper mild mottle virus (PMMoV), and Pepper mottle virus (PepMoV) was 1M Tris (pH8.0) buffer containing 0.5% sodium sulfate. The three viruses in the optimal buffer could be detected from tobacco (Nicotiana rustica) until 7 post-extraction, showing no significant difference in detection sensitivity of viruses. Meanwhile, the three pepper-infecting viruses in the optimized buffer could be detected from pepper plants until 2 post-extraction, showing significant decrease in detection sensitivity. Single infection of TSWV, PMMoV, or PepMoV and mixed infection of PMMoV and PepMoV were simultaneously detected from pepper plants collected from domestic farms using the combination of the optimal buffer and VC/RTPCR.


    Rural Development Administration

    세계적으로

    약 60여종의 바이러스들이 고추에 발생하는 것 으로 알려져 있으며 (Kim and Choi, 2002), 우리나라에서는 고추에 경제적 피해를 일으키는 바이러스들로는 10종이 보고 되었다. 이들 고추 바이러스들 중에서 담배연녹모자이크바이러 스 (Tobacco mild green moaic virus: TMGMV)와 토마토반 점위조바이러스 (Tomato spotted wilt virus: TSWV)는 지역 적으로 발생하고 있고, 알팔파모자이크바이러스 (Alfalfa mosaic virus: AMV), 감자Y바이러스 (Potato virus Y: PVY), 담배모 자이크바이러스 (Tobacco mosaic virus : TMV)와 고추엽맥퇴 록바이러스 (Pepper vein chlorosis virus)들은 최근에는 발생되 지 않는 바이러스 (Kim et al., 1990)이며, 그 외 4종류 바이 러스인 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus: CMV), 잠두위조바이러스2 (Broad bean wilt virus 2: BBWV 2), 고추연한모틀바이러스 (Pepper mild mottle virus: PMMoV), 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus: PepMoV)가 전국적으 로 지속적으로 발생하여 농가에 피해를 주고 있다 (Choi et al., 2005; Kim et al., 2012).

    바이러스들에 감염된 고추에서 발견되는 대표적인 병징은 모 자이크이며, 황화, 위축, 괴사, 엽맥녹대, 잎말림, 갈변, 과실 기 형이 나타나며, 병징이 심해지면 세입화하고 식물체가 위축되 어 결국 괴사된다. CMV, BBWV 2, PMMoV, PepMoV 및 TSWV의 효과적인 방제를 위해서는 고추 식물체와 바이러스 보독 매개충을 신속 정밀하게 진단하는 기술을 개발하여 병 발 생 예찰에 이용하는 것이 중요하다. 현재까지 고추 바이러스들 진단에 가장 정확하고 유용하게 사용되는 방법은 Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 방법과 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 방법이다. ELISA 방법은 시중에서 진단키트 구입이 용이하지만, 진단 감 도가 균일한 항혈청을 이용하기가 어려우며, 항혈청을 지속적 으로 생산하여야 하는 단점이 있으나 대량 진단이 가능하며 기술숙련도가 요구되지 않으며, 비용이 상대적으로 저렴하다 는 장점이 있다 (Hull, 2002). 이러한 ELISA 진단법과 비교 할 때 RT-PCR 진단법은 CMV, BBWV 2, PepMoV, PMMoV 를 동시에 정밀 진단할 수 있어 매우 유용하며 (Cho et al., 2006) 우리나라에 발생하는 고추 바이러스 2종인 CMV, BBWV 2를 동시에 진단할 수 있어 진단 감도의 증대 및 진 단시간을 절약할 수 있어 유용하다. 그러나, 5가지 바이러스들 을 동시에 진단할 수 있는 프라이머들 및 RT-PCR 조건들은 아직 개발되지 못하였다. 고추 바이러스의 유전자 진단법은 동 시에 진단할 수 있는 기술이 개발되어 시판되고 있어 감염된 고추 식물체나 진딧물 등 매개충으로부터 바이러스를 진단하 는데 이용이 가능하다.

    그러나 일반적으로, 고추 바이러스들이 감염된 기주 식물 및 보독 매개충에서 바이러스 유전자 진단을 하기 위해서 사용하 는 RT-PCR 키트들은 기주 식물 및 매개충에서 복잡한 RNA 분리 및 정제하는 과정이 필요하다. 또한, RT-PCR에 의한 방 법의 단점 중에 하나는 진단 시료수가 많아지면 진단비용과 소요시간, 기술 숙련도 및 별도의 장비들이 많이 필요하다. 최 근에는 일반적 유전자 진단법의 단점을 극복하기 위하여 간단 하고 빠르게 식물바이러스 진단기술에 대한 연구가 이루어져 왔다 (Li & Mock, 2005; Osman & Rowhani, 2005). RTPCR 진단법을 빠르고 간편하게 개발하려면 진단과정을 크게 줄이는 기술이 필요하며, 특히 RT-PCR 진단 과정 중 시간, 노동력, 비용이 많이 소요되는 핵산 분리과정을 시료로부터 특 별한 분리키트나 시간의 투자 없이 핵산을 간단히 분리하여 진단할 수 있다면 빠르고 간편하게 다량의 시료를 PCR로 진 단할 수 있는 유전자 진단기술이 개발될 수 있는 것이다.

    이러한 방법들 중 하나로써, 면역학적 방법을 겸한 IC/RTPCR (Immuno-captured/RT-PCR)은 바이러스 핵산을 따로 분 리할 필요가 없으므로 전체 핵산(total RNA)을 이용한 보통의 고추 바이러스 RT-PCR 진단법에 비해 진단비용을 크게 절감 할 수 있으며, 진단의 정확도를 한층 높임으로서 식물바이러 스 진단에 큰 역할을 하였다 (Nolasco et al., 1993). 그러나 IC/RT-PCR방법은 항체가 반드시 필요하며 항체 처리와 오랜 반응시간이 필요하다는 단점이 있다. 이러한 모든 단점을 극 복하기 위해 항체가 필요 없고 간단하며 빠르게 식물로부터 핵산을 추출할 수 있는 다양한 방법이 개발되었으나 (Suehiro et al., 2005), 고추 바이러스들의 RT-PCR 진단에 활용되고 있지는 않다. 국내에서는 TSWV에 대하여 바이러스 특별한 핵산 분리 과정 없이 간편하고 정확하게 바이러스를 진단하는 virion-captured RT-PCR (VC/RT-PCR) 방법이 개발되었다 (Cho et al., 2006). 그러나 TSWV는 담배종들 (Nicotiana spp.) 에서는 바이러스 입자들 뿐만 아니라 핵산 추출하는 과 정에서는 핵산 분쇄 등이 적으나, 고추에서는 핵산 추출 과정 중 바이러스 RNA들의 분쇄가 빈번하여 새로운 방법으로 TSWV 핵산 추출 방법이 필요하다 (Cho et al., 2006). 또한 DNA 바이러스인 토마토황화잎말림바이러스 (Tomato yellow leaf curl virus: TYLCV)를 검정할 수 있는 VC/PCR 방법이 보고되었다 (Choi et al., 2008). 한편, 여러 종류의 바이러스 진단 프라이머를 조합하여 한번에 여러 바이러스를 동시에 진 단하는 방법들이 개발되었으며 (Sharman et al., 2000) 우리나 라 박과 작물에 가장 피해를 일으키는 종자전염 바이러스 3종 을 동시에 진단할 수 있는 VC/RT-PCR유전자 진단기술을 개 발하여 이용하고 있다 (Cho et al., 2007).

    본 연구는 고추 바이러스들 감염 조사 및 매개충의 바이러 스 보독율 조사를 전국적으로 실시하면서 간편한 진단법의 개 발이 시급함에 따라 개발하게 되었으며, 별도의 핵산 분리 없 이 고추 바이러스들을 안정적으로 RT-PCR 검출하기 위한 새 로운 즙액 추출 용액을 개발하여, TSWV, PMMoV 및 PepMoV 다중 진단법인 VC/RT-PCR 유전자 진단법을 보고하 고자 한다.

    재료 및 방법

    즙액 추출 완충액 조성 및 시료 준비

    일반적으로 ELISA와 IC/RT-PCR 진단에서 사용하는 인산액 추출 완충용액 [10mM phosphate buffer (pH 7.0) + 0.5% (w/v) sodium sulfate]를 기본으로 하여, 각 기본 완충용액으로서 농 도가 각각 다른 Tris 추출 용액을 제조하였다(Table 1). 여기 에 분자량이 각각 다른 비이온 계면활성제인 Polyethylene Glycol (PEG)를 각각 5% (w/v)으로 첨가하여 즙액 추출 완 충액을 제조하였다. PMMoV, PepMoV 및 TSWV가 각각 감 염된 담배 (Nicotiana rustica) 및 고추 (청양 품종)으로부터 잎 조직 0.2 g을 미니 막대분쇄기를 이용하여 1.5 mL 폴리프 로필렌 튜브에서 다양하게 조합으로 각각 제조된 즙액 추출 완충액 600 μL을 넣어 마쇄시켰다. 마쇄 즙액은 또한 48시간 동안 실온에서 방치하여 즙액 안정성 및 바이러스들의 존재 여부를 확인하였다.

    바이러스 진단 프라이머들 및 VC/RT-PCR 조건

    TSWV 진단에 사용된 프라이머들은 777 bp를 증폭할 수 있 는 TSWV-NCP-For (5'-ATGTCTAAGGTTAAGCTCAC-3') 및 TSWV-NCP-Rev (5'-TCAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3') 그리 고 PMMoV 진단에 사용된 프라이머들은 412 bp를 증폭할 수 있는 PMMoV-CP-For (5'-TTGCGCAAAAGAAAAAGGTA ATA-3') 및 PMMoV-CP-Rev (5'-CTAGAAGCGGGGAAGTA AGT-3')를 이용하였다. PepMoV 진단을 위하여 327 bp를 증 폭할 수 있는 PMMoV-NIb-For (5'-GCGACCGGCATTTGA GGAAG-3') 및 PMMoV-NIb-Rev (5'-CAATTGGGGCTGCTGT GAAAGTC-3')를 이용하였다. VC/RT-PCR에 이용될 시료 준비 를 위하여 PMMoV, PepMoV 및 TSWV가 각각 감염된 담 배 및 고추로부터 잎 조직 0.2 g을 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 에서 다양하게 조합으로 각각 제조된 즙액 추출 완충액 600 μL 을 넣어 마쇄시킨 후 바이러스 특이적 항체를 첨가 후 얼음에 서 10분동안 방치하였다. 동일한 즙액 추출물로 2회 세척 후 멸균된 3차증류수로 20 μL를 첨가하여 현탁하였다. 바이러스 가 함유된 용액 1μL, AccessQuick™ RT-PCR 키트 (Promega, USA)에서 제공된 2X RT-PCR master mixture 10 μL, 각 프라이머들 (10 pmole) 1 μL, AMV reverse transcriptase (200U/μL) 1 μL 를 넣고 3차 증류수를 6 μL를 첨 가하여 최종 부피를 20 μL로 하여 RT-PCR 반응을 시켰다. RT-PCR 조건은 48°C, 30분 → 94°C, 5분 → (94°C, 20초, 55°C, 30초, 72°C, 1분), 35회 → 72°C, 5분 → 4°, 5분이었다. 증폭된 RT-PCR 산물들은 1.2 % agarose gel 에서 110V 전 압으로 40분간 전기영동 후 ethidium bromide 용액에 담근 후 증류수로 5회 세척 후 자외선을 쬐어 관찰하였다 (Choi et al., 2011).

    결과 및 고찰

    최적의 즙액 추출 용액 조성의 결정

    TSWV는 외피 단백질 외에 envelop이라고 불리는 지질단백 질막으로 구성되어 있어 순화 및 식물 즙액에서 추출 시에 불 안정한 것으로 보고되었으며 (Best, 1968; Sherman et al., 2003). 고추는 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드들 및 다양한 폴리페놀들 및 항산화제들을 포함하고 있어 고추가 마쇄 되었 을 때 즙액 내 TSWV들을 비롯한 PMMoV 및 PepMoV 입 자 및 핵산의 안정성을 크게 저해시키는 것으로 알려져 있다 (Jeong et al., 2011). 따라서 고추 바이러스들을 안정적으로 진단하기 위하여 새로운 즙액 추출 용액을 Table 1과 같이 조 성하였다. Tris 완충액은 1차 아민기를 가지고 있지만, DNA 및 RNA들을 이용한 생화학적 반응에 대해 안정적이고 Mg2+ 등의 양이온들에 의해서 침전이 일어나지 않는 특성 때문에 본 연구의 실험구로 사용되었다. 기존의 IC/RT-PCR 혹은 핵 산 추출 후 RT-PCR에 사용되는 인산 완충액 (1a ~ 1h)을 대 조구로 사용하였다 (Table 1). 비이온 계면활성제인 PEG 화합 물은 고추 등 식물들에서 핵산 추출의 방해 요소인 많은 산화 효소들 및 식물막의 지질 성분들과 결합하여 추출 효율을 높 일 수 있다. 또한 PEG 화합물은 식물 phenol류 성분들과 결 합하여 독성을 중화시키는 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. TSWV가 감염된 고추 및 담배에서 마쇄한 즙액의 갈변 정도를 기준으로 하여 색깔 변화를 측정하였을 때, 모든 추출 용액에서 상온에 마쇄 후 방치하여도 갈변되지 않았다. 따라 서 담배에서 TSWV를 진단할 경우, 명기된 모든 조합의 완충 액들의 종류와 관계없이 안정적으로 RT-PCR에 사용이 가능 하다(Fig. 1). 그러나, 고추 즙액들의 마쇄 및 상온 방치 후 색깔 변화를 측정한 결과 1a, 1d, 1g, 1h 샘플들에서는 심한 갈변 현상이 관찰되었으며, 2f 및 2g에서는 적은 갈변 현상이 관찰되었다. 그러나, 2a 완충액 [1M Tris (pH8.0) 및 0.5% sodium sulfate]로 마쇄 후 상온 방치한 고추 즙액에서 갈변 현상이 관찰되지 않아, 고추 추출 용액으로 가장 좋은 효과가 좋았다 200 (Fig. 1). 또한 2b, 2c, 2d, 3b, 3d, 4c, 4d, 및 4e에서도 즙액 추출 후 갈변 현상이 일어났으나, 1a 등에서 관찰된 고추 갈변 현상에 비해 심하지 않았다. PMMoV 및 PepMoV 가 감염된 고추 잎들을 이용한 최적 즙액 완충액을 이용한 실험에서도 위에서 기술된 유사한 결과들이 도출되 었다.

    즙액 추출 용액 내에서의 바이러스들의 안정성 조사

    즙액 추출 용액에서의 TSWV, PMMoV, PepMoV들의 입자 및 핵산 분쇄 억제의 안정성을 측정하기 위하여, 위에서 기 술된 각 바이러스들이 감염된 고추 및 담배 식물체들의 잎을 동일한 방법으로 각각 다른 즙액 추출 완충액들로 추출 후 2, 4, 7일까지 실온에서 방치 한 후 VC/RT-PCR을 수행하여 바 이러스의 안정성을 분석하였다. 담배에서는 2, 4, 7일까지 실 온에서 방치된 즙액 완충액들에서 모두 안정적으로 TSWV, PMMoV 및 PepMoV가 검출이 되었으며, 이는 마쇄 직후 수 행된 VC/RT-PCR의 결과와 RT-PCR 산물의 증폭 정도가 유 사하였다 (Fig. 2). 이런 연구 결과는 담배에서는 본 연구에서 사용된 즙액 완충액들이 바이러스들의 입자 및 핵산의 분쇄를 억제시키는 안정화 역할을 수행하는 것을 의미하며, 이는 앞 서 기술한 갈변 현상 연구 결과들과 유사하였다(Fig. 1). 각각 다른 즙액 추출 완충액들로 추출 후 2, 4, 7일까지 실온에서 방치 한 고추 샘플들에서는 마쇄 후 4, 7일까지 방치된 샘플 들 모두에서는 TSWV, PMMoV, PepMoV 들이 검출이 되지 않았으나, 2일 후 방치된 샘플들에서는 대부분 TSWV, PMMoV, PepMoV들의 검출이 일부 되었으나 많은 샘플들에 서 검출 감도가 급격히 낮아진 것 나타났다 (Fig 3). 그러나 2a 샘플에서는 2일까지 3가지 바이러스들의 입자들 및 핵산 분쇄 억제 효과를 보여, VC/RT-PCR용 고추 즙액 완충액으로 서 가장 큰 효과가 있는 것으로 판명되었으며, 이의 결과는 갈변 현상의 연구 결과와 유사하다(Fig. 1과 Fig. 3). 위의 2a 고추 즙액 추출용액 및 Table 1에 표기된 즙액 추출용액을 이 용한 VC/RT-PCR 결과는 3회의 반복적인 실험들에서 동일하 게 관찰되었으며, 특히 반복된 실험들 모두에서 2a 즙액 추출 용액에서 가장 좋은 효과가 관찰되었다. 고추 잎 조직들을 이 용하여 바이러스들을 진단을 할 경우에는 갈변 현상이 나타나 지 않는 완충액을 이용하여야 하며, 갈변화 억제시킬 수 있는 방안은 고추에서 바이러스 RNA 추출 및 진단에서 중요한 요 인임을 의미한다.

    고추 바이러스들의 VC/RT-PCR 다중 진단

    최적의 즙액 완충액으로 선발된 2a 완충액을 이용하여 [1M Tris (pH8.0) 및 0.5% sodium sulfate], 농가들에서 수집된 고 추에서 TSWV, PMMoV, PepMoV의 단독 및 복합 감염된 고추 여부를 판별하기 위하여 고추 잎 조직들을 마쇄 후 3종 의 바이러스들을 검출 할 수 있는 6개 프라이머들을 한 개의 튜브에 넣은 후 VC/RT-PCR 다중 진단을 수행하였다. 프라이 머들의 간섭을 최소화 하기 위하여, 267bp RT-PCR 산물을 합성할 수 있는 TSWV 다중 진단용 프라이머 세트 [TSWV267-Forward (5'-ATGTTAACTCTTTTCGGTAA-3') 및 TSWV267-Rev (5'-CTATATTTCATCAAAGGATA-3')]를 제작 하여 다중 진단에 사용하였다. 2a 완충액과 고추 바이러스 특 이적 프라이머 세트를 이용한 진단 결과 TSWV, PepMoV, PepMoV의 단독 감염이 대부분이었으며, PMMoV와 PepMoV 들의 복합 감염도 확인이 되었다(Fig. 4). 그러나, TSWV+ PMMoV, TSWV + PepMoV의 복합 감염은 우리가 조사한 고 추 시료들에서는 검출이 안되었다. 본 연구 결과를 종합해보 면 즙액 완충액과 다중 VC/RT-PCR을 이용하여 고추에서 발 생하는 TSWV, PMMoV 및 PepMoV를 단독 및 복합 감염 을 간편하게 진단할 수 있는 방법으로 사료된다. 다중 바이러 스 진단에서 가장 중요한 요인은 프라이머들 사이의 간섭 효 과들이라고 알려져 있으며, 어떠한 식물 혹은 작물을 대상으 로 바이러스병 진단을 실시하는 가에 의해서 진단의 감도가 달라진다 (Zheng & Yang, 2002). 특히 polyphenol들 및 다 당류들이 많이 함유하고 있는 고추 및 고구마 등에서 바이러 스들을 진단할 경우에 핵산 분리가 매우 어려워 오류를 범할 가능성이 높은 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서 개발된 즙 액 완충액을 이용할 경우 바이러스들의 입자들 및 핵산을 안 정적으로 검출 할 수 있을 것으로 기대된다. 최근에 가장 일 반적으로 빠르게 보편적으로 식물바이러스들을 진단하는 분자 생물학적 방법 중 하나는 RT-PCR이며, 이는 보편적으로 RNA 혹은 DNA를 추출하여 정제하는 과정이 필수적이므로 시간 소요 및 경제적 비용이 발생한다 (Li & Mock, 2005; Osman & Rowhani, 2005). 이를 극복하기 위하여 바이러스 입자들을 감지하는 기술이 개발되었다 (James, 1999; Singh et al., 2005; Suehiro et al., 2005). 그러나 1개 작물에서 여 러 바이러스들을 동시 진단을 할 경우에는 프라이머 간섭 현 상 및 핵산의 점도 문제 등에 의해서 진단 효율에 큰 차이가 나타나는 것이 알려져 있다. 따라서, 진단 비용의 절감 및 프 라이머들의 간섭현상 억제에 의한 진단의 정확도를 높이는 대 안으로 VC/RT-PCR 방법이 개발되어 진단에 활용되고 있다 (Cho et al., 2006; Cho et al., 2008; Kim et al., 2010; Nolasco et al., 1993; Sharman et al., 2000). 본 연구에서 개발된 즙액 완충액을 이용할 경우 고추에 경제적 피해를 일 으키는 바이러스들의 입자들 및 핵산을 안정적으로 다중 진단 이 가능할 것으로 기대된다.

    적 요

    바이러스 입자를 감지하는 역전사 핵산 연쇄 증폭법 (VC/ RT-PCR)은 감염된 식물종들로부터 핵산 추출 없이 식물바이 러스들을 검출 할 수 있다. 본 연구는 VC/RT-PCR 분석법을 이용하여 고추를 감염시키는 바이러스들을 효과적으로 진단하 기 위하여 새로운 즙액 추출 완충액들이 제작하였다.

    토마토반점위조바이러스 (Tomato spotted wilt virus; TSWV), 고추약한모틀바이러스 (Pepper mild mottle virus; PMMoV) 및 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus; PepMoV) 진단을 위한 가장 최적화된 추출 완충액은 0.5% sodium sulfate를 포함하는 1.0M Tris (pH 8.0) buffer 였다.

    고추 바이러스들은 담배 즙액 추출 후 7일까지 검출이 되었 으며, 마쇄 직후와 검출 감도는 유의한 차이가 없었다. 반면에, 3가지 고추 바이러스들은 고추 즙액 추출 후 2일까지만 바이 러스들이 검출되었으며, 검출 감도는 크게 감소하였다.

    국내 고추 재배 농가들에서 수집한 고추 시료들에서 TSWV, PMMoV, PepMoV의 단독 감염 및 PMMoV와 PepMoV의 중복 감염을 선발된 최적 즙액 완충액과 VC/RT-PCR의 조합 을 이용하여 동시 진단이 가능하였다.

    Figure

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    Color change of crude sap extracts from leaf tissues of TSWV-infected pepper (‘cv. Cheong-Yang’) and tobacco (N. rustica) plants in different combinations of extraction buffers. Each sample is listed in Table 1. Approximately 0.2 g leaf tissues of TSWV-infected pepper and tobacco plants were squeezed using a micro-pestle in 1.5 mL-tube with 600 μL each extraction buffer to determine their suitability and stability for pepper-infecting viruses at room temperature.

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    VC/RT-PCR analyses from TSWV-infected tobacco plants (N. rustica) in different time after extraction using different extraction buffer. The crude saps were incubated at room temperature for 0 day and 7 days. RT-PCR products (777 bp) from each sample for the detection of TSWV were shown on the agarose gels. 100 bp DNA size markers were simultaneously run with each RT-PCR products.

    KSIA-26-41_F3.gif

    VC/RT-PCR analyses from TSWV-infected pepper plants (C. annuum cvs. Cheong-Yang) in different time after extraction using different extraction buffer. The crude saps were incubated at room temperature for 0 day and 2 days. RT-PCR products (777 bp) from each sample for the detection of TSWV were shown on the agarose gels. 100 bp DNA size markers were shown on both sides.

    KSIA-26-41_F4.gif

    Simultaneous diagnosis of viruses for pepper plants collected from farms using the optimized extraction buffer plus VC/RT-PCR. The expected sizes of RT-PCR products are as follows; TSWV (267 bp), PeMMoV (412bp), and PepMoV (327 bp). Detection of mixed viruses is indicated by a red box and the detection of each virus is shown on the top. 100bp DNA size marker is shown at the ends of the gel.

    Table

    Compositions of extraction buffers used for the detection of pepper viruses in this study.

    Reference

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