토마토(Solanum lycopersicum L.)는 남아메리카 서부 고원 지대가 원산지인 가지과(Solanaceae)의 일년생 작물로 우리나 라를 포함한 온대지방에서 재배되고 있다(농촌진흥청, 2007). 토마토는 다량의 carotenoids, phenols, flavonoids, tocopherol, vitamin C, E 등을 함유하여 항산화, 항염증, 항암 등의 생리 활성을 보이며 심혈관 질환 및 암 등의 만성 질환 예방 효과 가 보고되어 있다(Kotikova & Lachman, 2009; Martínez Valverde et al., 2002).

환경 및 생활 습관 변화로 인체 내 활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS) 발생이 증가하였으며 이들은 DNA 손 상, 세포 사멸, 노화, 암 등의 원인으로 작용 한다(Dubinina, 2001; Liu & Ng, 2000). 이러한 활성산소종은 다양한 형태의 항산화 물질을 섭취함으로 소거할 수 있으며 최근에는 합성 항 산화 물질이 아닌 천연 항산화 물질에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다 (Block & Langseth, 1994).

염증은 물리, 화학적 자극과 세균, 바이러스의 감염, 대사산 물 등의 외부 및 내부 자극에 의해 신체 조직이 손상되는 것 을 복구하기 위한 방어 기전이다 (Rodriguez-Vita & Lawrence, 2010; Laroux, 2004). 손상된 조직에 존재하는 대식세포(RAW 264.7 등)와 같은 다양한 면역세포가 lipopolysaccharide (LPS) 그람음성균의 외부 세포막을 구성하는 내독소 물질의 자극을 받아 nitric oxide (NO), prostaglandin E₂ (PGE₂) 등의 염증 매개 물질을 생성한다 (Adams & Hamilton, 1984). 염증 매 개 물질 중 하나인 nitric oxide (NO)는 염증 반응을 매개하여 감염 균이나 바이러스를 죽이거나 종양을 제거한다 (Nathan, 1997; Palmer et al.., 1987; Korhonen et al., 2005). 그러나 Nitric oxide (NO)가 과도하게 생성되면 림프구 증식을 억제하 여 정상세포에 손상을 유발하며 염증 질환을 유발한다 (Korhonen et al., 2005).

최근 토마토의 소비 형태의 변화와 건강 증진 효과가 밝혀 지면서 (de Sousa et al., 2008) 세계적으로 토마토 생산량이 증가하고 있는 실정이다. Knoblich et al. (2005)는 토마토 가 공 후 생기는 과피 및 종자 (pomace)에 항산화 물질이 풍부 하여 우리가 주로 섭취하는 과육을 제외한 다른 부위의 생리 활성 및 기능성 성분에 대한 가능성을 확인 하였으며, 실제 토마토, 가지, 고구마 잎이 과실에 비해 항산화 활성, phenol 화합물, flavonol 함량이 높다고 보고되었다 (Zornoza & Esteban, 1984; Truong et al., 2007; Jung et al., 2011; Munir et al., 2012). 또한 토마토 부산물을 가축의 먹이로 활 용하기 위한 영양학적 특성에 대한 연구도 보고되었다 (Ventura et al., 2009). 토마토 재배 시 발생되는 부산물의 활 용을 위해 생리 활성과 기능성 성분을 평가하여 활용 방안을 모색할 필요가 있으므로 본 연구는 토마토 잎 추출물의 항산 화 및 항염증 활성을 검정하여 기능성 소재로 활용 가능한 기 초 자료를 제공하기 위해 수행되었다.

재료 및 방법

실험 재료

본 실험에 사용된 50점의 토마토는 국립농업유전자원센터에 수집 보관중인 자원을 이용하였다(Table 1). 2014년 6월 20일 에 국립농업유전자원센터 시험장에서 잎 시료를 채취하여 40°C에서 4일간 온풍 건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 시료 7 g을 75% 에탄올을 용매로 하여 가속용매추출기(ASE-200, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)로 추출한 뒤 감압농축기 (Genevac, Stone Ridge, NY, USA)를 이용하여 완전히 농축한 후 4°C에 보관하고 활성 평가 실험에 이용하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성은 Lee & Lee (2004)의 방법을 수정하여 측정하였다. 96 well micro plate에 100 ul의 추출 물과 150 uM DPPH 용액 150 ul을 혼합하여 실온의 암실에 서 30분간 반응시킨 후 micro plate spectrophotometer (Bio- Teck, Epoch, US)로 517 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 전자공여능은 다음의 공식으로 계산하였다.

전자공여능(%) = 1–(a/b)*100

a: 추출물 첨가구

b: 추출물 무첨가구

추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 라디칼의 활성을 50% 로 저해하는 추출물의 농도를 의미하는 IC₅₀ (ug/ml)으로 나타 내었다.

ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS 라디칼 소거 활성은 Re et al. (1999)의 방법을 수정 하여 측정하였다. 7mM ABTS (Sigma Co. USA)와 2.45 mM potassium persulfate (Sigma Co. USA)을 만들어 두 용액을 1 : 1의 비율로 혼합한 후 냉장상태의 암실에서 12시간 동안 반응을 시키며 혼합 용액에 라디칼을 생성시켰다. 실험 직전 에 ABTS 라디칼 용액이 734 nm의 파장에서 0.7 ± 0.002의 흡 광도를 갖도록 증류수로 희석하여 10 ul의 추출물과 희석한 ABTS 라디칼 용액 190 ul을 혼합한 후 실온의 암실에서 6분 간 반응시켜 micro plate spectrophotometer (Bio-Teck, Epoch, US)로 734 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능 은 다음의 공식으로 계산하였다.

전자공여능(%) = 1 – (a/b)*100

a: 시료 첨가구

b: 시료 무첨가구

추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 라디칼의 활성을 50% 로 저해하는 추출물의 농도를 의미하는 IC₅₀ (ug/ml)으로 나타 내었다.

총 폴리페놀 함량

시료 추출액의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Waterhouse, 2002)을 수정하여 측정하였다. 96 well micro plate의 각 well에 100 ul의 시료 추출액과 50% Folin-ciocalteau reagent (2N) 100 ul를 넣고 실온에서 3분간 반응시킨 후, 2% Na₂CO₃ (Sigma Co. USA) 포화용액 100 ul를 넣고 30분간 반응시킨 다음 micro plate spectrophotometer (Bio-Teck, Epoch, US)로 720 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량 (mg GAE/g DW)은 gallic acid (Sigma Co. USA)를 이용하여 작성한 standard curve로부터 구하였다.

세포 배양

RAW 264.7 세포주 (Korean cell line bank, Korea)를 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함한 Dulbecco’s modified Eagle's medium (DMEM) 조건에서 5% CO₂의 습한 공기의 37°C를 유지하며 2 ~ 3일 마다 계대 배양하였다.

세포 독성 측정

세포의 생존에 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위해 RAW 264.7 세포주를 96 well micro plate에 10⁴~10⁵ cells/well 만큼 분주한 후 20, 50, 100 ug/ml의 추출물을 각각 처리하 였다. 이를 5% CO₂를 포함한 습한 공기에서 37°C를 유지하 며 24시간 동안 배양한 후 96 well micro plate 각 well의 기존 배지를 떠내고 다시 10 ul의 CCK-8 solution을 포함한 200 ul의 신선한 배지로 교체하여 (Dojindo, Japan) 1 ~ 4시간 추가 배양하였다. 배양된 세포의 독성은 micro plate spectrophotoreader (Bio-Teck, Epoch, US)로 450 nm의 파장에서 흡 광도를 측정하여 세포 생존율을 확인함으로써 평가되었다.

Nitric oxide (NO) 생성 저해 활성 검정

세포 독성 시험 결과 세포에 영향을 미치지 않았던 20, 50, 100 ug/ml의 추출물을 10⁴~ 10⁵ cells/well의 RAW 264.7 세 포주가 분주된 96 well micro plate에 처리한 후 다시 1 ug/ ml의 LPS (Sigma Co.)를 처리하여 5% CO₂를 포함한 습한 공기에서 37°C를 유지하며 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 얻은 배양액의 nitric oxide (NO) 저해 활성을 Nitric Oxide (NO) detection kit (iNtRON, USA)를 이용하여 micro plate spectrophotometer (Bio-Teck, Epoch, US)로 540 nm의 파장 에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

실험은 3 반복으로 수행되었으며 실험 결과 값에 대한 유의 적 차이의 유무를 알아보기 위해 SPSS Statistics 20 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA)로 Duncan's multiple range test을 수행하였다.

결과 및 고찰

토마토 잎 추출물의 항산화 활성

토마토 50 자원 잎 추출물을 이용한 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성, 총 폴리페놀 함량 및 NO 생성 저해 활성을 측정 하였다. 토마토 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 130.9 ~ 501.0 ug/ml의 분포로 평균은 246.3 ug/ml이었으며 50 자원 중 IT191046, IT189949, IT033117, IT191047, IT033130이 높은 활성을 보였다(Fig. 1A, Table 2). 각 자원의 ABTS 라 디칼 소거 활성은 1348.6 ~ 3789.3 ug/ml의 범위로 나타났으 며 평균은 2056.0 ug/ml로 나타났고 이들 중 IT189949, IT033117, IT191046이 가장 높은 활성을 보였다(Fig. 1B, Table 2). DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성 측정법은 항산화 물질에 대해 라디칼 소거 활성에 차이가 있으나 (Arnao, 2000), 측정법이 비교적 간단하고 짧은 시간 안에 측정이 가 능하며 결과의 재현성이 높아 여러 항산화 물질을 함유하는 추출물, 정유, 페놀화합물, 기능성 식품 등의 항산화 활성 측 정에 널리 사용되고 있다 (Singleton & Rossi, 1965).

토마토 50 자원의 총 폴리페놀 함량은 16.8 ~ 59.9 mg GAE/g DW의 분포를 보였으며 평균 30.6 mg GAE/g DW 이었다(Fig. 1C, Table 2). 이들 중 IT207214 (59.9mg GAE/g DW)이 가장 높은 함량을 보였으며 IT203262 (16.8 mg GAE/g DW)이 가장 낮았다. Piao et al. (2013)는 토마토 112 자원의 잎, 줄기 혼합 추출물의 총 폴리페놀 함량의 범위 가 6.1 ~ 38.9 mg GAE/g DW라고 보고 하였으며, Hanson et al. (2004)는 토마토 53 자원의 과실에 대한 phenolics의 범 위가 0.56 ~ 1.61 mg GAE/g DW라고 보고 하였다. 본 실험 에서는 앞선 두 연구 보다 높은 토마토 잎 추출물의 폴리페놀 함량을 확인하였다. 이는 토마토 잎에서 폴리페놀을 추출 활 용 가능성에 대해 재차 확인한 결과라 생각된다.

토마토 잎 추출물의 항염증 활성

토마토 잎 추출물의 nitric oxide (NO) 생성 저해 활성을 검정하기 위해 추출물이 RAW 264.7 세포주(Korean cell line bank, Seoul, Korea)에 미치는 독성 효과를 측정한 결과, 처리 한 추출물(20, 50, 100 ug/ml)의 농도가 증가할수록 세포 생 존율이 감소하였지만 추출물 처리 시 RAW 264.7 세포주가 80% 이상 생존하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 추출물 자체가 세포에 독성으로 작용하지 않아 세포가 생존 가능한 범위 안에서 추출물에 의한 NO 생성 저해 활성을 측정하는 것 이 가능함을 의미한다. 따라서 세포 독성 측정에서 처리하였던 세 가지 농도의 추출물로 NO 생성 저해활성을 측정하였다 (Table 2, Fig. 1D). 토마토 잎 추출물을 20, 50, 100 ug/ml의 농도로 처리한 경우, 각 농도의 NO 생성 저해율의 범위는 각 각 0 ~ 39.5%, 1.0 ~ 96.9%, 71.1 ~ 100%이었다. 또한 LPS 처리 후, 20 ug/ml 농도의 추출물을 처리한 군 (13.5%)에 비해 50 ug/ml의 추출물을 처리한 군(78.1%)의 nitric oxide (NO) 생성 저해율의 차이가 컸으며, 100 ug/ml의 추출물을 처리한 군은 98.8%로 높은 NO 생성 저해율을 보였다. 각 자원의 NO 생성 저해 활성(IC₅₀; ug/ml)을 비교한 결과, IT189945 (24.8 ug/ml), IT173906 (26.5 ug/ml), IT033117 (27.1 ug/ml), IT191046 (27.4 ug/ml)이 높은 NO 생성 저해율을 보였다. 인 체에 염증을 유발하는 대표적인 염증 매개 물질로 NO와 prostaglandin E₂ (PGE₂)가 있다. Amid & Jamal (2013)에 의하면 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포주에 100 ug/ml의 토 마토 잎 추출물을 처리한 결과, prostaglandin E₂ (PGE₂)의 생 성을 37.4% 저해한다고 보고하였다. 앞서 같은 농도(100 ug/ml) 의 토마토 추출물을 처리한 군의 NO 생성 저해율이 98.8%인 것으로 보아 토마토 잎 추출물은 같은 농도에서 prostaglandin E₂ (PGE₂)보다 nitric oxide (NO)의 생성을 더 효율적으로 억 제하는 것을 알 수 있었다.

상관 분석

토마토 잎 추출물의 생리 활성과 기능성 성분의 상관관계를 분석한 결과를 Table 3에 나타내었다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성이 높은 정의 상관관계(r = 0.677**, P < 0.05)를 보 였고, 총 폴리페놀 함량과 nitric oxide (NO) 생성 저해 활 성이 높은 상관관계 (r = –0.406**, P < 0.05)를 나타냈으나 나머지 활성간의 상관관계는 매우 낮거나 부의 상관관계를 보였다.

군집 분석

토마토 잎 추출물의 생리 활성 및 기능성 성분 분석 결과를 자원별로 군집 분석한 결과, Cluster I (n = 17), II (n = 4), III (n = 11), IV (n = 16)와 따로 분리된 두 자원(IT229651, IT211836)으로 분류되었으며(Fig. 2), 각 Cluster 들의 활성을 Table 4에 나타내었다. Cluster I, II, III, IV에 속하는 자원들 의 항산화 및 항염증 활성을 비교한 결과, Cluster IV의 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성이 각각 181.8, 1727.5 ug/ml 로 가장 높았고, 총 폴리페놀 함량은 Cluster 간의 유의적 차 이는 없었다. Nitric oxide (NO) 생성 저해 활성도는 Cluster II (31.0 ug/ml)가 가장 높았다. 토마토 50 자원 중 IT033117 과 IT191046은 DPPH, ABTS 라디칼 저해 활성 및 nitric oxide (NO) 생성 저해 활성이 높았으며 cluster IV내에서 매 우 가깝게 존재하였고, IT173906은 총 폴리페놀 함량과 nitric oxide (NO) 생성 저해 활성이 높았으며 Cluster II에 존재하 였다. 또한 이 세 자원들은 나머지 자원들에 비해 생리 활성 이 높아 이용 가치가 클 것으로 사료된다.

적 요

토마토 부산물의 활용 가능성을 확인하고자 토마토 50 자원 의 잎 추출물로 항산화 및 항염증 활성을 검정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성이 높았던 자원은 IT191046 (130.9 ug/ml), IT189949 (136.8 ug/ml), IT033117 (138.8 ug/ml), IT191047 (148.9 ug/ml), IT033130 (152.5 ug/ml)이었으며, ABTS 라디 칼 소거 활성이 높았던 자원은 IT189949 (1348.6 ug/ml), IT033117 (1404.9 ug/ml), IT191046 (1516.8 ug/ml)이었고 총 폴리페놀 함량은 IT207214 (59.9 mg GAE/g DW)가 가장 높 은 함량을 보였다. Nitric oxide (NO) 생성 저해 활성이 높았 던 자원은 IT189945 (24.8 ug/ml), IT173906 (26.5 ug/ml), IT033117 (27.1 ug/ml), IT191046 (27.4 ug/ml)이었다. DPPH 와 ABTS 라디칼 소거 활성이 높은 정의 상관관계(r = 0.677**) 를 보였고 다음으로 총 폴리페놀 함량과 NO 생성 저해 활성 이 높은 상관관계(r = –0.406**)를 나타냈다. 토마토 잎 추출물 의 생리 활성 및 기능성 성분 분석 결과를 자원별로 군집 분 석한 결과, Cluster I (n = 17), II (n = 4), III (n = 11), IV (n = 16)와 따로 분리된 두 자원(IT229651, IT211836)으로 분 류되었다. 토마토 50 자원 중 IT033117과 IT191046은 DPPH, ABTS 라디칼 저해 활성 및 nitric oxide (NO) 생성 저해 활 성이 높았으며 Cluster IV내에서 매우 가깝게 존재하였고, IT173906은 총 폴리페놀 함량과 nitric oxide (NO) 생성 저해 활성이 높았으며 Cluster II에 존재하였다. 이 연구 결과를 토 대로 토마토 잎의 기능성 소재로의 이용 가능성을 확인하였고 토마토 부산물의 다양한 활용 방안 수립에 도움이 될 것으로 사료 된다.